Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması
Summary
D-döngü yakalama (DLC) ve D-döngü uzatma (DLE) testleri, Saccharomyces cerevisiae’de indüklenebilir çift sarmallı bir kırılma yerinde D-döngü oluşumunu, D-döngü uzantısını ve ürün oluşumunu ölçmek için kantitatif PCR ile birlikte yakınlık ligasyonu prensibini kullanır.
Abstract
Hücre döngüsünün S ve G2 fazları sırasında ortaya çıkan DNA çift sarmallı kırılmalar ve iplikler arası çapraz bağlantılar da dahil olmak üzere DNA hasarı, homolog rekombinasyon (HR) ile onarılabilir. Ek olarak, İK, durma veya çökme sonrasında önemli bir çoğaltma çatalı kurtarma mekanizmasını temsil eder. Bu karmaşık yolun birçok geri dönüşümlü ve geri dönüşümsüz adımının düzenlenmesi, sadakatini arttırır. İK sırasında oluşan rekombinasyon ara ürünlerinin fiziksel analizi, bu kontrollerin çeşitli nükleoprotein faktörleri ve interaktörleri tarafından karakterize edilmesini sağlar. Rekombinasyon yolundaki spesifik olayları ve ara ürünleri analiz etmek için iyi kurulmuş yöntemler olmasına rağmen, bu yoldaki iki kritik adım olan D-döngü oluşumunun ve genişlemesinin tespiti yakın zamana kadar zor olmuştur. Burada, HR yolundaki anahtar olayları, yani DNA çift sarmallı kopma oluşumunu, D-döngü oluşumunu, D-döngü uzantısını ve Saccharomyces cerevisiae’de kırılmaya bağlı replikasyon (BIR) yoluyla ürünlerin oluşumunu tespit etmek için etkili yöntemler açıklanmaktadır. Bu analizler, ilgili rekombinasyon ara ürünlerini ve yüksek hassasiyetli ürünleri tespit eder ve hücresel canlılıktan bağımsızdır. D-döngülerinin, D-döngü uzantısının ve BIR ürününün algılanması, yakınlık ligasyonuna dayanır. Birlikte, bu analizler, İK proteinlerinin ve düzenleyicilerinin işlevlerini yoldaki önemli adımlarda ince bir şekilde ele almak için popülasyon düzeyinde İK’nın kinetiğinin incelenmesine izin verir.
Introduction
Homolog rekombinasyon (HR), DNA çift sarmallı kırılmaların (DSB’ler), iplikler arası çapraz bağlantıların ve ssDNA boşluklarının onarımının yüksek doğrulukta bir mekanizmasının yanı sıra DNA hasar toleransı için bir yoldur. HR, homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) ve translezyon sentezi gibi DNA hasarı onarımı / toleransı için hataya eğilimli yollardan farklıdır, çünkü onarım olayını şablonlamak için donör olarak sağlam, homolog bir dupleks DNA kullanır. Dahası, İK yolundaki anahtar ara ürünlerin çoğu geri dönüşümlüdür ve bireysel yol adımlarının mükemmel bir şekilde düzenlenmesine izin verir. Hücre döngüsünün S, G2 ve M fazları sırasında İK, iki uçlu DSB’lerinonarımı için NHEJ ile rekabet eder 1. Ek olarak, HR, ssDNA boşlukları ve tek taraflı DSB’ler de dahil olmak üzere replikasyonla ilişkili DNA hasarının onarımı için ve DNA lezyonu bypass2’nin bir mekanizması olarak DNA replikasyonu için gereklidir.
HR yolundaki kritik bir ara madde, yer değiştirme döngüsü veya D-döngüsüdür (Şekil 1). Son rezeksiyonu takiben, reaksiyondaki merkezi rekombinaz, Rad51, kırık molekülün yeni rezeke edilmiş ssDNA’sına yüklenir ve sarmal bir filament2 oluşturur. Rad51 daha sonra uygun bir homolog donörü, tipik olarak somatik hücrelerdeki kardeş kromatidini tanımlamak için bir homoloji araştırması yapar. D-döngüsü, Rad51-ssDNA filamenti homolog bir dubleks DNA’yı istila ettiğinde oluşur, bu da kırık ipliğin Watson-Crick baz eşleşmesine donörün tamamlayıcı ipliği ile eşleştirilmesine yol açar ve karşı donör ipliğinin yerini alır. Kırık ipliğin 3′ ucunun bir DNA polimeraz ile uzatılması, DNA hasarı olayı sırasında kaybedilen bazların yerini alır ve genişletilmiş D-döngü ara ürününün senteze bağımlı iplik tavlama (SDSA), çift Holliday kavşağı (dHJ) veya kırılmaya bağlı replikasyon (BIR) HR alt yolları yoluyla bir dsDNA ürününe çözünürlüğünü teşvik eder.
İK yolundaki ara ürünleri fiziksel olarak izleyen testler, her adım için genetik gereksinimlerin analizine izin verir (yani, yol analizi). DSB oluşumu, uç rezeksiyon, dHJ’ler, BIR replikasyon kabarcıkları ve HR ürünleri, Güney lekelenmesi 3,4,5,6,7 ile kolayca gözlenir. Bununla birlikte, Güney lekelenmesi yeni ortaya çıkan ve genişlemiş D-döngüleri hakkında rapor vermekte başarısız olmaktadır ve bu nedenle, bu eklem moleküllerini güvenilir bir şekilde ölçmek için alternatif bir yöntem gereklidir 4,8,9. Gelişmekte olan D-döngü oluşumunu analiz etmek için yaygın olarak kullanılan bir strateji, Rad51’in kromatin-immünopresipitasyonu (ChIP) ve kantitatif PCR (qPCR) 10,11’dir. Bununla birlikte, ChIP-qPCR ile ölçülen dsDNA ile Rad51 ilişkisi, dizi homolojisinden ve Rad51 aksesuar faktörü Rad5410,11’den bağımsızdır. Buna karşılık, burada sunulan D-döngü analizi yöntemini kullanan ve D-döngü yakalama (DLC) testi olarak adlandırılan kayda değer bir sinyal, DSB oluşumuna, dizi homolojisine, Rad51’e ve Rad51 aksesuar proteinleri Rad52 ve Rad548’e bağlıdır. Saccharomyces cerevisiae Rad51-terfi eden D-döngü oluşumunun Rad54’e in vivo olarak bağlı olduğu bulgusu, Rad54’ün tomurcuklanan maya Rad518,12,13,14,15 ile homoloji araştırması ve D-döngü oluşumu için gerekli olduğunu gösteren çok sayıda in vitro sulandırma deneyi ile uyumludur.
D-döngü uzantısını ölçmeye yönelik mevcut yaklaşımlar, öncelikle yarı kantitatif PCR yoluyla, benzer şekilde sorunludur. D-döngü uzantısını tespit etmek için tipik bir PCR tabanlı tahlil, bir kırılma bölgesi ile ektopik bir donör arasındaki rekombinasyondan ve müteakip rekombinasyonla ilişkili DNA sentezinden kaynaklanan, kırık iplikçik üzerindeki homoloji bölgesinin bir primer yukarı akışı ve donör iplikçik üzerindeki homoloji bölgesinin aşağı yönünde başka bir primer yoluyla benzersiz bir diziyi güçlendirir. Bu yöntemi kullanarak, rekombinasyonla ilişkili DNA sentezinin tespiti, gerekli olmayan Pol δ işlemsellik faktörü Pol3216’yı gerektirir. Bu bulgu, POL32 delesyonunun in vivo17 gen transformasyonu üzerinde sadece hafif bir etkiye sahip olduğu gözlemiyle çelişmektedir. Dahası, bu PCR tabanlı analizler D-döngü uzantısını ve BIR ürün oluşumunu geçici olarak çözmekte başarısız olur, bu da sinyalin ssDNA yerine dsDNA ürünlerinden kaynaklandığını düşündürmektedir17,18,19. D-döngü uzantısı (DLE) testi yakın zamanda bu tutarsızlıkları gidermek için geliştirilmiştir. DLE testi, ilk 3′ istilacı uç9’un aşağı yönünde ~ 400 baz çifti (bp) bir bölgede rekombinasyonla ilişkili DNA sentezini ölçer. Bu yöntemle, D-döngü uzantısı Pol32’den bağımsızdır ve DSB indüksiyonundan sonraki 4 saat içinde tespit edilebilirken, BIR ürünleri ilk olarak 6 saatte gözlenir. Nitekim, Haber ve Malkova laboratuvarlarından yeni bir yayın, genomik DNA’nın bu hazırlama yönteminin kullanılmasının tekil olarak ssDNA’nın korunmasıyla sonuçlandığını belirtmiştir 9,20.
Burada, DLC ve DLE testleri ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu analizler, S. cerevisiae’de yeni ortaya çıkan ve uzatılmış D-döngülerini tespit etmek için yakınlık ligasyonuna dayanır (Şekil 2)8,9. BIR ürünleri aynı tahlil sistemi kullanılarak ölçülebilir. Her iki tahlil için, kromozom (Chr.) V üzerindeki URA3 lokusunda bulunan bir HO endonükleaz kesim bölgesinde DSB oluşumu, galaktoz ile indüklenebilir bir promotörün kontrolü altında HO endonükleazın ekspresyonu ile indüklenir. Rad51 aracılı DNA iplikçik invazyonu, Chr. II’deki LYS2 lokusunda bulunan ektopik bir donörün yerinde yeni ortaya çıkan D-döngü oluşumuna yol açar. DSB’nin sağ tarafında donöre homoloji bulunmadığından, SDSA ve dHJ oluşumu yoluyla onarım mümkün değildir. DSB’nin BIR ile ilk onarımı mümkündür, ancak canlı ürünlerin oluşumu sentromer21’in varlığı ile engellenir. Bu kasıtlı tasarım, üretken DSB onarımını önler, böylece onarılmış DBS’lere sahip hücreler tarafından büyümenin yeniden başlamasını önler, aksi takdirde zaman seyri analizi sırasında kültürü geçebilir.
DLC tahlilinde, D-döngüsü içindeki heterodupleks DNA’nın iki ipliğinin psoralen çapraz bağlanması, rekombinasyon ara maddesini korur. Kırık (rezeke edilmiş) iplikçik ve sindirim üzerinde kısıtlama enzim bölgesi restorasyonunu takiben, çapraz bağlama, homolog kırık ve donör DNA’ların yukarı yönündeki benzersiz dizilerin bağlanmasına izin verir. qPCR kullanılarak, her numunede bulunan kimerik DNA molekülünün seviyesi ölçülür. DLE testinde, çapraz bağlama gerekli değildir ve kısıtlama enzim bölgesi restorasyonu ve sindirimi ve ardından intramoleküler ligasyon bunun yerine kırık molekülün 5′ ucunu yeni genişletilmiş 3′ ucuna bağlar. Yine, qPCR, her numunedeki bu kimerik ürünün nispi miktarlarını ölçmek için kullanılır. Kısıtlama enzim bölgesi restorasyonunun yokluğunda, DLE testi, D-döngü uzantısını takiben oluşan BIR (dsDNA) ürününün göreceli seviyelerini rapor eder.
Vahşi tip bir suş kullanan her tahlil için temsili sonuçlar gösterilir ve okuyucular, rekombinasyon mutantlarının analizi için bu testlerin kullanımı için Piazza ve ark.8 ve Piazza ve ark.9’a yönlendirilir 8,9. Bu katkının amacı, diğer laboratuvarların DLC ve DLE tahlillerini benimsemelerini sağlamaktır ve talep üzerine bunlara destek sağlanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan testler, yakınlık ligasyonu ve qPCR kullanılarak yeni ortaya çıkan ve genişletilmiş D-döngülerinin (DLC testi), D-döngü uzantısının (DLE testi) ve BIR ürün oluşumunun (hibridize edici oligonükleotid içermeyen DLE testi) tespit edilmesine izin verir. Rad51’in DSB’den uzak bölgelere ChIP-qPCR’si daha önce Rad51 aracılı homoloji araması ve D-döngü oluşumu için bir proxy olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu ChIP-qPCR sinyali, kırılma bölgesi ile potansiyel bir donör arasınd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Heyer laboratuvarındaki çalışmalar, W.-D.H.’ye GM58015 ve GM137751 hibeleri ile desteklenmektedir. Piazza laboratuvarındaki araştırmalar Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-StG 3D-loop, büyük anlaşma 851006) tarafından desteklenmektedir. D.R., T32CA108459 ve A.P. Giannini Vakfı tarafından desteklenmektedir. Shih-Hsun Hung’a (Heyer Lab) DLC/DLE tahlil sonuçlarını paylaştığı ve bu protokolde detaylandırılan tahlillerdeki değişiklikleri ayrıca doğruladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
- Heyer, W. -. D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
- Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
- Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
- Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
- Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
- Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
- Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
- Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -. D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
- Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
- Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
- Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
- Wright, W. D., Heyer, W. -. D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
- Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -. D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
- Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
- Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
- Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
- Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
- Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
- Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
- Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
- Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
- Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
- Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
- Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
- Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
- Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -. D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
- Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -. D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).
