Imaging chimico ad alta risoluzione spaziale delle infezioni associate all'impianto con luminescenza eccitata a raggi X Imaging chimico attraverso il tessuto

Negli Stati Uniti, circa 2 milioni di dispositivi di fissazione delle fratture vengono inseriti ogni anno e il 5% -10% di essi porta a infezioni associate all’impianto¹. Queste infezioni sono più difficili da trattare con antibiotici nelle fasi successive a causa dell’eterogeneità e della natura resistente agli antibiotici dei biofilm ^2,3. Se vengono diagnosticate precocemente, le infezioni possono essere trattate con antibiotici e sbrigliamento chirurgico per evitare costi medici aggiuntivi per un secondo intervento chirurgico per sostituire l’hardware nel sito di frattura trattato. La radiografia semplice e altre tecniche radiografiche avanzate sono applicate nella diagnosi di infezioni ortopediche associate a impianti, non unioni e complicanze correlate. Sebbene queste tecniche siano utilizzate frequentemente per acquisire informazioni strutturali dell’osso e del tessuto circostante presso l’impianto ortopedico, non sono in grado di fornire informazioni biochimiche nell’ambiente specifico. Pertanto, abbiamo sviluppato una nuova tecnica di imaging chimico a luminescenza eccitata a raggi X (XELCI) per l’imaging ad alta risoluzione di informazioni biochimiche in modo non invasivo nel sito dell’impianto. La diagnosi di infezioni ortopediche associate agli impianti viene comunemente effettuata con uno o una combinazione di mezzi diversi. Le osservazioni cliniche (dolore, gonfiore, arrossamento, secrezione della ferita, ecc.) suggeriscono i primi segni di infezione. Successivamente, vengono effettuati esperimenti radiologici e di laboratorio per confermare il fallimento della progressione della guarigione ossea e identificare l’organismo patogeno ^4,5. Tecniche di medicina nucleare come la tomografia computerizzata (TC), la risonanza magnetica (MRI) e metodi radionucleotidici come la tomografia computerizzata a emissione di fotoni singoli (SPECT) e la tomografia ad emissione di positroni (PET) sono in uso per una migliore visualizzazione dell’impianto infetto e dell’infezione associata ^6,7. La TC e la risonanza magnetica sono vantaggiose nel determinare rispettivamente la necrosi ossea e le anomalie dei tessuti molli, ma causano interferenze a distanza ravvicinata dagli impianti metallici⁸. Diverse metodologie a raggi X come SPECT e PET in combinazione con analiti marcati con radioisotopi come agenti di contrasto di imaging in vivo sono ampiamente utilizzate per diagnosticare l’osteomielite 2 associata all’impianto^. Le applicazioni attuali combinano sia i dati della scansione TC che i dati di etichettatura della SPECT o della PET per generare informazioni anatomiche⁹. Sebbene una o più di queste modalità di imaging siano utilizzate per aiutare la diagnosi dell’infezione, non possono rilevare precocemente le variazioni di pH associate all’infezione per iniziare i trattamenti con antibiotici per evitare spese mediche e chirurgiche extra.

Il vantaggio principale dell’utilizzo del sistema di imaging utilizzato in questo studio per il monitoraggio delle infezioni associate all’impianto è la sua capacità di rivelare informazioni biochimiche sul microambiente del biofilm con un riferimento spettrale. Sebbene l’obiettivo principale sia l’imaging e la mappatura del pH nel sito infetto, questo metodo può essere modificato per monitorare altri biomarcatori specifici per le infezioni associate all’impianto. Pertanto, XELCI consente di comprendere la fisiopatologia dell’infezione. L’imaging ad alta risoluzione spaziale consente di mappare l’eterogeneità man mano che l’infezione cresce. Il pH sulla superficie in cui si verifica la formazione del biofilm è molto importante per comprendere i cambiamenti biochimici. Inoltre, altri cambiamenti del microambiente possono verificarsi a causa di risposte allo stress correlate agli antibiotici da parte dei batteri^10,11. Grazie all’imaging specifico della superficie e ad alta risoluzione spaziale, è possibile monitorare l’effetto antibiotico sul microambiente del biofilm. La tecnica può anche essere utilizzata per studiare l’ambiente del biofilm per esperimenti mirati di somministrazione di farmaci. Possiamo studiare il rilascio mirato di farmaci a basso pH o l’aumento del pH per renderli più suscettibili a lavorare a pH più alti.

Tre caratteristiche specifiche di questa tecnica di imaging sono la risoluzione dei raggi X, la specificità della superficie dell’impianto e la sensibilità chimica (Figura 1A). Queste caratteristiche possono essere confrontate con le tecniche di imaging attualmente disponibili per l’imaging delle infezioni correlate agli impianti ortopedici (Figura 1B). Una volta irradiate con i raggi X, le particelle di fosforo rivestite sulla superficie dell’impianto generano luce rossa e vicina all’IR (NIR) che può penetrare attraverso alcuni centimetri di tessuto (anche se con una certa attenuazione)^12,13. La Tabella 1 mostra alcune delle caratteristiche del sistema di imaging sviluppato rispetto ad altri modi che sono stati utilizzati per misurare il pH nei biofilm o attraverso i tessuti.

XELCI è una nuova tecnica di imaging per acquisire informazioni chimiche ad alta risoluzione spaziale otticamente vicino a dispositivi medici impiantati in combinazione con l’eccitazione a raggi X, come mostrato nella Figura 2. Qui viene utilizzata l’eccitazione selettiva e la rilevazione ottica di particelle di fosforo eccitabili a raggi X. L’impianto è rivestito con due strati, uno strato polimerico incorporato in colorante sensibile al pH su uno strato di particelle scintillatrici. Una volta che una sequenza di fasci di raggi X focalizzati irradia l’impianto, lo strato scintillatore genera luce visibile (620 nm e 700 nm). Questa luce prodotta passa attraverso lo strato sensibile al pH modulando lo spettro di luminescenza a seconda del pH dell’ambiente circostante. Il basso pH è generalmente associato all’infezione e alla formazione di biofilm; man mano che l’infezione progredisce, il pH cambia da pH fisiologico (pH 7,2) ad acido (inferiore a pH 7) e il colorante pH nel sensore cambia colore e quindi assorbanza. La variazione dello spettro di luminescenza è mostrata nella Figura 2E per il colorante a pH verde Bromocresolo a pH 7 e pH 4. La luce trasmessa attraverso il tessuto e l’osso viene raccolta e il rapporto spettrale determina il pH. Per generare un’immagine del pH, il fascio di raggi X focalizzato irradia un punto alla volta nel film scintillatore e scansiona il fascio punto per punto attraverso il campione. In precedenza, questa tecnica è stata applicata per visualizzare la variazione del pH sulla superficie degli impianti ortopedici^14,15 e l’ho testata per monitorare le variazioni di pH nel canale intramidollare attraverso ossa e tessuti.

La figura 3 seguente mostra uno schema del sistema di imaging. I componenti di base del sistema di imaging sono la sorgente di eccitazione a raggi X con ottica poli capillare, una guida di luce acrilica monopezzo che si collega a due tubi fotomoltiplicatori, lo stadio motorizzato x, y e z (corsa 30 cm x 15 cm x 6 cm) e il computer collegato per l’acquisizione dei dati. La sorgente di raggi X, lo stadio x, y, z e le ottiche di raccolta (gomito, guida luminosa, tubi fotomoltiplicatori (PMT)) sono nell’involucro a prova di raggi X, mentre il controller a raggi X, la fonte di alimentazione per PMT, il generatore di funzioni collegato alla scheda di acquisizione dati (DAQ) e il computer sono tenuti all’esterno. Un pulsante, normalmente aperto, posto tra l’involucro e la parte anteriore della porta funge da interblocco. Se la porta non è completamente chiusa (l’interruttore di interblocco è aperto), la sorgente di raggi X non si accende e spegne automaticamente la sorgente di raggi X se viene aperta durante il funzionamento. I motori possono eseguire una scansione continua e possono essere spostati in qualsiasi posizione discreta. La velocità di scansione per l’asse y è solitamente 1-5 mm/s, mentre la dimensione del passo sull’asse x può essere scelta tipicamente tra 150-2000 μm. I parametri possono essere scelti in base alla risoluzione spaziale richiesta. Anche i tempi di esposizione sono confermati da una velocità costante durante una scansione continua.

Una volta che il fascio di raggi X focalizzato viene irradiato sulle particelle di luminescenza dei raggi X, la luce generata passerà attraverso la pellicola sensibile al pH modulando la luce a seconda del pH circostante. La luce trasmessa interagirà (si diffonderà e assorbirà parzialmente) con un tessuto, mentre l’attenuazione della luce per diffusione e assorbimento aumenterà all’aumentare dello spessore del tessuto. L’ottica della collezione include una guida luminosa in acrilico biforcato monopezzo dotata di un gomito in alluminio riflettente (con curvatura a 90° e superficie interna riflettente lucida) all’inizio. Questo per garantire che la luce venga collimata non appena la luce raggiunge la guida luminosa. Queste aggiunte hanno migliorato significativamente l’efficienza di raccolta della luce. Per ulteriori dettagli, la Figura 4 mostra i disegni della macchina del gomito e della guida luminosa. Il gomito a 90° è stato lavorato in alluminio con la superficie interna lucidata a specchio e la guida luminosa è stata lavorata con acrilico. Abbiamo anche collegato un filtro luce blu passa-lungo ad ampio raggio (che blocca la luce a 350-450 nm) all’inizio del gomito per garantire che solo la luce rossa passi attraverso. L’estremità della guida di luce acrilica monopezzo si biforca in due flussi che portano a due diversi PMT. I PMT sono racchiusi in una piccola scatola metallica a tenuta di luce che è in contatto con un dispositivo di raffreddamento termoelettrico per raffreddare i PMT a ~ 5 ° C. All’inizio di uno dei PMT, un filtro passa-lungo a raggio stretto (bloccando la luce a 570-640 nm e passando la luce a 640-740 nm) è collegato per misurare solo la luce a 700 nm. Pertanto, la luce da 620 nm e 700 nm può essere calcolata separatamente. I PMT sono impostati in modalità di conteggio dei fotoni e generano impulsi logici transistor-transistor (TTL) per ogni fotone rilevato. Un sistema DAQ conta gli impulsi (punto di saturazione 20 milioni di impulsi al secondo) utilizzando la comunicazione USB. Dopo l’elaborazione dei dati vengono generate due mappe di intensità separate e viene creata un’immagine finale considerando il rapporto tra l’intensità della lunghezza d’onda del segnale (620 nm) e l’intensità della lunghezza d’onda di riferimento (700 nm). Questo rapporto tiene conto delle differenze nell’efficienza totale di raccolta della luce, che dipendono fortemente dalla posizione dell’ottica di raccolta, dall’intensità dell’irradiazione a raggi X e dallo spessore del tessuto. Inoltre, una regione di riferimento spazialmente separata senza alcun colorante indicatore di pH tiene conto della distorsione spettrale dovuta alla penetrazione tissutale dipendente dalla lunghezza d’onda. Per il controllo del sistema di imaging viene utilizzato un linguaggio di programmazione basato su grafica e di seguito viene illustrato un diagramma di flusso di base dell’operazione. La configurazione delle immagini, ad eccezione del computer, del controller a raggi X e dell’unità DAQ, è racchiusa in un involucro a raggi X sicuro per ridurre al minimo l’esposizione alle radiazioni.