Обнаружение гомологичных промежуточных продуктов рекомбинации с помощью бесконтактного лигирования и количественной ПЦР в Saccharomyces cerevisiae

Гомологичная рекомбинация (HR) является высокоточным механизмом репарации двухцепочечных разрывов ДНК (DSB), межцепочечных поперечных связей и разрывов ssDNA, а также путем толерантности к повреждению ДНК. HR отличается от подверженных ошибкам путей восстановления / толерантности повреждения ДНК, таких как негомологичное конечное соединение (NHEJ) и синтез транслезии, тем, что он использует неповрежденную, гомологичную дуплексную ДНК в качестве донора для шаблона события восстановления. Кроме того, многие из ключевых промежуточных звеньев в пути HR являются обратимыми, что позволяет точно регулировать отдельные этапы пути. Во время фаз S, G2 и M клеточного цикла HR конкурирует с NHEJ за ремонт двухсторонних DSB¹. Кроме того, HR имеет важное значение для репликации ДНК для восстановления повреждений ДНК, связанных с репликацией, включая пробелы ssDNA и односторонние DSB, а также в качестве механизма шунтирования поражения ДНК².

Критическим промежуточным звеном в пути HR является петля смещения, или D-петля (рисунок 1). После концевой резекции центральная рекомбиназа в реакции, Rad51, загружается на вновь резецированную ssDNA разрушенной молекулы, образуя спиральную нить². Затем Rad51 проводит гомологический поиск для идентификации подходящего гомологичного донора, обычно сестринской хроматиды в соматических клетках. D-петля образуется, когда нить Rad51-ssDNA вторгается в гомологичную дуплексную ДНК, что приводит к спариванию основания Уотсона-Крика сломанной нити с комплементарной нитью донора, вытесняя противоположную донорскую нить. Расширение 3′-го конца сломанной цепи ДНК-полимеразой заменяет основания, которые были потеряны во время события повреждения ДНК, и способствует разрешению расширенного промежуточного D-петли в продукт dsDNA посредством синтез-зависимого отжига цепи (SDSA), двойного соединения Холлидей (dHJ) или подпутей HR, индуцированной разрывом репликации (BIR).

Анализы, которые физически контролируют промежуточные продукты в пути HR, позволяют анализировать генетические требования для каждого этапа (т. Е. Анализ пути). Образование DSB, резекция конца, dHJ, пузырьки репликации BIR и продукты HR легко наблюдаются южным пятном 3,4,5,6,7. Тем не менее, Южное блоттинг не сообщает о зарождающихся и расширенных D-петлях, и, таким образом, альтернативный метод надежного измерения этих суставных молекул требует ^4,8,9. Одной из широко используемых стратегий для анализа зарождающегося образования D-петли является хроматин-иммунопреципитация (ChIP) Rad51 в сочетании с количественной ПЦР (qPCR)^10,11. Однако связь Rad51 с dsDNA, измеренная с помощью ChIP-qPCR, не зависит от гомологии последовательностей и фактора аксессуара Rad51 Rad54^10,11. Напротив, заметный сигнал с использованием представленного здесь метода анализа D-петли, называемого анализом захвата D-петли (DLC), зависит от образования DSB, гомологии последовательности, Rad51 и вспомогательных белков Rad51 Rad52 и Rad54⁸. Вывод о том, что образование D-петли Saccharomyces cerevisiae Rad51 зависит от Rad54 in vivo, согласуется с многочисленными экспериментами по восстановлению in vitro, указывающими на то, что Rad54 необходим для поиска гомологий и формирования D-петли почкованием дрожжей Rad51 8,12,13,14,15.

Современные подходы к измерению расширения D-контура, главным образом с помощью полуколичественной ПЦР, также проблематичны. Типичный анализ на основе ПЦР для обнаружения расширения D-петли усиливает уникальную последовательность, возникающую в результате рекомбинации между местом разрыва и эктопическим донором и последующего рекомбинационно-ассоциированного синтеза ДНК через праймер выше по течению от области гомологии на сломанной цепи и другой праймер ниже по течению от области гомологии на донорской цепи. Используя этот метод, для обнаружения рекомбинационно-ассоциированного синтеза ДНК требуется несущественный фактор процессности Pol δ Pol32¹⁶. Этот вывод противоречит наблюдению, что делеция POL32 оказывает лишь умеренное влияние на конверсию генов in vivo¹⁷. Более того, эти анализы на основе ПЦР не могут временно разрешить расширение D-петли и образование продукта BIR, предполагая, что сигнал является результатом продуктов dsDNA, а не промежуточных продуктов ssDNA 17,18,19. Недавно для устранения этих расхождений был разработан анализ расширения D-loop (DLE). Анализ DLE количественно оценивает рекомбинационно-ассоциированный синтез ДНК на участке ~ 400 пар оснований (bp) ниже начального 3′ вторгающегося конца⁹. С помощью этого метода удлинение D-петли не зависит от Pol32 и обнаруживается в течение 4 ч после индукции DSB, тогда как продукты BIR впервые наблюдаются через 6 ч. Действительно, в недавней публикации из лабораторий Габера и Малковой отмечалось, что использование этого метода получения геномной ДНК исключительно приводит к сохранению сдНК ^9,20.

Здесь подробно описаны анализы DLC и DLE. Эти анализы основаны на бесконтактном лигировании для обнаружения зарождающихся и расширенных D-петель у S. cerevisiae (рисунок 2)^8,9. Продукты BIR могут быть количественно определены с использованием этой же системы анализа. Для обоих анализов образование DSB в месте разреза эндонуклеазы HO, расположенном в локусе URA3 на хромосоме (Chr.) V, индуцируется экспрессией эндонуклеазы HO под контролем галактозно-индуцируемого промотора. Rad51-опосредованная инвазия цепей ДНК приводит к зарождающемуся образованию D-петли на месте эктопического донора, расположенного в локусе LYS2 на Chr. II. Поскольку правая сторона DSB не имеет гомологии для донора, восстановление с помощью SDSA и формирования dHJ невозможно. Первоначальное восстановление DSB методом BIR возможно, но образование жизнеспособных продуктов тормозится присутствием центромеры²¹. Эта преднамеренная конструкция предотвращает продуктивное восстановление DSB, тем самым избегая возобновления роста клетками с восстановленными DBS, которые в противном случае могли бы обогнать культуру во время анализа курса времени.

В анализе DLC псораленовое сшивание двух нитей гетеродуплексной ДНК в D-петле сохраняет промежуточный рекомбинационный продукт. После восстановления сайта рестрикционного фермента на разрушенной (резецированной) цепи и пищеварения сшивание позволяет переливировать уникальные последовательности выше по течению от гомологичных разрушенных и донорских ДНК. Используя qPCR, уровень химерной молекулы ДНК, присутствующей в каждом образце, количественно оценивается. В анализе DLE сшивание не требуется, и восстановление сайта фермента рестрикции и пищеварение с последующим внутримолекулярным лигированием вместо этого связывают 5′-образный конец разрушенной молекулы с недавно расширенным 3′-концом. Опять же, qPCR используется для количественной оценки относительных количеств этого химерного продукта в каждом образце. При отсутствии восстановления сайта рестрикционного фермента анализ DLE сообщает об относительных уровнях продукта BIR (dsDNA), который образуется после расширения D-петли.

Показаны репрезентативные результаты для каждого анализа с использованием штамма дикого типа, и читатели ссылаются на Piazza et ^al.8 и Piazza et ^al.9 для использования этих анализов для анализа рекомбинационных мутантов ^8,9. Цель этого вклада состоит в том, чтобы позволить другим лабораториям принять анализы DLC и DLE, и поддержка для них предоставляется по запросу.