Hoge ruimtelijke resolutie chemische beeldvorming van implantaat-geassocieerde infecties met röntgen geëxciteerde luminescentie chemische beeldvorming door weefsel

In de Verenigde Staten worden jaarlijks ongeveer 2 miljoen fractuurfixatieapparaten ingebracht en 5% -10% van hen leidt tot implantaatgerelateerde infecties¹. Deze infecties zijn moeilijker te behandelen met antibiotica in latere stadia vanwege de heterogeniteit en antibioticaresistente aard van de biofilms ^2,3. Als ze vroeg worden gediagnosticeerd, kunnen infecties worden behandeld met antibiotica en chirurgisch debridement om extra medische kosten te voorkomen voor een tweede operatie om hardware op de behandelde fractuurplaats te vervangen. Gewone radiografie en andere geavanceerde radiografische technieken worden toegepast bij de diagnose van orthopedische implantaat-geassocieerde infecties, niet-vakbonden en gerelateerde complicaties. Hoewel deze technieken vaak worden gebruikt om structurele informatie van het omliggende bot en weefsel bij het orthopedisch implantaat te verkrijgen, zijn ze niet in staat om biochemische informatie te verstrekken in de specifieke omgeving. Daarom ontwikkelden we een nieuwe X-ray excited luminescence chemical imaging (XELCI) techniek voor hoge resolutie beeldvorming van biochemische informatie niet-invasief op de implantaatplaats. Diagnose van orthopedische implantaat-geassocieerde infecties wordt vaak uitgevoerd door een of een combinatie van verschillende middelen. Klinische observaties (pijn, zwelling, roodheid, wondafscheiding, enz.) suggereren de eerste tekenen van infectie. Later worden radiologische en laboratoriumexperimenten uitgevoerd om het falen van de progressie van botgenezing te bevestigen en het pathogene organisme te identificeren ^4,5. Nucleaire medische technieken zoals computertomografie (CT), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en radionucleotidemethoden zoals Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) en Positron Emission Tomography (PET) zijn in gebruik voor een betere visualisatie van het geïnfecteerde implantaat en de bijbehorende infectie ^6,7. CT en MRI zijn voordelig bij het bepalen van respectievelijk botnecrose en wekedelenafwijkingen, maar veroorzaken interferenties op korte afstand van de metalen implantaten⁸. Verschillende röntgenmethoden zoals SPECT en PET in combinatie met radio-isotoop-gelabelde analyten als in vivo beeldvormende contrastmiddelen worden op grote schaal gebruikt om implantaat-geassocieerde osteomyelitis² te diagnosticeren. Huidige toepassingen combineren zowel gegevens van CT-scans als etiketteringsgegevens van SPECT of PET om anatomische informatie te genereren⁹. Hoewel een of meer van deze beeldvormingsmodaliteiten worden gebruikt om de diagnose van infecties te helpen, kunnen ze de pH-variaties die gepaard gaan met infectie niet vroegtijdig detecteren om de behandelingen met antibiotica te starten om extra medische en chirurgische kosten te voorkomen.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van het beeldvormingssysteem dat in deze studie wordt gebruikt voor het monitoren van implantaat-geassocieerde infecties is het vermogen om biochemische informatie over de biofilmmicro-omgeving te onthullen met een spectrale referentie. Hoewel de nadruk ligt op het in kaart brengen van de pH op de geïnfecteerde plaats, kan deze methode worden gewijzigd om andere biomarkers te controleren die specifiek zijn voor implantaat-geassocieerde infecties. XELCI maakt het dus mogelijk om de pathofysiologie van de infectie te begrijpen. De hoge ruimtelijke resolutie beeldvorming maakt het mogelijk om heterogeniteit in kaart te brengen naarmate de infectie groeit. pH aan het oppervlak waar de biofilmvorming plaatsvindt, is erg belangrijk voor het begrijpen van biochemische veranderingen. Ook kunnen andere micro-omgevingsveranderingen optreden als gevolg van antibiotica-gerelateerde stressreacties door bacteriën^10,11. Door oppervlaktespecifieke en hoge ruimtelijke resolutie beeldvorming kan het antibiotische effect op de biofilm micro-omgeving worden gemonitord. De techniek kan ook worden gebruikt om de biofilmomgeving te bestuderen voor gerichte medicijnafgifte-experimenten. We kunnen gerichte lage pH-medicijnafgifte of het verhogen van de pH bestuderen om ze vatbaarder te maken voor werken bij een hogere pH.

Drie specifieke kenmerken van deze beeldvormingstechniek zijn röntgenresolutie, specificiteit van het implantaatoppervlak en chemische gevoeligheid (figuur 1A). Deze kenmerken kunnen worden vergeleken met de momenteel beschikbare beeldvormende technieken voor het afbeelden van orthopedische implantaatgerelateerde infecties (figuur 1B). Eenmaal bestraald met röntgenstralen, genereren fosfordeeltjes die op het implantaatoppervlak zijn gecoat rood en bijna-IR (NIR) licht dat door een paar centimeter weefsel kan dringen (zij het met enige verzwakking)^12,13. Tabel 1 toont enkele van de kenmerken van het ontwikkelde beeldvormingssysteem in vergelijking met andere manieren die zijn gebruikt om de pH in biofilms of door weefsel te meten.

XELCI is een nieuwe beeldvormingstechniek om chemische informatie met een hoge ruimtelijke resolutie optisch te verkrijgen in de buurt van geïmplanteerde medische hulpmiddelen in combinatie met röntgenexcitatie, zoals weergegeven in figuur 2. Hier wordt gebruik gemaakt van de selectieve excitatie en optische detectie van röntgenprikkelbare fosfordeeltjes. Het implantaat is gecoat met twee lagen, een pH-gevoelige kleurstof opgenomen polymeerlaag over een laag scintillatordeeltjes. Zodra een reeks gefocusseerde röntgenstralen het implantaat bestraalt, genereert de scintillatorlaag zichtbaar licht (620 nm en 700 nm). Dit geproduceerde licht passeert de pH-gevoelige laag en moduleert het luminescentiespectrum afhankelijk van de pH van de omgeving. Lage pH wordt over het algemeen geassocieerd met infectie en biofilmvorming; naarmate de infectie vordert, verandert de pH van fysiologische pH (pH 7,2) naar zuur (minder dan pH 7) en verandert de pH-kleurstof in de sensor van kleur en dus absorptie. De variatie van het luminescentiespectrum is weergegeven in figuur 2E voor bromocresolgroene pH-kleurstof bij pH 7 en pH 4. Het doorgelaten licht door weefsel en bot wordt opgevangen en de spectrale verhouding bepaalt de pH. Om een pH-beeld te genereren, bestraalt de gefocusseerde röntgenbundel punt voor punt in de scintillatorfilm en scant de bundel punt voor punt over het monster. Eerder werd deze techniek toegepast op beeld-pH-variatie op het oppervlak van de orthopedische implantaten^14,15 en hebben deze getest om pH-variaties in het intramedullaire kanaal door bot en weefsel te volgen.

Figuur 3 hieronder toont een schema van het beeldvormingssysteem. Basiscomponenten van het beeldvormingssysteem zijn de röntgenexcitatiebron met polycapillaire optiek, een acryllichtgeleider uit één stuk die verbinding maakt met twee fotomultiplicatorbuizen, de x-, y- en z-gemotoriseerde trap (30 cm x 15 cm x 6 cm veerweg) en de computer die is aangesloten voor gegevensverzameling. De röntgenbron, x,y,z-fase en verzameloptiek (elleboog, lichtgeleider, fotomultiplicatorbuizen (PMT’s)) bevinden zich in de röntgenbestendige behuizing, terwijl de röntgencontroller, stroombron voor PMT’s, functiegenerator aangesloten op het data-acquisitiebord (DAQ) en de computer buiten worden gehouden. Een drukknop, normaal gesproken open schakelaar, geplaatst tussen de behuizing en de voorkant van de deur dient als een vergrendeling. Als de deur niet volledig gesloten is (de vergrendelingsschakelaar is open), wordt de röntgenbron niet ingeschakeld en wordt de röntgenbron automatisch uitgeschakeld als deze tijdens het gebruik wordt geopend. De motoren kunnen een continue scan uitvoeren en kunnen naar elke discrete locatie worden verplaatst. De scansnelheid voor de y-as is meestal 1-5 mm /s, terwijl de stapgrootte op de x-as meestal kan worden gekozen van 150-2000 μm. De parameters kunnen worden gekozen afhankelijk van de vereiste ruimtelijke resolutie. Zelfs belichtingstijden worden bevestigd door een consistente snelheid gedurende een continue scan.

Zodra de gefocusseerde röntgenstraal is bestraald op de röntgenluminescentiedeeltjes, zal het gegenereerde licht door de pH-gevoelige film gaan door het licht te moduleren afhankelijk van de omringende pH. Het doorgelaten licht zal interageren (verstrooien en gedeeltelijk absorberen) met een weefsel, terwijl de lichtverzwakking door verstrooiing en absorptie zal toenemen naarmate de weefseldikte toeneemt. De collectieoptiek omvat een uit één stuk gespleten acryllichtgeleider uitgerust met een reflecterende aluminium elleboog (met een 90 ° bocht en een gepolijst reflecterend binnenoppervlak) aan het begin. Dit is om ervoor te zorgen dat het licht wordt gecollimeerd zodra het licht de lichtgeleider bereikt. Deze toevoegingen verbeterden de efficiëntie van de lichtopvang aanzienlijk. Voor meer details toont figuur 4 de machinetekeningen van de elleboog en de lichtgeleider. De 90° elleboog werd uit aluminium gefreesd met het interne oppervlak gepolijst tot een spiegelafwerking en de lichtgeleider werd bewerkt met acryl. We hebben ook een breed bereik long-pass blauw lichtfilter (dat 350-450 nm licht blokkeert) aan het begin van de elleboog bevestigd om ervoor te zorgen dat alleen rood licht doorlaat. Het uiteinde van de acryllichtgeleider uit één stuk splitst zich in twee stromen die leiden tot twee verschillende PMT’s. De PMT’s zijn ingesloten in een kleine lichtdichte metalen doos die in contact staat met een thermo-elektrische koeler om de PMT’s af te koelen tot ~5 °C. Aan het begin van een van de PMT’s is een langdoorlaatfilter met een smal bereik (dat 570-640 nm-licht blokkeert en 640-740 nm-licht passeert) bevestigd om alleen het 700 nm-licht te meten. Daarom kan het licht van 620 nm en 700 nm afzonderlijk worden berekend. De PMT’s zijn ingesteld in de fotonentelmodus en genereren transistor-transistorlogica (TTL) pulsen voor elk gedetecteerd foton. Een DAQ-systeem telt de pulsen (verzadigingspunt 20 miljoen pulsen per seconde) via USB-communicatie. Twee afzonderlijke intensiteitskaarten worden gegenereerd na het verwerken van de gegevens en een eindbeeld wordt gemaakt door rekening te houden met de verhouding tussen de signaalgolflengte-intensiteit (620 nm) en de referentiegolflengte-intensiteit (700 nm). Deze verhouding verklaart verschillen in totale lichtopvangefficiëntie, die sterk afhankelijk zijn van de positie van de verzameloptiek, de intensiteit van de röntgenstraling en de weefseldikte. Bovendien is een ruimtelijk gescheiden referentiegebied zonder pH-indicatorkleurstof verantwoordelijk voor spectrale vervorming door golflengteafhankelijke weefselpenetratie. Een grafische programmeertaal wordt gebruikt voor het besturen van het beeldvormingssysteem en een basisstroomdiagram van de bewerking wordt hieronder weergegeven. De beeldvormingsopstelling, met uitzondering van de computer, röntgencontroller en DAQ-eenheid, is ingesloten in een veilige röntgenbehuizing om blootstelling aan straling te minimaliseren.