市販タンパク質によるアクチンベースの運動性の再構成

1. バッファーの調製 注:すべてのバッファーに超高純度のH2Oを使用してください。無菌である必要はありません。手順1.1〜1.4に記載されているすべての溶液を0.2 μmシリンジフィルターでろ過し、使用量に応じてチューブあたり500 μL〜2 mLの部分で分注し、-20°Cで保存します。 2 gのBSAを50 mLのコニカルチューブに計量し、20 mLマークまでH2Oを充填することにより、10%BSAを調製し、BSAが溶解するまで混合し(約30分)、容量を20 mLにします。メモ: 高品質の BSA を使用してください( 材料表を参照)。10%BSA溶液は、ビーズ調製と運動性ミックスの両方に使用されます。 ビーズ調製のために、Xbバッファー(10 mM HEPES、0.1 M KCl、1 mM MgCl2、および0.1 mM CaCl2、pH 7.5)を10x溶液として調製し、使用前に希釈してください(10x Xbストック溶液100 μL+H2 O900 μL)。100 μLの10x Xbストック溶液+ 100 μLの10%BSA + 800 μLのH2Oを混合して、Xb/1% BSAを調製します。 単量体アクチン(G-アクチン)を希釈するために使用されるバッファーであるGバッファー(2 mM Tris、0.2 mM CaCl 2、0.2 mM DTT、2 mM ATP)を準備します。従来使用されているpH 8ではなく、pH 7に調整します(説明を参照)。 運動性バッファーMB13(10 mM HEPES、1.5 mM ATP、3 mM DTT、1.5 mM MgCl2、1 mM EGTA、50 mM KCl、1% BSA、pH 7.5)を調製します。一部のアプリケーションでは、10x MB13が便利です。ただし、BSAなしで10x MB13を準備すると、pH調整中に問題が発生します。10x MB13から10x MB13を再構成する場合は、10%ストック溶液(ステップ1.1で調製)からBSAを追加します。 2.タンパク質溶液の調製 注:すべての再懸濁には超高純度のH2Oを使用してください。無菌である必要はありません。すべてのタンパク質を氷上で処理し、事前に冷却されたチューブに分注します。気泡が発生しないように穏やかに操作し、タンパク質溶液を濁らせないでください。-80°Cで保管するストックの場合、液体窒素中での急速冷凍は必要ありません。アリコートのサイズを調整して、約5回を超える凍結融解サイクルを回避します, これはどのタンパク質の活性にも影響しないようです.作業アリコートは、-20°Cで数週間保存できます。 下記のようにG-アクチン(ウサギ骨格筋)溶液を調製する。パルス遠心分離機アクチン粉末( 材料の表を参照)を4°Cで、チューブの底部に固体を集めた。 製造元の指示に従ってH 2 Oを追加します(非標識アクチンの場合は100 μLの冷たいH 2 Oに1 mgのタンパク質、ATTO標識アクチンの場合は100 μLの冷たいH2Oに100 μgのタンパク質)。 氷の上に少なくとも15分間置きます。上下にピペッティングして穏やかに混合し、少なくともさらに15分間氷の上に置き、再度混合します。4°Cのパルス遠心分離機でチューブの底部に溶液を回収し、再混合した。 用途に応じて、非標識アクチンのアリコート10〜50 μL、およびATTO標識アクチンのアリコート20 μLを調製します。アリコートは-80°Cで保存してください。 凍結乾燥および凍結中に形成されるアクチンオリゴマーを解重合するには、追加のATPおよびDTTを添加したGバッファーで再懸濁アクチンのアリコートを~8倍に希釈します(たとえば、ステップ2.1.4から20μLの再懸濁アクチン溶液に、134 μLのGバッファー、0.32 μLの0.2 mM ATP、および0.16 μLの1 M DTTを追加します)。蛍光標識のために、約10%標識アクチンを添加する。例えば、5 μLのATTO標識アクチンを40 μLの希釈非標識アクチンに加えます。ステップ3に記載されているように、ブラッドフォードアッセイによってタンパク質濃度を測定する前に、少なくとも数日から1週間、時折混合(ピペッティング)して氷上で解重合させます。注意: 希釈されたラベルのない蛍光アクチンを冷蔵室または冷蔵庫の氷上に保管してください。凍結したり、温めたりしないでください。調製物は時間の経過とともに解重合を続け、適切に取り扱われると少なくとも6ヶ月間使用することができる。 Arp2/3複合体(ブタの脳)( 材料の表を参照)を製造元の指示に従って(20 μLの低温H 2 O中の20 μgタンパク質)に、ステップ2.1のアクチンについて説明したように、氷上でのパルス遠心分離、混合などのシーケンスで再懸濁します。2本のチューブの粉末を再懸濁したタンパク質溶液を組み合わせて、再現性のある実験のためにより大きなストックを作ります。2 μLのアリコートを調製し、-80°Cで保存します。 プロフィリン(ヒト組換え体)( 材料の表を参照)を、製造元の説明書(25 μLの冷たいH 2 O中の100 μgのタンパク質)に規定されている濃度の4倍で再懸濁し、ステップ2.1のアクチンと同様に氷上でのパルス遠心分離、混合などのシーケンスを行います。タンパク質濃度を決定する前に、2本のチューブの粉末を再懸濁してタンパク質溶液を組み合わせて、再現性のある実験のためのストックを増やします。注意: 冷蔵室または冷蔵庫で氷の上に保管してください。凍結したり、温めたりしないでください。適切に取り扱われた場合、再懸濁されたプロフィリンは少なくとも6ヶ月から1年間有効です。 キャッピングタンパク質(α1β2、ヒト組換え体)( 材料の表を参照)を製造元の指示に従って(50 μLの低温H2O中の50 μgタンパク質)、ステップ2.1のアクチンについて説明したように、氷上でのパルス遠心分離、混合などのシーケンスで再懸濁します。50 μLのグリセロールを氷上で冷やし、50 μLの再懸濁したキャッピングタンパク質を加えます。穏やかに混ぜる。-20°Cで保存してください。注:溶液は凍結せず、活性は堅牢であるため、慎重に取り扱えば、溶液を単一のアリコートとして数か月または数年保持できます。マウス組換えキャッピングタンパク質は、過去に in vitro 実験13で最も一般的に使用されたものであり、まもなく市販される予定です。 ゲルソリン(ヒト組換え体、Hisタグ付き)( 材料の表を参照)を、製造元の指示に従って(20 μLの低温H2O中の20 μgタンパク質)、ステップ2.1のアクチンについて説明したように、氷上でのパルス遠心分離、混合などのシーケンスで再懸濁します。実験の1日あたり約2μLのゲルソリンが使用されます。したがって、大きなアリコート(5〜10μL)を準備し、-80°Cで保存してください。注:ゲルソリンを使用したプロトコルは、代替として提供されます。ゲルソリンの代わりにキャッピングタンパク質を使用することが推奨され、購入または13のように精製されます。 VCA(ヒトWASP-VCA、GSTタグ付き)( 材料の表を参照)を、製造元の説明書(250 μLの低温H 2 O中の500 μgタンパク質)に規定されている濃度の2倍で再懸濁し、ステップ2.1のアクチンと同様に氷上でのパルス遠心分離、混合などのシーケンスを使用します。10 μLのアリコートを作り、-80°Cで保存します。注:SpVCA(ヒトpVCA、ストレプトアビジン、Hisタグ)が商品化されたら、またはタンパク質精製14 が可能な場合は、VCAの代わりにSpVCAを使用することをお勧めします。VCAは、ここで説明する条件下では彗星を再現可能に与えません。 3. タンパク質濃度の測定 BSAの2つの重なり合う連続希釈からなるブラッドフォード検量線を作成します。注:検量線は、分光光度計が変化しない限り、数か月ごと(またはそれほど頻繁ではない)にのみ構築する必要があります。マイクロチューブラックの1列目に、BSA希釈シリーズ#1用のチューブを配置します:4つの2 mLチューブの後に4つの1.5 mLチューブが続きます。ラックの3列目に、シリーズ#1と同様にBSA希釈シリーズ#2用のチューブを配置します。ラックの5列目に、測定するサンプルごとに1本の2 mLチューブと2本の1.5 mLチューブを配置します。ブランクの5行目に1.5mLチューブを1本追加します。 ブラッドフォード試薬( 材料表を参照)を1.5mLチューブに測定します。15 mLのコニカルチューブの上部にブラッドフォード試薬を充填して、氷上でのピペッティングを容易にします(超過分は冷蔵庫のストックボトルに戻されます)。200 μLのブラッドフォード試薬を取り、コニカルチューブに戻し、ピペットチップを濡らします。溶液は粘性があるので、ゆっくりとピペットで溶液が泡を立てずにチップに完全に出入りできるようにします。 「プレウェット」チップを使用して、200 μLのブラッドフォード試薬をラック内の1.5 mLチューブのそれぞれにゆっくりとピペットで入れます(BSA希釈ごとに4本、ブランクに1本、測定するサンプルごとに2本)。最初にこれを実行して、タンパク質溶液と混合する前に、ブラッドフォード試薬を室温まで完全に温めます。15 mLコニカルチューブの残りの内容物をボトルに戻します。 H 2 Oを2mLチューブに測定します。ラックの行 1 で、1,990 μL H2O を最初のチューブに追加し、900 μL を他の 3 つのチューブに追加します。行3の場合、最初のチューブに1,992.5 μL、他の3つのチューブに900 μLを追加します。2,000 μL H2Oを5列目の各サンプル管に加えます。注:1,000 μLを超えるすべての容量については、1,000 μLのピペットを使用しますが、ピペッティングを2回行って全量を投与します。タンパク質をH2Oで高度に希釈したままにしないようにするために、後続のステップを開始する前にすべてを準備することが重要です。 BSA希釈シリーズ#1を調製するには、10 μLの校正済み2 mg/mL BSA( 材料表を参照)を1,990 μL H2Oとチューブに混合して、10 μg/mL溶液を作ります。これから、各溶液900 μLを次のチューブ(900 μL H 2 Oを含む)に移すことによって、3つの段階希釈(5 μg/mL、2.5μg/mL、および1.25 μg/mL BSA)を行います。 BSA希釈シリーズ#2を調製するには、7.5 μLの校正済み2 mg/mL BSAを1,992.5 μL H2Oとチューブに混合して、7.5 μg/mL溶液を作ります。これから、各溶液900 μLを次のチューブ(900 μL H2Oを含む)に移すことによって、3つの段階希釈(3.75 μg / mL、1.875 μg / mLおよび0.9375 μg / mL BSA)を行います。 混合して吸光度を読み取り、検量線を生成します。ブランク用のブラッドフォード試薬チューブに800 μL H2Oを追加し、タイマーを開始します。泡を作らずにできるだけ効率的に、準備したチューブで各BSA標準物質800 μLをブラッドフォード試薬200 μLと混合します。すべての標準物質をブラッドフォード試薬と混合したら(<5分)、各標準物質を使い捨てキュベットに注ぎ、機械をブランキングした後、分光光度計で600nmの吸光度を読み取ります。注:最も濃度の低い標準が最初に読み取られ、キュベットが読み取りの間に十分に空になっている場合、同じキュベットを使用してシリーズ全体を読み取ることができます。線形適合のR値が少なくとも0.99になるまで、検量線をやり直します。ピペッティングと穏やかな混合が習得された後にのみ、サンプルの読み取りに進みます。 アクチンおよびアクチン結合タンパク質の濃度測定2,000 μLのH 2 O(ステップ3.1.3で調製)を含む2 mLチューブに、Arp2/3複合体とプロフィリン各2μL、標識G-アクチン4 μL、ゲルソリンとVCA各5 μL、キャッピングタンパク質8 μL(ヒト組換え)を穏やかに混合します。すぐに800 μLの溶液を取り、すでに調製したブラッドフォード試薬と混合し、各サンプルについて互いに5%〜10%以内の2つの測定値を得るために繰り返します。差が大きいほど、再サスペンションまたは処理に問題があることを示します。ブラッドフォード試薬と混合してから数分以内にお読みください。注:別の日の検量線を使用する場合は、サンプルに加えて、ステップ3.1.6のブランクのみを準備する必要があります。 検量線と希釈係数を使用してアクチンおよびアクチン結合タンパク質の濃度を計算します。新しい再懸濁ごとに測定をやり直します。ブラッドフォードアッセイ で 得られたmg/mL測定値をμMに変換する分子量は、アクチン43 kD、Arp2/3複合体224 kD、プロフィリン15 kD、ゲルソリン95 kD、キャッピングタンパク質68 kD(ヒト組換え体)または63.5 kD(マウス組換え)、VCA 43 kD、およびSpVCA 54 kD(モノマー分子量)です。 4.ビーズのコーティング 遠心分離機を4°Cにプレチルし、攪拌ドライブロック( 材料の表を参照)を18°Cに設定します。 ビーズを洗浄する:50 μLのXbバッファーを1.5 mLの微量遠心チューブにピペットで入れ、直径4.5 μmのビーズ懸濁液9 μLまたは直径1 μmのビーズ懸濁液2 μL(2.5 % w/v懸濁液)を加えます( 材料の表を参照)。サンプルを完全に混合し、20,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。注意: 両方のビーズサイズの合計ビード表面積は3 cm2です。球の体積と表面積の古典的な方程式を使用して、ビーズの数を計算し、次にそれらの総表面を計算することによって導き出されます。総表面積を3cm2で一定に保つように量を調整する場合、他のサイズのビーズを使用することができる。 ビーズのコーティング:ビーズを乱さずに上清を注意深く除去し、穏やかなピペッティングによりビーズペレットをXbバッファー中の2 μM SpVCA(または7 μM VCA)の40 μLに再懸濁します。18°C、1,000rpmで20分間攪拌します。 コーティングされたビーズを洗浄する:混合物を遠心分離し(20,000 x g で4°Cで10分間)、上清を注意深く除去します。ビーズを50 μLのコールドXb/1% BSAに再懸濁し、20,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を取り除き、洗浄ステップを1回繰り返します。 ステップ4.4のコーティングされたビーズペレットを、ビーズ表面積/ビーズ溶液のμLの量が同じになるように、両方のサイズのビーズの120 μLのコールドXb/1%BSAに再懸濁します。冷蔵庫または冷蔵室で氷上に保管してください。コーティングされたビーズは、少なくとも数週間は正常に機能し続けます。 5.観察用の運動性ミックスとスライドの準備 注:運動性ミックスの総容量は8.4μLで、スライドと18 mm x 18 mmのカバーガラスの間に約25 μmのクリアランスを確保できるため、すべてのサイズ(直径10 μmまで)のビーズが圧迫されません。基本的な運動性ミックスは、約5 μM G-アクチン(10%標識蛍光アクチン)と5 μMプロフィリン、50 nM Arp2/3複合体、および25 nMキャッピングタンパク質(または240 nMゲルソリン)です。 運動性反応混合物を調製する。アクチン(したがってプロフィリン)の正確な量は、ステップ3.3で計算された濃度に依存するが、代表的な反応は以下の通りである。3.2 μLのMB13、MB13で希釈した30 μMで1.5 μLのプロフィリン、MB13で希釈した0.21 μMのキャッピングタンパク質1 μL、MB13で2 μMに希釈したゲルソリン、MB13で希釈した0.47 μMのArp2/3複合体1 μL、ビーズ懸濁液(使用直前の渦)0.2 μL、 Gバッファー中で30 μMで1.5 μLのアクチン。よく、しかし素早く混ぜて、タイマーを開始します。 運動性反応混合物全体をスライド上に見つけます。18 mm x 18 mmのカバーガラスで覆い、小さな絵筆を使用して溶かしたVALAPでカバーガラスを密封します。VALAPは、ラノリン、パラフィン、ワセリン( 材料表を参照)を重量で1:1:1で混合し、溶かして一緒に攪拌したものです。 6. 顕微鏡観察 位相差顕微鏡および/または落射蛍光顕微鏡(GFPキューブ、材料表を参照)を備えた正立顕微鏡または倒立顕微鏡(材料表を参照)で100倍の対物レンズを使用して、運動反応を直ちに観察します。観察は室温(23〜25°C)で行われます。ビーズ全体の平均変位速度を得るには、スライド全体をスキャンして、位相差または蛍光静止画を経時的に記録します。彗星の長さを手で測定し、時間をプロットします。線形フィットの傾きは平均成長速度です。 個々のビーズの速度を評価するには、位相差顕微鏡でタイムラプス動画を収集します。ビードの速度と必要な解像度に応じて、1〜10秒ごとにフレームを取ります。画像処理プログラムのトラッキングツールを使用して、ビーズの速度と軌道を取得します。