JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

Published: October 28, 2022
doi:
10.3791/64261
,
1Laboratoire de physique de l’Ecole Normale Supérieure, ENS, Université PSL, CNRS,Sorbonne Université, Université Paris Cité

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר כוכבי שביט אקטין על פני השטח של חרוזים תוך שימוש ברכיבי חלבון זמינים מסחרית. מערכות כאלה מחקות את המבנים הבולטים הנמצאים בתאים, וניתן להשתמש בהן כדי לבחון מנגנונים פיזיולוגיים של ייצור כוח בצורה פשוטה.

Abstract

תנועות תאים רבות ושינויי צורה וסוגים מסוימים של תנועתיות חיידקית ואברונית תוך-תאית מונעים על ידי אקטין ביופולימרי היוצר רשת דינמית על פני התא, האברון או החיידק. הבסיס הביוכימי והמכני של ייצור כוח בתהליך זה ניתן לחקור על ידי שכפול תנועה מבוססת אקטין באופן תאי על משטחים אינרטיים כגון חרוזים פונקציונליים ודגירה עם קבוצה מבוקרת של רכיבים. בתנאים המתאימים, רשת אקטין אלסטית מתכנסת על פני החרוזים ונפתחת עקב הלחץ שנוצר על ידי צמיחת הרשת, ויוצרת “שביט אקטין” המניע את החרוז קדימה. עם זאת, ניסויים כאלה דורשים טיהור של שורה של חלבונים קושרי אקטין שונים, לעתים קרובות לשים אותם מעבר להישג ידם של שאינם מומחים. מאמר זה מפרט פרוטוקול להשגת שביטים אקטין ותנועתיות של חרוזים באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרית. ניתן לשנות את ציפוי החרוזים, גודל החרוזים ותערובת התנועתיות כדי לבחון את ההשפעה על מהירות החרוזים, מסלולים ופרמטרים אחרים. בדיקה זו יכולה לשמש לבדיקת הפעילות הביוכימית של חלבונים קושרי אקטין שונים, ולביצוע מדידות פיזיקליות כמותיות השופכות אור על תכונות החומר הפעיל של רשתות אקטין. זה יהיה כלי שימושי עבור הקהילה, המאפשר לחקור תנועתיות מבוססת אקטין במבחנה ללא ידע מקצועי בטיהור חלבונים קושרי אקטין.

Introduction

פילמור אקטין בתאים נשלט מרחבית וזמנית על ידי ויסות הדוק של נוקלאציה של חוטי אקטין במורד הזרם של איתות תאי1. נוקלאציה מתרחשת באמצעות היווצרות של טרימר אקטין, ואז שני הקצוות של הנימה המתהווה מתפלמרים באופן ספונטני, אם כי קצה אחד הוא דינמי יותר (הקצה התורן) מאשר השני (הקצה המחודד)2. כאשר נוקלאציה ופולימריזציה של קצה תיל מכוונות אל פני השטח, הן מייצרות מספיק כוח (בתחום פיקו-לננו-ניוטון) כדי לדחוף החוצה את קרום התא לתנועה ולהזיז עצמים בגודל מיקרון בתוך התא עם הידרוליזה ATP כמקור האנרגיה3. כמה דוגמאות כוללות חיידקי ליסטריה מונוציטוגנים המשתמשים בשביטים אקטין כדי להתפשט מתאים לתא, ומיטוכונדריה, שבה תנועה מבוססת שביט אקטין חשובה לתורשה אקראית במהלך מיטוזה 4,5. שביטים של אקטין על אנדוזומים ושלפוחיות תוך-תאיות אחרות מעורבים בניתוק מהממברנות התורמות 6,7,8.

בשיטה המוצגת כאן, עוקפים את היבטי האיתות של פילמור אקטין תאי, ופולימריזציה של אקטין מיוצרת על חרוזי פוליסטירן מיקרומטריים על ידי ציפוים במפעילים של גרעין אקטין מסועף, במיוחד התחום הפעיל של חלבון ה-WASP האנושי, VCA (המכונה גם WA או WCA)1. החרוזים המצופים מודגרים לאחר מכן בתערובת המכילה את המרכיבים הדרושים לפולימריזציה של אקטין, כולל גרעין הפילמור העיקרי של אקטין בתאים, קומפלקס Arp2/3, המופעל על ידי VCA במשטח החרוזים ליצירת חוטים חדשים כענפים מדפנות חוטי הבת1. אקטין בתחילה מתפלמר באופן אחיד סביב החרוז, אך לאחר מכן שובר באופן ספונטני את הסימטריה כדי ליצור שביט אקטין שדוחף את החרוז קדימה, ובכך יוצר מחדש רשתות בליטות דמויות תאים ושביטים באופן מבוקר. גישות דומות עם חרוזים ומשטחים מצופים אחרים שימשו בעבר על ידינו ועל ידי אחרים כדי לחקור את הביוכימיה והביופיזיקה של פולימריזציה של אקטין 9,10,11,12, אך מומחיות נרחבת בחלבונים קושרי אקטין נדרשה לניסויים אלה. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר כיצד ליצור באופן יציב כוכבי שביט אקטין ותנועתיות לחלוטין עם ריאגנטים זמינים מסחרית (או בקרוב יהיו זמינים), מה שהופך גישה זו לנגישה לכל אחד, כולל במסגרת חינוכית להוראת מושגים ביופיזיים. התכונות העיקריות כוללות את החשיבות של פיפטינג עדין ואמין, השימוש במונומר מורכב פרופילין כמקור אקטין, ואת החיוניות של שימוש פעיל מאוד Apr2/3 קומפלקס activator כמו ריאגנט ציפוי חרוזים.

Protocol

1. הכנת מאגרים הערה: השתמש ב-H2O אולטרה-טהור עבור כל המאגרים. זה לא חייב להיות סטרילי. סנן את כל הפתרונות המתוארים בשלבים 1.1-1.4 עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר, aliquot בחלקים של 500 μL-2 mL לכל צינור בהתאם לשימוש, ולאחסן ב -20 °C. הכינו 10% BSA על ידי שקילה של 2 גרם BSA לתוך צינור חרוטי של 50 מ”ל ומילוי עד סימן 20 מ”ל עם H2O. ערבבו עד שה-BSA מומס (כ-30 דקות), ואז הרכיבו את הנפח ל-20 מ”ל.הערה: השתמש ב- BSA באיכות גבוהה (ראה טבלת חומרים). תמיסת 10% BSA משמשת הן להכנת חרוזים והן לתערובת התנועתיות. להכנת חרוזים, יש להכין חיץ Xb (10 mM HEPES, 0.1 M KCl, 1 mM MgCl 2, ו-0.1 mM CaCl 2, pH 7.5) כתמיסה של 10x, ולדלל לפני השימוש (100 μL של 10x תמיסת מלאי Xb + 900 μL של H 2 O). הכן Xb / 1% BSA על ידי ערבוב 100 μL של 10x Xb פתרון מלאי + 100 μL של 10% BSA + 800 μL של H2O. הכן G-buffer (2 mM Tris, 0.2 mM CaCl 2, 0.2 mM DTT,2 mM ATP), שהוא החיץ המשמש לדילול אקטין מונומרי (G-actin). התאם ל- pH 7, ולא ל- pH 8 כפי שנהוג להשתמש בו (ראה דיון). הכן את מאגר התנועתיות MB13 (10 mM HEPES, 1.5 mM ATP, 3 mM DTT, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1% BSA, pH 7.5). עבור יישומים מסוימים, 10x MB13 הוא שימושי. עם זאת, הכן 10x MB13 ללא BSA, כפי שהוא מוביל לבעיות במהלך התאמת pH. הוסף BSA מפתרון מלאי של 10% (מוכן בשלב 1.1) בעת שחזור 1x MB13 מ- 10x MB13. 2. הכנת פתרונות חלבון הערה: השתמש ב-Ultrapure H2O עבור כל ההשבתות. זה לא חייב להיות סטרילי. טפלו בכל החלבונים שעל הקרח והאליקוט לתוך צינורות מקוררים מראש. תמרן בעדינות כדי לא לייצר בועות, ולעולם לא לערבב פתרונות חלבון. כדי לאחסן מלאי בטמפרטורה של -80°C, אין צורך בהקפאת הבזק בחנקן נוזלי. התאימו את גודל האליקוט כדי למנוע יותר מחמישה מחזורי הפשרה בהקפאה, מכיוון שנראה כי הדבר אינו משפיע על הפעילות של אף אחד מהחלבונים. עבודה aliquots ניתן לאחסן ב -20 °C (75 °F) במשך כמה שבועות. הכן תמיסת G-actin (שרירי שלד ארנב) כמתואר להלן.פולס אבקת אקטין צנטריפוגה (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את המוצק בתחתית הצינור. יש להוסיף את H 2 O בהתאם להוראות היצרן (1 מ”ג חלבון ב-100 מיקרו-ליטר של H2 O קר עבור אקטין ללא תווית, 100 מיקרוגרם חלבון ב-100 μL של H2O קרעבור אקטין עם תווית ATTO). תן לו לשבת על הקרח לפחות 15 דקות. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה, מניחים לו לשבת על הקרח לפחות עוד 15 דקות, ומערבבים שוב. פולס צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את התמיסה בתחתית הצינור, ורמיקס. הכינו 10-50 μL aliquots של אקטין ללא תווית בהתאם לשימוש, ו 20 μL aliquots של אקטין מסומן ATTO. אחסנו את האליקוטים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. כדי לבצע דה-פולימריזציה של אוליגומרים של אקטין שנוצרים במהלך ליופיליזציה והקפאה, יש לדלל אליקוט של אקטין שעבר החייאה ~פי 8 במאגר G עם תוספת ATP ו-DTT (לדוגמה, ל-20μL של תמיסת אקטין שעברה החייאה משלב 2.1.4, הוסף 134 μL של G-buffer, 0.32 μL של 0.2 mM ATP ו-0.16 μL של 1 M DTT). עבור תיוג פלואורסצנטי, להוסיף כ 10% מסומן actin; לדוגמה, להוסיף 5 μL של אקטין מסומן ATTO ל 40 μL של אקטין מדולל ללא תווית. תנו לו לבצע דה-פולימריזציה על הקרח עם ערבוב מזדמן (פיפטה) לפחות כמה ימים עד שבוע לפני מדידת ריכוז החלבון על ידי בדיקת ברדפורד כמתואר בשלב 3.הערה: יש לשמור אקטין מדולל ללא תווית ופלואורסצנטי על קרח בחדר קר או במקרר; לעולם אל תקפיא או תאפשר לו להתחמם. התכשיר ימשיך דה-פולימריזציה לאורך זמן, וכאשר מטפלים בו כראוי ניתן להשתמש בו לפחות 6 חודשים. יש לתלות מחדש את קומפלקס Arp2/3 (מוח חזירי) (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן (20 מיקרוגרם חלבון ב-20 μL קר H 2 O), עם רצף של צנטריפוגות פולסים, ערבוב וכו’ על קרח כמתואר עבור אקטין בשלב2.1. שלבו את תמיסות החלבון מהחייאת שתי שפופרות אבקה כדי שיהיה לכם מלאי גדול יותר לניסויים הניתנים לשחזור. מכינים 2 μL aliquots ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. Resurate profilin (רקומביננט אנושי) (ראה טבלת חומרים) בריכוז גבוה פי 4 מהקבוע בהוראות היצרן (100 מיקרוגרם חלבון ב-25 μL קר H 2 O), עם רצף של צנטריפוגות פולס, ערבוב וכו ‘על קרח כמו עבור אקטין בשלב2.1. שלבו את תמיסות החלבון מחידוש שתי שפופרות של אבקה לפני קביעת ריכוז החלבון כבעלות מלאי גדול יותר לניסויים הניתנים לשחזור.הערה: יש לשמור על קרח בחדר קר או במקרר; לעולם אל תקפיא או תאפשר לו להתחמם. כאשר מטפלים בו כראוי, פרופילין שעבר החייאה טוב לפחות 6 חודשים עד שנה. Resurate capping protein (α1β2, רקומביננטי אנושי) (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן (50 מיקרוגרם חלבון ב-50 μL קר H 2 O), עם רצף של צנטריפוגות פולסים, ערבוב וכו ‘על קרח כמתואר עבור אקטין בשלב2.1. מצננים 50 μL של גליצרול על הקרח ומוסיפים לו 50 μL של חלבון מכסה מחודש; מערבבים בעדינות. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.הערה: התמיסה אינה קופאת והפעילות איתנה, כך שניתן לשמור את התמיסה כאליקוט יחיד במשך חודשים, או אפילו שנים, אם מטפלים בה בזהירות. חלבון רקומביננטי לכיסוי עכברים, זה שהיה נפוץ ביותר בעבר בניסויים במבחנה 13, יהיה זמין בקרוב באופן מסחרי. Resuend gelsolin (רקומביננט אנושי, His-tagged) (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן (20 מיקרוגרם חלבון ב 20 μL קר H 2 O), עם רצף של צנטריפוגה פולס, ערבוב, וכו ‘על קרח כפי שתואר עבור actin בשלב2.1. כ 2 μL של gelsolin משמש ליום של ניסויים; לכן, להכין aliquots גדול (5-10 μL) ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.הערה: הפרוטוקול עם gelsolin מסופק כחלופה. מומלץ להשתמש בחלבון capping במקום gelsolin, או לרכוש או מטוהרים כמו13. השהה VCA (HUMAN WASP-VCA, GST-tagged) (ראה טבלת חומרים) בריכוז גבוה פי 2 מהקבוע בהוראות היצרן (500 מיקרוגרם חלבון ב-250 μL קר H 2 O), עם רצף של צנטריפוגות פולסים, ערבוב וכו ‘על קרח כמו עבור אקטין בשלב2.1. הכינו 10 μL aliquots ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.הערה: לאחר ש-SpVCA (pVCA אנושי, סטרפטווידין ו-His-tagged) ממוסחרים או אם ניתן לטהר חלבון14 , מומלץ להשתמש ב-SpVCA במקום ב-VCA. VCA אינו נותן שביטים בתנאים המתוארים כאן. 3. מדידת ריכוזי חלבונים בנה עקומה סטנדרטית של ברדפורד העשויה משני דילולים סדרתיים חופפים של BSA.הערה: יש לבנות את העקומה הסטנדרטית רק כל כמה חודשים (או אפילו בתדירות נמוכה יותר) כל עוד הספקטרופוטומטר אינו משתנה.בשורה 1 של מתלה מיקרו-צינורות, מקם צינורות לסדרת דילול BSA #1: ארבעה צינורות 2 מ”ל ואחריהם ארבעה צינורות 1.5 מ”ל. בשורה 3 של המדף, מקם צינורות עבור סדרת דילול BSA #2 כמו עבור סדרה #1. בשורה 5 של המדף, הנח צינור אחד של 2 מ”ל עבור כל דגימה שיש למדוד יחד עם שני צינורות 1.5 מ”ל. הוסף צינור יחיד של 1.5 מ”ל בשורה 5 עבור הריק. מדוד את מגיב ברדפורד (ראה טבלת חומרים) לתוך צינורות 1.5 מ”ל.מלאו צינור חרוטי של 15 מ”ל למעלה עם מגיב ברדפורד לפיפטינג קל יותר (עודף יוחזר לבקבוק המלאי במקרר) על קרח. קח 200 μL ברדפורד ריאגנט ולהוציא אותו בחזרה לתוך צינור חרוטי כדי להרטיב את קצה הפיפטה. מכיוון שהתמיסה צמיגה, פיפטה לאט כדי לאפשר לתמיסה להיכנס ולצאת מהקצה לחלוטין מבלי ליצור בועות. עם הקצה “הרטוב מראש”, לאט לאט פיפטה 200 μL של Bradford Reagent לתוך כל אחד צינורות 1.5 מ”ל במדף (ארבעה עבור כל דילול BSA, אחד עבור הריק ושניים עבור כל דגימה שיש למדוד). עשו זאת תחילה כדי לאפשר לריאגנט ברדפורד להתחמם ביסודיות לטמפרטורת החדר לפני הערבוב עם תמיסות חלבון. החזירו את התכולה הנותרת של הצינור החרוטי בגודל 15 מ”ל לבקבוק. מדוד את H 2 O לתוך צינורות2מ”ל. בשורה 1 של המדף, הוסף 1,990 μL H2O לצינור הראשון, ו- 900 μL לשלושת הצינורות האחרים. עבור שורה 3, הוסף 1,992.5 μL לצינור הראשון ו- 900 μL לשלושת הצינורות האחרים. הוסף 2,000 μL H2O לכל אחד מצינורות הדגימה בשורה 5.הערה: עבור כל אמצעי האחסון הגדולים מ- 1,000 μL, השתמש בפיפטה של 1,000 μL, אך נהל את הכמות המלאה על-ידי פיפטה פעמיים. חשוב להכין הכל לפני תחילת השלבים הבאים, על מנת למנוע השארת חלבונים מדולל מאוד H2O במשך תקופות זמן ארוכות. כדי להכין את סדרת דילול BSA #1, יש לערבב 10 μL של BSA מכויל של 2 מ”ג/מ”ל (ראו טבלת חומרים) לתוך הצינור עם 1,990 μL H2O כדי ליצור תמיסה של 10 מיקרוגרם/מ”ל. מכאן, בצע שלושה דילולים סדרתיים (5 מיקרוגרם/מ”ל, 2.5 מיקרוגרם/מ”ל ו-1.25 מיקרוגרם/מ”ל BSA) על ידי העברת 900 μL מכל תמיסה לצינור הבא (המכיל 900 μL H2O). כדי להכין את סדרת דילול BSA #2, ערבבו 7.5 μL של BSA מכויל של 2 מ”ג/מ”ל לתוך הצינור עם 1,992.5 μL H2O כדי ליצור תמיסה של 7.5 מיקרוגרם/מ”ל. מכאן, בצע שלושה דילולים סדרתיים (3.75 מיקרוגרם/מ”ל, 1.875 מיקרוגרם/מ”ל ו-0.9375 מיקרוגרם/מ”ל BSA) על ידי העברת 900 μL מכל תמיסה לצינור הבא (המכיל 900 μL H2O). מערבבים וקוראים את הספיגה כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית. הוסף 800 μL H2O לצינור מגיב ברדפורד עבור הריק, והפעל את הטיימר. בצורה יעילה ככל האפשר מבלי ליצור בועות, ערבבו 800 μL מכל תקן BSA עם מגיב ברדפורד של 200 μL בצינורות המוכנים. לאחר שכל התקנים התערבבו עם מגיב ברדפורד (< 5 דקות), שפכו כל תקן לתוך קובט חד פעמי וקראו את הספיגה ב-600 ננומטר בספקטרופוטומטר לאחר ריקון המכונה.הערה: ניתן להשתמש באותה קובטה כדי לקרוא את כל הסדרה אם התקן הפחות מרוכז נקרא ראשון והקובט מתרוקן היטב בין הקריאה. בצע שוב את העקומה הסטנדרטית עד שההתאמה הליניארית תהיה בעלת ערך R של 0.99 לפחות. רק לאחר פיפטינג וערבוב עדין הוא שולט, להמשיך לקרוא דוגמאות. מדידת ריכוזים של אקטין וחלבונים קושרי אקטיןבצינורות 2 מ”ל המכילים 2,000 μL של H 2 O (מוכנים בשלב 3.1.3), מערבבים בעדינות את הדברים הבאים:2μL כל אחד של קומפלקס Arp2/3 ופרופילין, 4 μL של G-actin מסומן, 5 μL כל אחד של gelsolin ו- VCA ו 8 μL של חלבון capping (רקומביננט אנושי). מיד לקחת 800 μL של התמיסה ולערבב עם מגיב ברדפורד כבר מוכן, ולאחר מכן לחזור על לקבל שתי קריאות בתוך 5%-10 % אחד של השני עבור כל דגימה. הבדל גדול יותר מצביע על בעיה בחידוש או בטיפול. קרא תוך מספר דקות של ערבוב עם מגיב ברדפורד.הערה: אם אתה משתמש בעקומה סטנדרטית מיום אחר, יש להכין רק את הריק משלב 3.1.6, בנוסף לדגימות. חשב את הריכוזים של חלבונים קושרי אקטין ואקטין באמצעות העקומה הסטנדרטית וגורם הדילול. בצע שוב את המדידה עבור כל חידוש חדש. משקלים מולקולריים להמרת קריאות mg/mL המתקבלות באמצעות בדיקת ברדפורד ל-μM הם: אקטין 43 kD, קומפלקס Arp2/3 224 kD, פרופילן 15 kD, ג’לסולין 95 kD, חלבון מכסה 68 kD (רקומביננטי אנושי) או 63.5 kD (רקומביננטי עכבר), VCA 43 kD ו- SpVCA 54 kD (משקל מולקולרי מונומר). 4. ציפוי חרוזים מצננים מראש את הצנטריפוגה ל-4°C ומכוונים את הבלוק היבש המרגש (ראו טבלת חומרים) ל-18°C. לשטוף את החרוזים: פיפטה 50 μL של חיץ Xb לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ”ל, להוסיף 9 μL של 4.5 μm קוטר חרוז ההשעיה או 2 μL של 1 μm קוטר חרוז תרחיף (2.5 % w / v השעיה) (ראה טבלת חומרים). מערבבים היטב וצנטריפוגות את הדגימות ב 20,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.הערה: שטח הפנים הכולל של החרוזים בשני גדלי החרוזים הוא 3 ס”מ2:נגזר על ידי חישוב מספר החרוזים ולאחר מכן המשטח הכולל שלהם באמצעות משוואות קלאסיות עבור נפח ושטח הפנים של כדורים. ניתן להשתמש בגדלים אחרים של חרוזים אם הכמויות מותאמות כדי לשמור על שטח פנים כולל קבוע של 3 ס”מ2. מצפים את החרוזים: מסירים בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לחרוזים, ומניחים מחדש את כדור החרוזים ב-40 μL של 2 μM SpVCA (או 7 μM VCA) במאגר Xb על ידי פיפטינג עדין. תסיסה ב-18°C, 1,000 סל”ד למשך 20 דקות. לשטוף חרוזים מצופים: צנטריפוגה את התערובת (20,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר בזהירות את supernatant. יש להשעות את החרוזים ב-50 מיקרו-ליטר של Xb/1% BSA קר, וצנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. יש להסיר את הסופר-נטנט ולחזור על שלב הכביסה 1x. החזירו את כדור החרוז המצופה משלב 4.4 ב-120 μL קר Xb/1% BSA עבור שני גדלי החרוזים, כך שכמות שטח החרוז/μL של תמיסת החרוזים תהיה זהה. יש לאחסן על קרח במקרר או בחדר קר. חרוזים מצופים ימשיכו לתפקד כרגיל במשך מספר שבועות לפחות. 5. הכנת תמהיל התנועתיות והשקופיות לתצפית הערה: הנפח הכולל של תערובת התנועתיות הוא 8.4 μL כדי לאפשר מרווח של כ-25 מיקרומטר בין השקופית לכיסוי בגודל 18 מ”מ x 18 מ”מ, כך שחרוזים בכל הגדלים (עד קוטר של 10 מיקרומטר) אינם נסחטים. תערובת התנועתיות הבסיסית היא כ-5 μM G-actin (10% מסומנים אקטין פלואורסצנטי) עם פרופיל 5 μM, קומפלקס Arp2/3 של 50 nM וחלבון מכסה של 25 nM (או 240 nM gelsolin). הכינו את תערובת תגובת התנועתיות. כמויות מדויקות של אקטין (ולכן פרופילין) תלויות בריכוז המחושב בשלב 3.3, אך תגובה מייצגת היא כדלקמן. מערבבים על קרח, בסדר הזה: 3.2 μL של MB13, 1.5 μL של פרופילין ב 30 μM מדולל ב MB13, 1 μL של חלבון capping ב 0.21 μM מדולל ב MB13 או gelsolin מדולל ל 2 μM ב MB13, 1 μL של קומפלקס Arp2/3 ב 0.47 μM מדולל ב MB13, 0.2 μL של מתלה חרוז (מערבולת ממש לפני השימוש), ו-1.5 μL של אקטין ב-30 μM ב-G-buffer. מערבבים היטב אך במהירות ומפעילים את הטיימר. זהה את כל תערובת תגובת התנועתיות בשקופית. יש לכסות בכיסוי בגודל 18 מ”מ x 18 מ”מ ולאטום את הכיסוי באמצעות VALAP מומס באמצעות מברשת צבע קטנה. VALAP הוא תערובת של לנולין, פרפין וג’לי נפט (ראו טבלת חומרים) 1:1:1 לפי משקל, מומסים ומעורבבים יחד. 6. תצפית מיקרוסקופיה התבונן בתגובות תנועתיות באופן מיידי באמצעות מטרה של פי 100 במיקרוסקופ זקוף או הפוך (ראו טבלת חומרים), המצוידת בניגודיות פאזה ו/או במיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית (קוביית GFP, ראו טבלת חומרים). התצפיות נעשות בטמפרטורת החדר (23-25 מעלות צלזיוס).כדי להשיג מהירויות תזוזה ממוצעות עבור אוכלוסייה שלמה של חרוזים, תעד ניגודיות פאזה או תמונות סטילס פלואורסצנטיות לאורך זמן על-ידי סריקת השקופית כולה. מדוד את אורך השביט ביד ואת העלילה לעומת הזמן. השיפוע של ההתאמה הליניארית הוא מהירות הצמיחה הממוצעת. כדי להעריך את המהירות של חרוזים בודדים, אסוף סרטים עם קיטועי זמן במיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה. בהתאם למהירות החרוז והרזולוציה הנדרשת, צלם מסגרות כל 1-10 שניות. השתמש בכלי המעקב של כל תוכנית עיבוד תמונה כדי להשיג מהירויות חרוזים ומסלולים.

Representative Results

אחד ההיבטים המרכזיים של יצירת שביטים אקטין על חרוזים הוא פיפטינג עדין ומדויק של חלבונים עדינים הקושרים אקטין. יצירת עקומה סטנדרטית של ברדפורד היא דרך טובה להעריך מיומנויות פיפטינג. איור 1A,B מראה את הצינורות עבור העקומה הסטנדרטית ודוגמה לאופן שבו שני הדילולים הסדרתיים של BSA נראים פעם מעורבבים עם מגיב ברדפורד. שימו לב לגוון הכחול המדורג (ריכוז חלבון גבוה יותר נותן פתרון כחול יותר). כאשר קוראים אותם בספקטרופוטומטר ומתווים אותם, הפתרונות האלה נותנים עקומה סטנדרטית כפי שמוצג באיור 1C. כדי לתרגל פיפטציה זהירה, יש לחזור על הבדיקה עד שגורם המתאם הליניארי הוא 0.999, כפי שמוצג. לאחר שהריכוזים של חלבונים מסחריים שעברו החייאה הוערכו בקפידה באמצעות מבחן ברדפורד, חרוזים מצופים ותערובת תנועתיות מוכנים ומעורבבים יחד. איור 2A מציג תמונות מייצגות של השלבים השונים של היווצרות כוכבי שביט: ענני אקטין נוצרים תוך דקות מרגע ערבוב חרוזים מצופים SpVCA ומדיום תנועתיות; קיטוב עננים מתרחש ב~5 דקות וייצור כוכבי שביט ב-15-20 דקות. כוכבי השביט של אקטין, הנראים הן באמצעות אפיפלואורסצנציה והן באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (איור 2A), ממשיכים להתארך במשך שעות רבות, אך מהירות עקבית אינה נשמרת ולכן תנועתיות החרוזים מוערכת בדרך כלל תוך שעה. מצד שני, נדרשות 30 דקות עם חרוזים מצופים VCA כדי לקבל ענני אקטין בהירים (איור 2B), ולא נוצרים כוכבי שביט, למרות שהסימטריה מתחילה להישבר בשעה 1-2 שעות (חץ באיור 2B) ועננים מראים קיטוב לאחר דגירה במהלך הלילה. איור 3 מראה דוגמה להערכת מהירות חרוזים בנוכחות חלבון מכסה. מאחר שכל החרוזים שוברים את הסימטריה בערך באותו הזמן, מתבצעות הקלטות “פסאודו-קיטועי זמן” שבהן השקופית נסרקת ותמונות של כל אוכלוסיית השביטים נלקחות לאורך זמן (איור 3A). כוכבי שביט אינם מתפרקים; לכן, ניתן להשתמש בעלייה באורכי השביט שנמדדה לאורך זמן כדי לחשב את מהירות התזוזה (איור 3B). ניתן להשתמש בגלסולין במקום חלבון מכסה ליצירת שביט אם מוסיפים פי 10 יותר ג’לסולין כדי לפצות על פעילות המכסה המופחתת שלו. כוכבי שביט הנוצרים בנוכחות ג’לסולין זהים מבחינה איכותית ונעים בערך באותן מהירויות כמו חרוזים עם חלבון מכסה (איור 3C). פעילות ה-Capping היא המפתח לריכוז הפילמור על פני השטח של החרוז, וכאשר לא חלבון מכסה ולא ג’לסולין נכללים בתערובת התנועתיות, ענני אקטין לעולם אינם מקטבים ויוצרים כוכבי שביט, למרות שענני אקטין בהירים נוצרים סביב החרוזים (איור 3D). שביטים על חרוזים יכולים לשמש למדידת ייצור כוח מבוסס אקטין בהקשרים ביוכימיים שונים על ידי שינוי תמהיל התנועתיות והתבוננות בתוצאה על תנועתיות באמצעות טכניקות מיקרומניפולציה שונות, למשל15. איור 1: עקומה סטנדרטית של ברדפורד. (A) תמונה של אופן הגדרת הצינורות ליצירת עקומת תקן ברדפורד. צינורות דגימה אינם מוצגים. (B) תמונה של שני דילולים סדרתיים חופפים של BSA שפעם התערבבו עם מגיב ברדפורד. (C) הספיגה ב-600 ננומטר של התמיסות המוצגות ב-(B) נמדדת בספקטרופוטומטר ומשורטטת כפונקציה של ריכוזי החלבונים של תמיסות ה-BSA. ההתאמה הליניארית משמשת לחישוב ריכוז הדגימה. גורם המתאם, R, של ההתאמה הליניארית הוא 0.999. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: היווצרות שביט על חרוזים מצופים SpVCA בניגוד לחרוזים מצופים VCA. (A) חרוזים מייצגים מצופים SpVCA (חרוזים שונים בכל תמונה) המוצגים לאורך זמן. זמן מרגע הערבוב מצוין. ענני אקטין נוצרים מיד, וקיטוב עננים נותן כוכבי שביט, שממשיכים להתארך במשך שעות. (B) חרוזים מייצגים מצופים VCA (חרוזים שונים בכל תמונה) המוצגים לאורך זמן. יותר משעה יש צורך לראות את התחלות הקיטוב של ענן אקטין (חץ) ואפילו דגירה ארוכה אינה מייצרת כוכבי שביט. כל התמונות הן של חרוזים בקוטר 4.5 מיקרומטר, הדמיה אפיפלואורסצנטית של אקטין פלואורסצנטי בשילוב עם הדמיית ניגודיות פאזה עבור נקודות זמן של 15 ו-20 דקות ב-(A), פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: ניתוח מהירות שביטים וחרוזים . (A) ו-(C) בנוכחות חלבון מכסה (CP) או גלסולין, ענני אקטין מקוטבים ליצירת כוכבי שביט ב-20 הדקות הראשונות של התגובה, ושביטים מתארכים עם הזמן. זמן מערבוב המצוין עבור כל תמונה; כל תמונה היא חרוז אחר. קיימת שונות מסוימת בין החרוזים וההכנה, אך בממוצע חרוזים נעים במהירויות של מיקרון/תת-מיקרון לדקה (0.2-1 מיקרומטר/דקה) בתנאים הסטנדרטיים שתוארו כאן. (B) גרף מייצג המציג הערכה של אורך השביט (כל אוכלוסיית החרוזים) לאורך זמן. השיפוע של המתאם הליניארי מתאים למהירות התזוזה הממוצעת, במקרה זה 0.24 מיקרומטר לדקה. (D) בהיעדר פעילות מכסה (ללא חלבון מכסה או ג’לסולין), ענני אקטין נוצרים סביב חרוזים, אך כוכבי שביט אינם נוצרים. כל התמונות הן של חרוזים בקוטר 4.5 מיקרומטר, הדמיה אפיפלואורסצנטית של אקטין פלואורסצנטי, פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

הפרוטוקול המפורט כאן מתאר כיצד להשיג גידול רשת אקטין על משטחי חרוזים, היווצרות כוכבי שביט ותנועתיות חרוזים באמצעות חלבונים זמינים מסחרית. עם זאת, לעתים שביטים אינם נצפים באופן משוחזר או שאינם הומוגניים בין המגלשה לכיסוי. הדיון הבא מדגיש כמה נקודות מפתח בפרוטוקול ומציע כמה פרמטרים שניתן להתאים. גורם אחד שיש לזכור הוא שהיווצרות השביט ומהירות החרוזים מושפעים מהטמפרטורה, כאשר הטמפרטורות הרבה מעל 25 מעלות צלזיוס או הרבה מתחת ל-23 מעלות צלזיוס משפיעות לרעה על היווצרות השביט ונותנות נתונים בלתי ניתנים לשחזור. מומלץ מאוד להשתמש במיקרוסקופ מבוקר טמפרטורה או במיקרוסקופ בחדר עם בקרת אקלים. אף על פי שאקטין המסומן באופן פלואורסצנטי נכלל לעתים קרובות בתערובת התנועתיות כדי לצפות בשביטים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ברגע שכוכבי שביט הם באורך של יותר מקוטר חרוז, הם נראים גם על ידי מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה ככתם כהה ליד החרוז. הדמיה של ניגודיות פאזה מתאימה יותר להדמיה בהילוך מהיר מכיוון שחלק מהפוטוטוקסיות קשורה להדמיה פלואורסצנטית אפילו באמצעות דיסק מסתובב. מכיוון שחרוזים שוקעים עם הזמן, מיקרוסקופ הפוך מייצר פחות סחף חרוזים אופקי מאשר סחף חרוזים זקוף והוא מתאים יותר לסרטים. השימוש ב-VALAP מותך לאיטום מגלשות חשוב מכיוון שחומרים כמו לק מפריעים להיווצרות כוכב שביט. ניתן להכין כמויות גדולות של VALAP בכוס, ולאחר מכן להוציא אותן החוצה כדי למלא כוסות קטנות יותר המתאימות יותר להמסה מהירה. VALAP טוב לשנים בטמפרטורת החדר.

היבט טכני מרכזי נוסף הוא הכנת תערובת חציצה ותנועתיות מוקפדת. יש להיזהר בעת הכנת MB13, במיוחד בשלב התאמת ה- pH. יש לכוונן את ה-pH של MB13 במהירות לניטרלי עם NaOH כדי למנוע הידרוליזה של ATP, אך לא מהר מדי מכיוון שה-EGTA מתמוסס ככל שה-pH מתקרב לנייטרלי. EGTA הוא מרכיב מפתח מכיוון שהוא קומפלקס את הסידן הקשור לאקטין, ומעניק לתערובת התנועתיות את צורת המגנזיוםהפעילה יותר 16. MB13 שהוכן מהר מדי או לאט מדי נותן היווצרות שביט לא אופטימלית או אפילו בכלל לא. נקודת מפתח נוספת היא לעקוב בקפידה אחר ריכוז KCl בתמהיל התנועתיות כאשר משחקים עם תנאים. לדוגמה, כאשר משתמשים ב-1x MB13 בתמהיל התגובה ומדללים פרופילין, חלבון מכסה וקומפלקס Arp2/3 ב-MB13, ריכוז ה-KCl הסופי בתגובת התנועתיות הוא כ-40-50 mM עקב דילול על ידי G-buffer. ריכוז זה נותן את התוצאות הטובות ביותר בבדיקת השביט, וכל יותר מ-60 mM KCl מקטין את פעילות הגרעין המורכבת של Arp2/3.

בצד החלבונים של הדברים, היבט טכני קריטי בהשגת שביטים אקטין הוא טיפול נכון בחלבונים קושרי אקטין מסחריים, בפרט צנרת מדויקת של כמויות מיקרוליטר. הלינאריות של העקומה הסטנדרטית של ברדפורד היא מבחן טוב של פיפטינג ואז העקומה יכולה לשמש למדידות שגרתיות של ריכוזי חלבונים. ואכן, בעת שימוש בחלבונים מסחריים שעברו החייאה לצורך הליך השביט, חשוב תמיד לאמת את ריכוזי החלבונים, שכן השתנות אצווה וטעות משתמש במהלך ההדחה מחדש יכולות להוביל להבדלים בין ריכוזים אמיתיים וצפויים. לפעמים הבדלים קטנים בריכוזי החלבון יכולים להוביל להיעדר מוחלט של כוכבי שביט.

היבט חשוב נוסף של השיטה המוצגת כאן הוא השימוש ב-G-actin המורכב מפרופילין כדלק לפילמור. מבחינה היסטורית, מערכות במבחנה השתמשו באקטין נימה טרום-פולימרית (F-actin) כמקור לאקטינים: דה-פולימריזציה בפולימריזציה בתפזורת על פני השטח10,17. זה היה היתרון של שליטה ברמות G-actin, אבל הוסיף שכבה של מורכבות הדורשת רכיבים נוספים כדי לזרז דה-פולימריזציה. מכיוון שתחלופה של רשת האקטין אינה הכרחית לייצור כוח ותנועתיות, המונעים על ידי נוקלאציה ופילמור על פני השטח של החרוז, בעוד שגורמי דה-פולימריזציה של אקטין כגון ADF/cofilin פועלים על הרשתות המיושנות הרחוקות מפני השטח18, רוב השיקום במבחנה של תנועתיות מבוססת אקטין נעשה כיום ללא תחלופה לצורך פשטות. עם זאת, ישנם כמה חסרונות לשימוש ב- G-actin. ראשית, בעת שימוש באקטין מסחרי, אשר עבר lyophilized, אוליגומרים נוכחים. שלבי הדה-פולימריזציה המתוארים כאן חשובים מאוד בהשגת תוצאות הניתנות לשחזור. בפרט, למרות ש-G-buffer מותאם באופן מסורתי ל-pH 8, נראה כי pH נמוך יותר (pH 7, למשל) פועל טוב יותר במבחנים המתוארים במאמר זה, אולי משום ש-pH נמוך משפר את הדה-פולימריזציה19. חסרון נוסף בשימוש ב- G-actin הוא שברגע שמניחים בתנאי מלח המתירים לפילמור, מתרחשת נוקלאציה ספונטנית וצורות F-אקטין בתפזורת כמו גם על פני החרוז. שילוב G-actin עם פרופילן מדכא נוקלאציה ספונטנית בפולימריזציה של הקצה בתפזורת ובקצה, ובכך ממקד הן את הנוקלאציה והן את פילמור הקצה על פני השטח20. פרופילין-G-אקטין רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, שכן חלק גדול מהאקטין בתא נמצא בצורה זו21. כאן, יחס של 1:1 של פרופילין:אקטין משמש; עם זאת, יחסים גבוהים יותר (לדוגמה 3:1) מעכבים באופן יסודי יותר פילמור בתפזורת, אם כי יחסים גבוהים יותר מעכבים גם את קומפלקס Arp2/3 ואת התארכות הקצה של התיל במידה מסוימת22,23.

פעילות ה-Capping היא גם המפתח להיווצרות כוכבי שביט, שכן היא מבטיחה החדרה של אקטין חדש לפני השטח באמצעות מחזורי נוקלאציה על ידי קומפלקס Arp2/3 המופעל על פני השטח24,25. ללא כיסוי, ענני אקטין אינם שוברים את הסימטריה כדי ליצור כוכבי שביט מכיוון שפילמור על פני השטח אינו בונה מספיק מתח כדי לשבור את הענן26. בעבר, השתמשנו בחלבון13 של עכברים רקומביננטיים מטוהרים בבית, אך בדיקות שבוצעו עבור מאמר זה מצביעות על כך שחלבון רקומביננטי זמין מסחרית של כמוסות אנושיות יעיל באותה מידה, כמו גם ג’לסולין זמין מסחרית, אם כי יש להשתמש בגלסולין פי 10 יותר, ועבור יישומים מסוימים, ייתכן שהוא אינו מתאים מכיוון שיש לו פעילות ניתוק אקטין כמו גם capping27.

לבסוף, החוסן של שיטה זו טמון בשימוש במפעיל קומפלקס Arp2/3 פעיל מאוד, סטרפטאבידין-pVCA (SpVCA)28. SpVCA כולל את תחום הקישור פרופילין-G-אקטין של WASP (תחום p) בנוסף לתחום הקישור המורכב Arp2/3 מכיוון שנמצא כי זה יעיל ביותר בתנאי פרופילין-G-אקטין29. חשוב מכך, לשימוש בתג סטרפטאווידין, שהוצג במקור כדי לאפשר פונקציונליזציה של פני השטח באמצעות קישור ביוטין-סטרפטאווידין, יש השפעה נוספת של הגדלת ההפעלה המורכבת של Arp2/3, ככל הנראה בשל העובדה שסטרפטווידין הוא טטרמר ובכך מקבץ את המפעיל, הידוע כמגביר את הפעילות המורכבת של Arp2/330 . SpVCA בייצור מסחרי נמצא כעת בפיתוח ובקרוב יהיה זמין לרכישה. עוד יש לציין כי למרות ש-40 μL של 2 μM SpVCA משמשים באופן שגרתי לציפוי 3 ס”מ2 של משטח חרוז, ריכוזי ציפוי אחרים (גבוהים ונמוכים יותר) פועלים גם הם, ומשחק בתנאים אלה נותן מהירויות גדילה ומורפולוגיות שונות של שביט. ואכן, כאשר שביטים אינם נוצרים או שגודל השביט אינו הומוגני בשקופית, יש לבדוק תנאי ציפוי שונים, כמו גם ריכוזי KCl ופרופילינים שונים בתערובת התנועתיות. ניתן גם לשנות את ריכוזי האקטין, קומפלקס Arp2/3 וחלבון המכסה בתערובת התנועתיות כדי לייעל את היווצרות השביט, אך בידינו, שינוי פרופורציות אלה נותן לעתים קרובות תוצאות מבלבלות.

לסיכום, השיטות המתוארות כאן מייצרות הרכבה של אקטין על משטחי חרוזים ותנועתיות, אך ניתן להשתמש בכל משטח שניתן לתפקד באמצעות SpVCA. במקרים בהם ספיחה כפי שמתואר כאן אינה פועלת, ניתן להשתמש ב-streptavidin moiety כדי להצמיד את SpVCA לפני השטח של העניין לאחר ביוטינילציה. מבני האקטין שנוצרו כך, שביטים או אחרים, יכולים לשמש לבדיקת היבטים ביוכימיים וביופיזיים שונים של רשתות אקטין, והם מתאימים במיוחד למניפולציות פיזיקליות עם מיקרופיפטים, פינצטה אופטית ואבלציות לייזר 15,26,31,32. בנוסף לשימושיה לקהילת המחקר, הגישה המתוארת כאן מתאימה ככלי הוראה לתלמידי תואר ראשון בביופיזיקה לחקור מושגים של חומר פעיל כגון שבירת סימטריה וארגון עצמי.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים בכנות לחברי הבית החדש שלנו ב- LPENS על קבלת הפנים החמה שלהם, ובמיוחד לצוות ABCDJ על כל עזרתם ותמיכתם. J.P. מאשרת תמיכה כספית מהקרן ARC (מענק PJA 20191209604), ו- C.S. מאשרת תמיכה כספית מארגון תוכנית המדע של גבולות האדם (מענק RGP0026/2020).

Materials

Actin, rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate  Invitrogen (ThermoFisher Scientific) A12373 (recently discontinued) This product can be replaced with ATTO-488 actin from Hypermol.
Actin, rabbit muscle, ATTO-488 Hypermol 8153
Actin, rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99
Arp2/3 complex Cytoskeleton RP01P
ATP Sigma A7699
BioSpectrometer, basic Eppendorf 035739
Bradford Reagent Bio-Rad 500-0006
BSA, high quality Sigma A3059
BSA standard 2 mg/mL (Pierce) Thermo Scientific 23209
Capping protein (a1b2, mouse recombinant) Home-purified (Reference 13) This product will soon be commercially available from Cytoskeleton.
Capping protein (a1b2, human recombinant) Hypermol 8322
Cube, GFP: U-MNIBA3 or U-MWB2 Olympus discontinued Any GFP cube, adapted to the microscope being used, can be used.
Dry block, agitating: ThermoMixer C (refrigerated) Eppendorf 035963
** with SmartBlock, 24 microtubes 2 mL Eppendorf 035969
Gelsolin (human recombinant, His-tagged) Cytoskeleton HPG6
Lanolin Sigma 49909
Microcentrifuge 5427R + rotor Eppendorf 934126
Microscope, upright: BX51 Olympus discontinued Any epifluorescence upright microscope equipped with phase contrast optics can be used.
Microscope, inverted: IX70 Olympus discontinued Any epifluorescence inverted microscope equipped with phase contrast optics can be used.
Paraffin Sigma 76244
Petroleum jelly: Vaseline Sigma 16415
Pipettes Research Plus Eppendorf Gilson pipettes don't work as well for delivery of very small volumes (0.5 µL for example).
**10 µL 933954
**2.5 µL 933953 These two sizes are essential, but the use of high-quality pipettes (a full Research Plus set for example) is recommended.
Polystyrene carboxylate beads Polysciences
**approx. 1 µm diameter 08226
**approx. 4.5 µm diameter 17140-5
Profilin 1 (human recombinant, untagged) Cytoskeleton PR02
SpVCA (human WASP pVCA domain, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag) Home-purified (Reference 14) This product will soon be commercially available from Cytoskeleton.
VCA (human WASP VCA domain, GST-tagged) Cytoskeleton VCG03
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campellone, K. G., Welch, M. D. A nucleator arms race: cellular control of actin assembly. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 237-251 (2010).
  2. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).
  3. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture and mechanics in cell motility. Physiological Reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
  4. Tilney, L. G., Tilney, M. S. The wily ways of a parasite: induction of actin assembly by Listeria. Trends in Microbiology. 1 (1), 25-31 (1993).
  5. Moore, A. S., et al. Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis. Nature. 591 (7851), 659-664 (2021).
  6. Taunton, J., et al. Actin-dependent propulsion of endosomes and lysosomes by recruitment of N-WASP. Journal of Cell Biology. 148 (3), 519-530 (2000).
  7. Velarde, N., Gunsalus, K. C., Piano, F. Diverse roles of actin in C. elegans early embryogenesis. BMC Developmental Biology. 7, 142 (2007).
  8. Merrifield, C. J., et al. Endocytic vesicles move at the tips of actin tails in cultured mast cells. Nature Cell Biology. 1 (1), 72-74 (1999).
  9. Samarin, S., et al. How VASP enhances actin-based motility. Journal of Cell Biology. 163 (1), 131-142 (2003).
  10. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  11. Boujemaa-Paterski, R., et al. Network heterogeneity regulates steering in actin-based motility. Nature Communications. 8 (1), 655 (2017).
  12. Akin, O., Mullins, R. D. Capping protein increases the rate of actin-based motility by promoting filament nucleation by the Arp2/3 complex. Cell. 133 (5), 841-851 (2008).
  13. Palmgren, S., Ojala, P. J., Wear, M. A., Cooper, J. A., Lappalainen, P. Interactions with PIP2, ADP-actin monomers, and capping protein regulate the activity and localization of yeast twinfilin. Journal of Cell Biology. 155 (2), 251-260 (2001).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 368 (1629), 20130005 (2013).
  15. Marcy, Y., Prost, J., Carlier, M. -. F., Sykes, C. Forces generated during actin-based propulsion: a direct measurement by micromanipulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 5992-5997 (2004).
  16. Carlier, M. -. F. Actin: protein structure and filament dynamics. Journal of Biological Chemistry. 266 (1), 1-4 (1991).
  17. Loisel, T. P., Boujemaa, R., Pantaloni, D., Carlier, M. F. Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins. Nature. 401 (6753), 613-616 (1999).
  18. Reymann, A. -. C., et al. Turnover of branched actin filament networks by stochastic fragmentation with ADF/cofilin. Molecular Biology of the Cell. 22 (14), 2541-2550 (2011).
  19. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Quantitative variations with pH of Actin Depolymerizing Factor/Cofilin’s multiple actions on actin filaments. Biochemistry. 58 (1), 40-47 (2019).
  20. Plastino, J., Blanchoin, L. Dynamic stability of the actin ecosystem. Journal of Cell Science. 132 (4), 219832 (2019).
  21. Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
  22. Suarez, C., et al. Profilin regulates F-actin network homeostasis by favoring formin over Arp2/3 complex. Developmental Cell. 32 (1), 43-53 (2015).
  23. Courtemanche, N., Pollard, T. D. Interaction of profilin with the barbed end of actin filaments. Biochemistry. 52 (37), 6456-6466 (2013).
  24. Achard, V., et al. A "primer"-based mechanism underlies branched actin filament network formation and motility. Current Biology. 20 (5), 423-428 (2010).
  25. Sykes, C., Plastino, J. Actin filaments up against a wall. Nature. 464 (7287), 365-366 (2010).
  26. vander Gucht, J., Paluch, E., Plastino, J., Sykes, C. Stress release drives symmetry breaking for actin-based movement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7847-7852 (2005).
  27. McGough, A. M., Staiger, C. J., Min, J. -. K., Simonetti, K. D. The gelsolin family of actin regulatory proteins: modular structures, versatile functions. FEBS Letters. 552 (2-3), 75-81 (2003).
  28. Abou-Ghali, M., et al. Capping protein is not necessary for polarized actin network growth and actin based motility. Journal of Biological Chemistry. 295, 15366-15375 (2020).
  29. Yarar, D., D’Alessio, J. A., Jeng, R. L., Welch, M. D. Motility determinants in WASP family proteins. Molecular Biology of the Cell. 13 (11), 4045-4059 (2002).
  30. Padrick, S. B., et al. Hierarchical regulation of WASP/WAVE proteins. Molecular Cell. 32 (3), 426-438 (2008).
  31. Bussonier, M., et al. Mechanical detection of a long-range actin network emanating from a biomimetic cortex. Biophysical Journal. 107 (4), 854-862 (2014).
  32. Paluch, E., vander Gucht, J., Joanny, J. -. F., Sykes, C. Deformations in actin comets from rocketing beads. Biophysical Journal. 91 (8), 3113-3122 (2006).

Tags

ActinActin-based MotilityProtein ReconstitutionProtein PurificationBiochemical AnalysisBiophysical AnalysisLangmuir EquationProtein ResuspensionProtein ConcentrationBradford Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sykes, C., Plastino, J. Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64261, doi:10.3791/64261 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image