Visualización de la dinámica conformacional de los receptores de membrana utilizando FRET de molécula única
Summary
Este estudio presenta un procedimiento detallado para realizar experimentos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) en receptores acoplados a proteínas G (GPCR) utilizando el etiquetado específico del sitio a través de la incorporación de aminoácidos no naturales (UAA). El protocolo proporciona una guía paso a paso para la preparación de muestras smFRET, experimentos y análisis de datos.
Abstract
La capacidad de las células para responder a las señales externas es esencial para el desarrollo, crecimiento y supervivencia celular. Para responder a una señal del entorno, una célula debe ser capaz de reconocerla y procesarla. Esta tarea se basa principalmente en la función de los receptores de membrana, cuya función es convertir las señales en el lenguaje bioquímico de la célula. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) constituyen la familia más grande de proteínas receptoras de membrana en humanos. Entre los GPCR, los receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) son una subclase única que funcionan como dímeros obligados y poseen un gran dominio extracelular que contiene el sitio de unión al ligando. Los avances recientes en los estudios estructurales de mGluRs han mejorado la comprensión de su proceso de activación. Sin embargo, la propagación de cambios conformacionales a gran escala a través de mGluRs durante la activación y modulación es poco conocida. La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de una sola molécula (smFRET) es una técnica poderosa para visualizar y cuantificar la dinámica estructural de las biomoléculas a nivel de una sola proteína. Para visualizar el proceso dinámico de activación de mGluR2, se desarrollaron sensores conformacionales fluorescentes basados en la incorporación de aminoácidos no naturales (UAA) que permitieron el etiquetado de proteínas específicas del sitio sin perturbar la estructura nativa de los receptores. El protocolo descrito aquí explica cómo realizar estos experimentos, incluido el novedoso enfoque de etiquetado UAA, la preparación de muestras y la adquisición y análisis de datos smFRET. Estas estrategias son generalizables y pueden extenderse para investigar la dinámica conformacional de una variedad de proteínas de membrana.
Introduction
La transferencia de información a través de la membrana plasmática depende en gran medida de la función de los receptores de membrana1. La unión del ligando a un receptor conduce a un cambio conformacional y a la activación del receptor. Este proceso es a menudo alostérico en la naturaleza2. Con más de 800 miembros, los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son la familia más grande de receptores de membrana en humanos3. Debido a su papel en casi todos los procesos celulares, los GPCR se han convertido en objetivos importantes para el desarrollo terapéutico. En el modelo canónico de señalización GPCR, la activación de agonistas da lugar a cambios conformacionales del receptor que posteriormente activan el complejo heterotrimérico de proteína G a través del intercambio de GDP por GTP en el bolsillo de unión a nucleótidos de Gα. Las subunidades G α-GTP y Gβγ activadas controlan entonces la actividad de las proteínas efectoras aguas abajo y propagan la cascada de señalización 4,5. Este proceso de señalización depende esencialmente de la capacidad de los ligandos para cambiar la forma tridimensional del receptor. Una comprensión mecanicista de cómo los ligandos logran esto es fundamental para desarrollar nuevas terapias y diseñar receptores y sensores sintéticos.
Los receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) son miembros de la familia GPCR de clase C y son importantes para los efectos neuromoduladores lentos del glutamato y la sintonización de la excitabilidad neuronal 6,7. Entre todos los GPCR, los GPCR de clase C son estructuralmente únicos en el sentido de que funcionan como dímeros obligados. mGluRs contiene tres dominios estructurales: el dominio Venus atrapamoscas (VFT), el dominio rico en cisteína (CRD) y el dominio transmembrana (TMD)8. Los cambios conformacionales durante el proceso de activación son complejos e implican acoplamiento conformacional local y global que se propaga a una distancia de 12 nm, así como cooperatividad de dímeros. Se desconocen las conformaciones intermedias, el orden temporal de los estados y la tasa de transición entre estados. Al seguir la conformación de receptores individuales en tiempo real, es posible identificar los estados intermedios transitorios y la secuencia de cambios conformacionales durante la activación. Esto se puede lograr aplicando una sola molécula de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia 9,10 (smFRET), como se aplicó recientemente para visualizar la propagación de cambios conformacionales durante la activación de mGluR2 11. Un paso clave en los experimentos FRET es la generación de sensores FRET mediante la inserción específica del sitio de los fluoróforos donantes y aceptores en la proteína de interés. Se adoptó una estrategia de incorporación de aminoácidos no naturales (UAA)12,13,14,15 para superar las limitaciones de las tecnologías típicas de etiquetado fluorescente específicas del sitio que requieren la creación de mutantes sin cisteína o la inserción de una gran etiqueta codificada genéticamente. Esto permitió observar el reordenamiento conformacional del enlazador alostérico compacto esencial, que se unió a los dominios de unión al ligando y señalización de mGluR2. En este protocolo, se presenta una guía paso a paso para realizar experimentos smFRET en mGluR2, incluido el enfoque para el etiquetado específico del sitio de mGluR2 con UAA para unir fluoróforos utilizando la reacción de ciclación de azida catalizada por cobre. Además, este protocolo describe la metodología para la captura directa de proteínas de membrana y el análisis de datos. El protocolo descrito aquí también es aplicable al estudio de la dinámica conformacional de otras proteínas de membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los GPCR son proteínas que operan en la membrana celular para iniciar la transducción de señales. Muchos GPCR consisten en múltiples dominios, y la señalización depende de la interacción cooperativa entre los dominios. Para modular las propiedades de estos receptores de membrana, es esencial comprender el comportamiento dinámico de los múltiples dominios. La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) es una técnica de fluorescencia que permite medir la conformación y …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Reza Vafabakhsh por las discusiones. Este trabajo fue apoyado por la subvención R01GM140272 de los Institutos Nacionales de Salud (a R.V.), por The Searle Leadership Fund for the Life Sciences en Northwestern University, y por el Chicago Biomedical Consortium con el apoyo de Searle Funds en The Chicago Community Trust (a R.V.). B.W.L. fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.
Materials
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
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