Visualisierung der Konformationsdynamik von Membranrezeptoren mit Einzelmolekül-FRET

Die Übertragung von Informationen über die Plasmamembran hängt stark von der Funktion der Membranrezeptoren^{ab 1}. Die Bindung von Liganden an einen Rezeptor führt zu einer Konformationsänderung und Rezeptoraktivierung. Dieser Prozess ist oft allosterischer Natur². Mit über 800 Mitgliedern sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die größte Familie von Membranrezeptoren beim Menschen³. Aufgrund ihrer Rolle in fast allen zellulären Prozessen sind GPCRs zu wichtigen Zielen für die therapeutische Entwicklung geworden. Im kanonischen Modell der GPCR-Signalübertragung führt die Agonistenaktivierung zu Konformationsänderungen des Rezeptors, die anschließend den heterotrimeren G-Proteinkomplex durch Austausch von GDP gegen GTP an der Nukleotidbindungstasche von G_α aktivieren. Die aktivierten_G-α-GTP– und_{G-βγ-Untereinheiten} steuern dann die Aktivität nachgeschalteter Effektorproteine und propagieren die Signalkaskade ^4,5. Dieser Signalprozess hängt wesentlich von der Fähigkeit der Liganden ab, die dreidimensionale Form des Rezeptors zu verändern. Ein mechanistisches Verständnis davon, wie Liganden dies erreichen, ist entscheidend für die Entwicklung neuer Therapeutika und das Design synthetischer Rezeptoren und Sensoren.

Metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluR) gehören zur GPCR-Familie der Klasse C und sind wichtig für die langsamen neuromodulatorischen Effekte von Glutamat und die Abstimmung der neuronalen Erregbarkeit ^6,7. Unter allen GPCRs sind GPCRs der Klasse C strukturell einzigartig, da sie als obligate Dimere fungieren. mGluRs enthalten drei strukturelle Domänen: die Venusfliegenfalle (VFT), die Cystein-reiche Domäne (CRD) und die Transmembrandomäne (TMD)⁸. Die Konformationsänderungen während des Aktivierungsprozesses sind komplex und beinhalten lokale und globale Konformationskopplungen, die sich über eine Entfernung von 12 nm ausbreiten, sowie Dimerkooperativität. Die intermediären Konformationen, die zeitliche Ordnung der Zustände und die Übergangsrate zwischen den Zuständen sind unbekannt. Durch die Verfolgung der Konformation einzelner Rezeptoren in Echtzeit ist es möglich, die transienten Zwischenzustände und die Abfolge der Konformationsänderungen während der Aktivierung zu identifizieren. Dies kann durch Anwendung des Einzelmolekül-Fluoreszenzresonanzenergietransfers 9,10 (smFRET) erreicht werden, wie er kürzlich angewendet wurde^, um die Ausbreitung von Konformationsänderungen während der Aktivierung von mGluR2 ¹¹ zu visualisieren. Ein wichtiger Schritt in FRET-Experimenten ist die Erzeugung von FRET-Sensoren durch ortsspezifisches Einfügen der Donor- und Akzeptorfluorophore in das interessierende Protein. Eine Strategie zur Einbeziehung unnatürlicher Aminosäuren (UAA) wurde 12,13,14,15 angenommen, um die Einschränkungen typischer ortsspezifischer fluoreszierender Markierungstechnologien zu überwinden^, die die Schaffung von Cystein-losen Mutanten oder das Einfügen eines großen genetisch kodierten Tags erfordern. Damit konnte die Konformationsumlagerung des essentiellen kompakten allosterischen Linkers beobachtet werden, der die Ligandenbindungs- und Signaldomänen von mGluR2 verband. In diesem Protokoll wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Durchführung von smFRET-Experimenten mit mGluR2 vorgestellt, einschließlich des Ansatzes für die ortsspezifische Markierung von mGluR2 mit UAA zur Bindung von Fluorophoren unter Verwendung der kupferkatalysierten Azidcyclisierungsreaktion. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll die Methodik für die direkte Erfassung von Membranproteinen und die Datenanalyse. Das hier skizzierte Protokoll ist auch auf die Untersuchung der Konformationsdynamik anderer Membranproteine anwendbar.