Yüksek Uzamsal Çözünürlüklü İmplantla İlişkili Enfeksiyonların X-ışını ile Kimyasal Görüntülenmesi Uyarılmış Lüminesans Doku Yoluyla Kimyasal Görüntüleme

Amerika Birleşik Devletleri’nde, yılda yaklaşık 2 milyon kırık fiksasyon cihazı yerleştirilmektedir ve bunların% 5-10’u implantla ilişkili enfeksiyonlara yol açmaktadır¹. Bu enfeksiyonların, biyofilmlerin heterojenliği ve antibiyotiğe dirençli doğası nedeniyle daha sonraki aşamalarda antibiyotiklerle tedavi edilmesi daha zordur ^2,3. Erken teşhis edilirse, enfeksiyonlar, tedavi edilen kırık bölgesinde donanımın değiştirilmesi için ikinci bir ameliyat için ekstra tıbbi maliyetleri önlemek için antibiyotikler ve cerrahi debridman ile tedavi edilebilir. Düz radyografi ve diğer ileri radyografik teknikler ortopedik implant ile ilişkili enfeksiyonların, kaynamaların ve buna bağlı komplikasyonların tanısında uygulanmaktadır. Bu teknikler ortopedik implantta çevre kemik ve dokunun yapısal bilgilerini elde etmek için sıklıkla kullanılsa da, spesifik ortamda biyokimyasal bilgi sağlayamamaktadır. Bu nedenle, implant bölgesinde invaziv olmayan biyokimyasal bilgilerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için yeni bir X-ışını uyarılmış lüminesans kimyasal görüntüleme (XELCI) tekniği geliştirdik. Ortopedik implantla ilişkili enfeksiyonların teşhisi genellikle bir veya farklı araçların bir kombinasyonu ile gerçekleştirilir. Klinik gözlemler (ağrı, şişlik, kızarıklık, yara akıntısı vb.) enfeksiyonun ilk belirtilerini göstermektedir. Daha sonra, kemik iyileşmesinin ilerlemesinin başarısızlığını doğrulamak ve patojenik organizmayı tanımlamak için radyolojik ve laboratuvar deneyleri yapılır ^4,5. Bilgisayarlı tomografi (BT), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi nükleer tıbbi teknikler ve Tek Foton Emisyon Bilgisayarlı Tomografi (SPECT) ve Pozitron Emisyon Tomografisi (PET) gibi radyonükleotid yöntemleri, enfekte implantın ve ilişkili enfeksiyonun daha iyi görüntülenmesi için kullanılmaktadır ^6,7. BT ve MRG, sırasıyla kemik nekrozunu ve yumuşak doku anormalliklerini belirlemede avantajlıdır, ancak metal implantlara yakın mesafede parazitlere neden olur⁸. İn vivo görüntüleme kontrast maddeleri gibi radyoizotop etiketli analitlerle kombinasyon halinde SPECT ve PET gibi farklı X-ışını metodolojileri, implantla ilişkili osteomiyelit^2’yi teşhis etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mevcut uygulamalar, anatomik bilgi üretmek için hem BT taramasından hem de SPECT veya PET’ten gelen etiketleme verilerini birleştirir⁹. Bu görüntüleme yöntemlerinden bir veya daha fazlası enfeksiyon tanısına yardımcı olmak için kullanılmasına rağmen, ekstra tıbbi ve cerrahi masraflardan kaçınmak için antibiyotiklerle tedavileri başlatmak için enfeksiyonla ilişkili pH varyasyonlarını erken tespit edemezler.

İmplantla ilişkili enfeksiyonları izlemek için bu çalışmada kullanılan görüntüleme sistemini kullanmanın temel avantajı, biyofilm mikroçevresi hakkındaki biyokimyasal bilgileri spektral bir referansla ortaya çıkarma yeteneğidir. Ana odak noktası enfekte bölgedeki pH’ı görüntülemek ve haritalamak olsa da, bu yöntem implantla ilişkili enfeksiyonlara özgü diğer biyobelirteçleri izlemek için değiştirilebilir. Böylece, XELCI enfeksiyonun patofizyolojisinin anlaşılmasını sağlar. Yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüleme, enfeksiyon büyüdükçe heterojenliğin haritalandırılmasını sağlar. Biyofilm oluşumunun meydana geldiği yüzeydeki pH, biyokimyasal değişiklikleri anlamak için çok önemlidir. Ayrıca, bakterilerin antibiyotiğe bağlı stres tepkileri nedeniyle diğer mikro çevre değişiklikleri de ortaya çıkabilir^10,11. Yüzeye özgü ve yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüleme sayesinde, biyofilm mikroortamı üzerindeki antibiyotik etkisi izlenebilir. Bu teknik, hedeflenen ilaç dağıtım deneyleri için biyofilm ortamını incelemek için de kullanılabilir. Hedeflenen düşük pH’lı ilaç salınımını veya pH’ı yükseltmeyi, daha yüksek pH’ta çalışmaya daha duyarlı hale getirmek için inceleyebiliriz.

Bu görüntüleme tekniğinin üç spesifik özelliği X-ışını çözünürlüğü, İmplant yüzey özgüllüğü ve kimyasal duyarlılıktır (Şekil 1A). Bu özellikler, ortopedik implantla ilişkili enfeksiyonların görüntülenmesinde mevcut görüntüleme teknikleri ile karşılaştırılabilir (Şekil 1B). X-ışınları ile ışınlandıktan sonra, implant yüzeyinde kaplanan fosfor parçacıkları, birkaç santimetre dokudan (biraz zayıflama olsa da) nüfuz edebilen kırmızı ve IR’ye yakın (NIR) ışık ^üretir12,13. Tablo 1, geliştirilen görüntüleme sisteminin bazı özelliklerini, biyofilmlerde veya doku yoluyla pH ölçmek için kullanılan diğer yollara kıyasla göstermektedir.

XELCI, Şekil 2’de gösterildiği gibi, X-ışını uyarımı ile kombinasyon halinde implante edilmiş tıbbi cihazların yakınında optik olarak yüksek uzamsal çözünürlüklü kimyasal bilgi elde etmek için yeni bir görüntüleme tekniğidir. Burada X-ışını uyarılabilir fosfor parçacıklarının seçici uyarılması ve optik tespiti kullanılır. İmplant, bir sintilatör parçacık tabakası üzerine pH’a duyarlı bir boya içeren polimer tabaka olmak üzere iki katmanla kaplanmıştır. Bir dizi odaklanmış X-ışını ışını implantı ışınladığında, sintilatör tabakası görünür ışık üretir (620 nm ve 700 nm). Üretilen bu ışık, çevredeki ortamın pH’ına bağlı olarak lüminesans spektrumunu modüle eden pH’a duyarlı tabakadan geçer. Düşük pH genellikle enfeksiyon ve biyofilm oluşumu ile ilişkilidir; Enfeksiyon ilerledikçe, pH fizyolojik pH’tan (pH 7.2) asidik (pH 7’den az) olarak değişir ve sensördeki pH boyası renk ve dolayısıyla emilim değiştirir. Lüminesans spektrumunun varyasyonu, pH 7 ve pH 4’te Bromokresol yeşil pH boyası için Şekil 2E’de gösterilmiştir. Doku ve kemik yoluyla iletilen ışık toplanır ve spektral oran pH’ı belirler. Bir pH görüntüsü oluşturmak için, odaklanmış X-ışını ışını, sintilatör filmindeki bir seferde bir noktayı ışınlar ve ışını numune boyunca nokta nokta tarar. Daha önce, bu teknik ortopedik implantların yüzeyindeki pH varyasyonunu görüntülemek için uygulandı^14,15 ve intramedüller kanaldaki pH varyasyonlarını kemik ve doku yoluyla izlemek için test edildi.

Aşağıdaki Şekil 3 , görüntüleme sisteminin bir şemasını göstermektedir. Görüntüleme sisteminin temel bileşenleri, poli kılcal optiklere sahip X-ışını uyarma kaynağı, iki fotoçarpan tüpüne bağlanan tek parçalı akrilik ışık kılavuzu, x, y ve z motorlu aşama (30 cm x 15 cm x 6 cm hareket) ve veri toplama için bağlanan bilgisayardır. X-ışını kaynağı, x,y,z aşaması ve toplama optikleri (dirsek, ışık kılavuzu, fotoçarpan tüpleri (PMT’ler)) X-ışını geçirmez muhafaza içindeyken, X-ışını kontrolörü, PMT’ler için güç kaynağı, veri toplama (DAQ) kartına bağlı fonksiyon üreteci ve bilgisayar dışarıda tutulur. Muhafaza ile kapının önü arasına yerleştirilen normalde açık anahtar olan bir basmalı düğme, bir kilitleme görevi görür. Kapı tamamen kapalı değilse (kilitleme anahtarı açıksa), X-ışını kaynağı açılmaz ve çalışma sırasında açılırsa X-ışını kaynağını otomatik olarak kapatır. Motorlar sürekli bir tarama yapabilir ve herhangi bir ayrı konuma taşınabilir. Y ekseni için tarama hızı genellikle 1-5 mm / s iken, x eksenindeki adım boyutu tipik olarak 150-2000 μm arasında seçilebilir. Parametreler, gerekli uzamsal çözünürlüğe bağlı olarak seçilebilir. Pozlama süreleri bile sürekli tarama boyunca tutarlı bir hız ile doğrulanır.

Odaklanmış X-ışını ışını, X-ışını lüminesans parçacıkları üzerinde ışınlandıktan sonra, üretilen ışık, çevreleyen pH’a bağlı olarak ışığı modüle ederek pH’a duyarlı filmden geçecektir. İletilen ışık bir doku ile etkileşime girer (kısmen saçılır ve emilir), doku kalınlığı arttıkça saçılma ve emilim yoluyla ışık zayıflaması artar. Koleksiyon optikleri, başlangıçta yansıtıcı bir alüminyum dirsek (90° büküm ve cilalı yansıtıcı iç yüzeye sahip) ile donatılmış tek parçalı çatallı akrilik ışık kılavuzu içerir. Bu, ışık ışık kılavuzuna ulaşır ulaşmaz ışığın toplanmasını sağlamak içindir. Bu eklemeler ışık toplama verimliliğini önemli ölçüde artırdı. Daha fazla ayrıntı için, Şekil 4 dirsek ve ışık kılavuzunun makine çizimlerini göstermektedir. 90° dirsek alüminyumdan işlendi ve iç yüzey ayna kaplamasına cilalandı ve ışık kılavuzu Akrilik ile işlendi. Ayrıca, yalnızca kırmızı ışığın geçmesini sağlamak için dirseğin başına geniş aralıklı uzun geçişli mavi ışık filtresi (350-450 nm ışığı engelleyen) taktık. Tek parçalı akrilik ışık kılavuzunun ucu, iki farklı PMT’ye yol açan iki akışa bölünür. PMT’ler, PMT’leri ~ 5 ° C’ye soğutmak için bir termoelektrik soğutucu ile temas halinde olan küçük, ışık geçirmez bir metal kutu içine alınmıştır. PMT’lerden birinin başında, yalnızca 700 nm ışığı ölçmek için dar aralıklı bir uzun geçirgen filtre (570-640 nm ışığı engelleyen ve 640-740 nm ışığı geçiren) takılıdır. Bu nedenle, 620 nm ve 700 nm ışık ayrı ayrı hesaplanabilir. PMT’ler foton sayma modunda ayarlanır ve tespit edilen her foton için transistör-transistör mantığı (TTL) darbeleri üretirler. Bir DAQ sistemi, USB iletişimini kullanarak darbeleri (doygunluk noktası saniyede 20 milyon darbe) sayar. Veriler işlendikten sonra iki ayrı yoğunluk haritası oluşturulur ve sinyal dalga boyu yoğunluğunun (620 nm) referans dalga boyu yoğunluğuna (700 nm) oranı dikkate alınarak nihai bir görüntü oluşturulur. Bu oran, toplama optiklerinin konumuna, X-ışını ışınlama yoğunluğuna ve doku kalınlığına büyük ölçüde bağlı olan toplam ışık toplama verimliliğindeki farklılıkları açıklar. Ek olarak, herhangi bir pH indikatör boyası olmadan uzamsal olarak ayrılmış bir referans bölgesi, dalga boyuna bağlı doku penetrasyonundan spektral bozulmayı açıklar. Görüntüleme sistemini kontrol etmek için grafik tabanlı bir programlama dili kullanılır ve işlemin temel bir akış şeması aşağıda gösterilmiştir. Bilgisayar, X-ışını denetleyicisi ve DAQ ünitesi hariç görüntüleme kurulumu, radyasyona maruz kalmayı en aza indirmek için güvenli bir X-ışını muhafazası içine alınmıştır.