הדמיה כימית ברזולוציה מרחבית גבוהה של זיהומים הקשורים לשתלים עם צילום רנטגן מעורר לומינסנציה הדמיה כימית דרך רקמות
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אופטי ברזולוציה גבוהה של מידע כימי סביב מכשירים רפואיים מושתלים עם הדמיה כימית של הארה מעוררת קרני רנטגן (XELCI). טכניקת הדמיה חדשנית זו פותחה במעבדה שלנו ומאפשרת לחקור ביוכימיה של זיהומים הקשורים לשתלים.
Abstract
זיהומים מיקרוביאליים הקשורים למכשירים רפואיים מושתלים מהווים דאגה מרכזית בכשל בקיבוע שברים. אבחון מוקדם של זיהום כזה יאפשר מיגור מוצלח עם אנטיביוטיקה ללא עלות נוספת לניתוח שני. כאן, אנו מתארים את XELCI כטכניקה עם רזולוציית רנטגן גבוהה, ספציפיות השתל ורגישות כימית לתמונות לא פולשניות של ריכוזים כימיים בקרבת פני השטח של מכשירים רפואיים מושתלים. המכשירים מצופים במשטחי דיווח כימיים. משטח מגיב כימית זה מורכב משתי שכבות המצופות במכשיר רפואי מושתל; שכבה רגישה ל-pH (ברומותימול כחול או ברומוקרסול ירוק משולב הידרוג’ל) המצופה מעל שכבת נצנץ פולט אור אדום (Gd 2 O2S: Eu) לצורך ניטור. קרן רנטגן ממוקדת מקרינה נקודה על השתל, והאור האדום שנוצר על ידי הנצנץ (עם פסגות של 620 ננומטר ו-700 ננומטר) מועבר דרך שכבת החישה אשר משנה את היחס הספקטרלי בהתאם ל-pH. תמונה נוצרת על ידי סריקת קרן הרנטגן על פני השתל ומדידת היחס הספקטרלי של האור העובר דרך הרקמה נקודה אחר נקודה. השתמשנו בטכניקת הדמיה זו לניטור זיהומים הקשורים לשתלים בעבר על פני העצם של עצם הירך באמצעות חיישן לוחית מושתלת שונה. כעת אנו חוקרים שינויים ב- pH המתרחשים מזיהומים במוט התוך-מדולרי הטיביאלי. שני סוגים שונים של עיצובי מוטות תוך-מדולריים משמשים במחקרי ארנבים לפני פיילוט, ולמדנו שניתן להשתמש בטכניקת XELCI כדי לעקוב אחר שינויים כימיים המתרחשים לא רק על פני העצם אלא גם בתוך העצם. לפיכך, זה מאפשר הדמיית pH מקומית לא פולשנית, ברזולוציה מרחבית גבוהה, ברקע נמוך, כדי לחקור ביוכימיה של זיהום הקשור לשתלים.
Introduction
בארה”ב מוחדרים מדי שנה כ-2 מיליון מכשירים לקיבוע שברים, ו-5%-10% מהם מובילים לזיהומים הקשורים לשתל1. זיהומים אלה קשים יותר לטיפול באנטיביוטיקה בשלבים מאוחרים יותר בשל ההטרוגניות והאופי העמיד לאנטיביוטיקה של הביופילמים 2,3. אם הם מאובחנים מוקדם, זיהומים ניתן לטפל עם אנטיביוטיקה והטרייה כירורגית כדי למנוע עלויות רפואיות נוספות עבור ניתוח שני להחלפת חומרה באתר השבר שטופל. רדיוגרפיה רגילה וטכניקות רדיוגרפיות מתקדמות אחרות מיושמות באבחון זיהומים אורתופדיים הקשורים לשתלים, אי-איגודים וסיבוכים קשורים. למרות שטכניקות אלה משמשות לעתים קרובות להשגת מידע מבני של העצם והרקמה שמסביב בשתל האורתופדי, הן אינן מסוגלות לספק מידע ביוכימי בסביבה הספציפית. לפיכך, פיתחנו טכניקה חדשנית של הדמיה כימית מעוררת קרני רנטגן (XELCI) להדמיה ברזולוציה גבוהה של מידע ביוכימי באופן לא פולשני באתר השתל. אבחון זיהומים אורתופדיים הקשורים לשתלים מתבצע בדרך כלל על ידי אחד או שילוב של אמצעים שונים. תצפיות קליניות (כאב, נפיחות, אדמומיות, הפרשות פצע וכו ‘) מצביעות על סימנים ראשונים של זיהום. מאוחר יותר, ניסויים רדיולוגיים ומעבדה מתבצעים כדי לאשר את כישלון התקדמות ריפוי העצם ולזהות את האורגניזם הפתוגני 4,5. טכניקות רפואיות גרעיניות כגון טומוגרפיה ממוחשבת (CT), דימות תהודה מגנטית (MRI) ושיטות רדיונוקלאוטידים כגון טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT) וטומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) נמצאות בשימוש להדמיה טובה יותר של השתל הנגוע והזיהום הקשור 6,7. CT ו- MRI הם יתרון בקביעת נמק עצם והפרעות ברקמות רכות, בהתאמה, אך גורמים להפרעות במרחק קרוב לשתלי המתכת8. מתודולוגיות רנטגן שונות כגון SPECT ו- PET בשילוב עם אנליטים המסומנים ברדיואיזוטופים כמו חומרי ניגוד בהדמיה in vivo נמצאים בשימוש נרחב לאבחון אוסטאומיאליטיס2 הקשור לשתלים. היישומים הנוכחיים משלבים הן נתונים מסריקת CT והן נתוני תיוג מ- SPECT או PET כדי להפיק מידע אנטומי9. למרות שאחת או יותר משיטות הדמיה אלה משמשות לסיוע באבחון זיהום, הן אינן יכולות לזהות את וריאציות ה- pH הקשורות לזיהום מוקדם כדי להתחיל את הטיפולים באנטיביוטיקה כדי למנוע הוצאות רפואיות וכירורגיות נוספות.
היתרון העיקרי של שימוש במערכת ההדמיה המשמשת במחקר זה לניטור זיהומים הקשורים לשתלים הוא יכולתה לחשוף מידע ביוכימי על מיקרו-סביבה של ביופילם עם התייחסות ספקטרלית. למרות שההתמקדות העיקרית היא בהדמיה ומיפוי pH באתר הנגוע, ניתן לשנות שיטה זו כדי לנטר סמנים ביולוגיים אחרים ספציפיים לזיהומים הקשורים לשתלים. לכן, XELCI מאפשר להבין את הפתופיזיולוגיה של הזיהום. הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה מאפשרת מיפוי הטרוגניות ככל שהזיהום גדל. pH על פני השטח שבו מתרחשת היווצרות הביופילם חשוב מאוד להבנת שינויים ביוכימיים. כמו כן, שינויים אחרים במיקרו-סביבה יכולים להתרחש עקב תגובות עקה הקשורות לאנטיביוטיקה על ידי חיידקים10,11. בשל הדמיה ספציפית לפני השטח וברזולוציה מרחבית גבוהה, ניתן לנטר את ההשפעה האנטיביוטית על מיקרו-סביבה של ביופילם. הטכניקה יכולה לשמש גם לחקר סביבת הביופילם לניסויים ממוקדים בהעברת תרופות. אנו יכולים לחקור שחרור ממוקד של תרופות עם pH נמוך או העלאת pH כדי להפוך אותם לרגישים יותר לעבודה ב- pH גבוה יותר.
שלושה מאפיינים ספציפיים של טכניקת הדמיה זו הם רזולוציית קרני רנטגן, ספציפיות פני השטח של השתל ורגישות כימית (איור 1A). ניתן להשוות את המאפיינים האלה עם שיטות הדמיה הזמינות כיום עבור הדמיה של זיהומים אורתופדיים הקשורים לשתלים (איור 1B). לאחר הקרנת קרני רנטגן, חלקיקי זרחן המצופים על פני השטח של השתל מייצרים אור אדום וקרוב לאינפרא-אדום (NIR) שיכול לחדור דרך כמה סנטימטרים של רקמה (אם כי עם הנחתה מסוימת)12,13. טבלה 1 מציגה חלק מהתכונות של מערכת הדימות שפותחה בהשוואה לדרכים אחרות ששימשו למדידת pH בביופילמים או באמצעות רקמות.
XELCI היא טכניקת הדמיה חדשנית להשגת מידע כימי ברזולוציה מרחבית גבוהה באופן אופטי ליד מכשירים רפואיים מושתלים בשילוב עם עירור קרני רנטגן, כפי שמוצג באיור 2. כאן נעשה שימוש בעירור סלקטיבי ובזיהוי אופטי של חלקיקי זרחן מעוררי קרני רנטגן. השתל מצופה בשתי שכבות, שכבת פולימר רגישה ל-pH משולבת על גבי שכבה של חלקיקי נצנצים. ברגע שרצף של קרני רנטגן ממוקדות מקרין את השתל, שכבת הנצנוץ מייצרת אור נראה (620 ננומטר ו-700 ננומטר). אור מופק זה עובר דרך שכבה רגישה ל- pH ומווסת את ספקטרום ההארה בהתאם ל- pH של הסביבה. pH נמוך קשור בדרך כלל עם זיהום והיווצרות ביופילם; ככל שהזיהום מתקדם, ה- pH משתנה מ- pH פיזיולוגי (pH 7.2) לחומצי (פחות מ- pH 7), וצבע ה- pH בחיישן משנה צבע וכך נספג. השונות של ספקטרום ההארה מוצגת באיור 2E עבור צבע pH ירוק ברומוקרסול ב-pH 7 וב-pH 4. האור המועבר דרך הרקמה והעצם נאסף והיחס הספקטרלי קובע pH. כדי ליצור תמונת pH, קרן הרנטגן הממוקדת מקרינה נקודה בכל פעם בסרט הצילום המנצנץ וסורקת את הקרן נקודה אחר נקודה על פני הדגימה. בעבר, טכניקה זו יושמה על וריאציה pH תמונה על פני השטח של שתלים אורתופדיים14,15 ובדקו אותו כדי לפקח על שינויים pH בתעלה intramedullary דרך עצם ורקמות.
איור 3 להלן מציג סכמה של מערכת ההדמיה. המרכיבים הבסיסיים של מערכת ההדמיה הם מקור עירור קרני רנטגן עם אופטיקה פולי נימית, מדריך אור אקרילי מקשה אחת המתחבר לשני צינורות מכפיל אור, השלב הממונע x, y ו- z (מהלך של 30 ס”מ x 15 ס”מ x 6 ס”מ) והמחשב המחובר לאיסוף נתונים. מקור קרני הרנטגן, שלב x,y,z ואופטיקת איסוף (מרפק, מדריך אור, צינורות מכפיל אור (PMTs)) נמצאים במארז חסין קרני רנטגן, בעוד בקר רנטגן, מקור כוח עבור PMTs, מחולל פונקציות המחובר ללוח רכישת הנתונים (DAQ) והמחשב נשמרים בחוץ. כפתור לחיצה, מתג פתוח בדרך כלל, הממוקם בין המתחם לחזית הדלת משמש כמנעול. אם הדלת אינה סגורה לחלוטין (מתג האינטרלוק פתוח), מקור הרנטגן לא יופעל, והוא יכבה אוטומטית את מקור הרנטגן אם הוא נפתח במהלך הפעולה. המנועים יכולים לבצע סריקה רציפה, כמו גם ניתן להעביר אותם לכל מקום נפרד. מהירות הסריקה עבור ציר y היא בדרך כלל 1-5 מ”מ לשנייה, בעוד שניתן לבחור את גודל הצעד על ציר ה-x בדרך כלל בין 150-2000 מיקרומטר. ניתן לבחור את הפרמטרים בהתאם לרזולוציה המרחבית הנדרשת. אפילו זמני החשיפה מאושרים על ידי מהירות עקבית לאורך סריקה רציפה.
ברגע שקרן הרנטגן הממוקדת מוקרנת על חלקיקי ההארה של קרני הרנטגן, האור שנוצר יעבור דרך הסרט הרגיש ל- pH על ידי אפנון האור בהתאם ל- pH שמסביב. האור המועבר יתקשר (יתפזר ויספג חלקית) עם רקמה, ואילו היחלשות האור על ידי פיזור ובליעה תגדל ככל שעובי הרקמה יגדל. אופטיקת הקולקציה כוללת מדריך אור אקרילי מקשה אחת המצויד במרפק אלומיניום מחזיר אור (עם כיפוף של 90 מעלות ומשטח פנימי מחזיר אור מלוטש) בתחילתו. זאת כדי להבטיח שהאור יתנגש ברגע שהאור יגיע למדריך האור. תוספות אלו שיפרו משמעותית את יעילות איסוף האור. לפרטים נוספים, איור 4 מראה את שרטוטי המכונה של המרפק ומדריך האור. מרפק ה-90° יוצר במכונה מאלומיניום כאשר המשטח הפנימי לוטש לגימור מראה ומדריך האור יוצר במכונה אקריליק. חיברנו גם מסנן אור כחול ארוך טווח (חוסם אור 350-450 ננומטר) בתחילת המרפק כדי להבטיח שרק אור אדום יעבור. קצהו של מדריך האור האקרילי העשוי מקשה אחת מתפצל לשני זרמים המובילים לשני PMT שונים. PMTs סגורים בקופסת מתכת קטנה אטומה לאור כי הוא במגע עם מצנן תרמואלקטרי כדי לקרר את PMTs ל ~ 5 ° C. בתחילת אחד ה-PMTs, מסנן ארוך טווח צר (חוסם אור 570-640 ננומטר ועובר אור 640-740 ננומטר) מחובר למדידת אור 700 ננומטר בלבד. לכן, אור 620 ננומטר ו 700 ננומטר ניתן לחשב בנפרד. ה-PMTs מוגדרים במצב ספירת פוטונים, והם מייצרים פולסים של לוגיקת טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL) עבור כל פוטון שזוהה. מערכת DAQ סופרת את הפולסים (נקודת רוויה, 20 מיליון פולסים בשנייה) באמצעות תקשורת USB. שתי מפות עוצמה נפרדות נוצרות לאחר עיבוד הנתונים, ותמונה סופית נוצרת על ידי התחשבות ביחס בין עוצמת אורך גל האות (620 ננומטר) לעוצמת אורך גל הייחוס (700 ננומטר). יחס זה מסביר הבדלים ביעילות איסוף האור הכוללת, התלויים מאוד במיקום אופטיקת האיסוף, עוצמת הקרנת הרנטגן ועובי הרקמות. בנוסף, אזור ייחוס מופרד מרחבית ללא כל צבע מחוון pH מסביר עיוות ספקטרלי מחדירת רקמה תלוית אורך גל. שפת תכנות מבוססת גרפיקה משמשת לשליטה במערכת ההדמיה, ותרשים זרימה בסיסי של הפעולה מוצג להלן. מערך ההדמיה, למעט המחשב, בקר הרנטגן ויחידת DAQ, מוקף במארז רנטגן בטוח כדי למזער את החשיפה לקרינה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להיות מסוגלים לזהות ולחקור זיהומים אורתופדיים הקשורים לשתלים מוקדם כדי למנוע סיבוכים של אוסטאומיאליטיס ופרוצדורות כירורגיות משניות, הצגנו את XELCI כטכניקת הדמיה פונקציונלית חדשנית. זה דומה עם הטכניקות הזמינות כיום לניטור pH באמצעות רקמות.
בעת מיקום הדגימה להדמיה, אנו מש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לאוניברסיטת קלמסון, COMSET ו-Clemson SC BioCRAFT. מערך XELCI פותח בתחילה במימון NSF CAREER CHE 12255535 ומאוחר יותר על ידי NIH NIAMS R01 AR070305-01.
Materials
| 90 degree elbow | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| Bromo Cresol Green | Sigma-Aldrich | 45ZW10 | |
| Bromo Thymol Blue | Sigma | 76-59-5 | |
| ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate | Pollock industries, White River, VT, USA | TCP 50 | |
| Ethanol | Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051 |
64-17-5 | |
| Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm | Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England | UKL63/N-R1 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, TX | ||
| Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis) | Motion Control, Smithtown, NY, USA | AT10-60 | |
| National instruments c-DAQ 9171 | National Instruments, Austin, TX | NI cDAQ™-9171 | |
| One piece acrylic light guide | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| pH 4 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5024 | |
| pH 8 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5060 | |
| Phosphate Buffer Solution | MP Biomedicals, Irvine, CA. USA | 2810305 | |
| Photo multiplier tubes Model P25PC-16 | SensTech, Surrey, UK | Model P25PC-16 | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ATCC 25923 | |
| Tryptic Soy Agar | Teknova, Hollister, CA, USA | T0520 | |
| Tryptic Soy Broth | EMD Millipore, Burlington, MA, USA | 1005255000 | |
| X-ray source-iMOXS | Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany | ||
| X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel | Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA | LTS300 and LTS150 |
References
- Arciola, C. R., Alvi, F. I., An, Y. H., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infection and infection resistant materials: A mini review. International Journal of Artificial Organs. 28 (11), 1119-1125 (2005).
- Renick, P., Tang, L., Li, B., Moriarty, T. F., Webster, T., Xing, M. Device-related infections. Racing for the Surface. , 171-188 (2020).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Metsemakers, W. J., et al. Fracture-related infection: A consensus on definition from an international expert group. Injury. 49 (3), 505-510 (2018).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infections: Adhesion, biofilm formation and immune evasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (7), 397-409 (2018).
- Polvoy, I., Flavell, R. R., Rosenberg, O. S., Ohliger, M. A., Wilson, D. M. Nuclear Imaging of Bacterial Infection: The State of the Art and Future Directions. Journal of Nuclear Medicine. 61 (12), 1708-1716 (2020).
- vander Bruggen, W., Bleeker-Rovers, C. P., Boerman, O. C., Gotthardt, M., Oyen, W. J. G. PET and SPECT in Osteomyelitis and Prosthetic Bone and Joint Infections: A Systematic Review. Seminars in Nuclear Medicine. 40 (1), 3-15 (2010).
- Trampuz, A., Zimmerli, W. Diagnosis and Treatment of infections associated with fracture-fixation devices. Injury. 37 (2), 59-66 (2006).
- Ady, J., Fong, Y. Imaging for infection: From visualization of inflammation to visualization of microbes. Surgical Infections. 15 (6), 700-707 (2014).
- Truong-Bolduc, Q. C., et al. Implication of the NorB Efflux pump in the adaptation of Staphylococcus Aureus to growth at acid pH and in resistance to Moxifloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3214-3219 (2011).
- Hengge-Aronis, R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the σS (RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 373-395 (2002).
- Gao, R., Yan, D. Molecular phosphors for x-ray detection. Science Bulletin. 67 (10), 1015-1017 (2022).
- Gao, R., Fang, X., Yan, D. Recent developments in stimuli-responsive luminescent films. Journal of Materials Chemistry C. 7 (12), 3399-3412 (2019).
- Uzair, U., et al. Conformal coating of orthopedic plates with x-ray scintillators and ph indicators for x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (47), 52343-52353 (2020).
- Uzair, U., Benza, D., Behrend, C. J., Anker, J. N. Noninvasively imaging pH at the surface of implanted orthopedic devices with x-ray excited luminescence chemical imaging. ACS Sensors. 4 (9), 2367-2374 (2019).
- Begot, C., Desnier, I., Daudin, J. D., Labadie, J. C., Lebert, A. Recommendations for calculating growth parameters by optical density measurements. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 225-232 (1996).
- Giering, K., Minet, O., Lamprecht, I., Müller, G. Review of thermal properties of biological tissues. Proceedings of SPIE – The International Society for Optical Engineering. , 45-65 (1995).
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Pogue, B. W., Leblond, F., Krishnaswamy, V., Paulsen, K. D. Radiologic and Near-Infrared/Optical Spectroscopic Imaging: Where Is the Synergy. American Journal of Roentgenology. 195 (2), 321-332 (2010).
- Ryan, S. G., et al. Imaging of X-ray-excited emissions from quantum dots and biological tissue in whole mouse. Scientific Reports. 9 (1), 19223 (2019).
- Yang, Y., Wang, K. -. Z., Yan, D. Ultralong persistent room temperature phosphorescence of metal coordination polymers exhibiting reversible pH-responsive emission. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (24), 15489-15496 (2016).
- Chen, H., Rogalski, M. M., Anker, J. N. Advances in functional X-ray imaging techniques and contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (39), 13469 (2012).
- Allan, V. J. M., Macaskie, L. E., Callow, M. E. Development of a pH gradient within a biofilm is dependent upon the limiting nutrient. Biotechnology letters. 21 (5), 407-413 (1999).
- Wang, Z., Deng, H., Chen, L., Xiao, Y., Zhao, F. In situ measurements of dissolved oxygen, pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes. Bioresource Technology. 132, 387-390 (2013).
- Xiao, Y., et al. In situ probing the effect of potentials on the microenvironment of heterotrophic denitrification biofilm with microelectrodes. Chemosphere. 93 (7), 1295-1130 (2013).
- Nakata, E., et al. A novel strategy to design latent ratiometric fluorescent pH probes Based on self-assembled SNARF derivatives. RSC Adv. 2014 (4), 348-357 (2014).
- Villano, D., et al. A fast multislice sequence for 3D MRI-CEST pH. Magnetic Resonance in Medicine. 85 (3), 1335-1349 (2021).
