出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

相同組換え(HR)は、DNA二本鎖切断(DSB)、鎖間クロスリンク、およびssDNAギャップの修復の忠実度の高いメカニズムであり、DNA損傷耐性の経路でもあります。HRは、非相同末端結合(NHEJ)やトランス病変合成などのDNA損傷修復/耐性のエラーが発生しやすい経路とは異なり、修復イベントをテンプレート化するためのドナーとして無傷の相同二重鎖DNAを利用します。さらに、HR経路の主要な中間体の多くは可逆的であり、個々の経路ステップの絶妙な調節を可能にします。細胞周期のS期、G2期、およびM期の間、HRは両末端DSBの修復をめぐってNHEJと競合します¹。さらに、HRは、ssDNAギャップや片側DSBを含む複製関連DNA損傷の修復、およびDNA病変バイパスのメカニズムとして、DNA複製に不可欠です²。

HR経路の重要な中間体は、変位ループまたはDループです(図1)。末端切除後、反応の中心的なリコンビナーゼであるRad51が、壊れた分子の新しく切除されたssDNAに負荷をかけ、らせん状のフィラメント²を形成します。次に、Rad51は相同性検索を実行して、適切な相同ドナー、通常は体細胞内の姉妹染色分体を同定します。Dループは、Rad51-ssDNAフィラメントが相同二重鎖DNAに侵入すると形成され、切断された鎖とドナーの相補鎖とのワトソン-クリック塩基対形成をもたらし、反対側のドナー鎖を置換します。DNAポリメラーゼによる切断鎖の3’末端の伸長は、DNA損傷イベント中に失われた塩基を置き換え、合成依存性鎖アニーリング(SDSA)、ダブルホリデイジャンクション(dHJ)、または切断誘発複製(BIR)HRサブ経路を介して、拡張されたDループ中間体のdsDNA産物への分離を促進します。

HR経路の中間体を物理的にモニタリングするアッセイは、各ステップの遺伝的要件の分析(すなわち、パスウェイ解析)を可能にする。DSB形成、末端切除、dHJ、BIR複製バブル、およびHR産物は、サザンブロッティング3,4,5,6,7によって容易に観察されます。しかし、サザンブロッティングはDループの発生期および伸長について報告していないため、これらの関節分子を確実に測定するための代替方法が必要です^4,8,9。新生Dループ形成を分析するために広く使用されている戦略の1つは、定量的PCR(qPCR)と組み合わせたRad51のクロマチン免疫沈降(ChIP)です^10,11。しかしながら、ChIP-qPCRによって測定されるdsDNAとのRad51会合は、配列相同性およびRad51付属因子Rad54^10、11とは無関係である。対照的に、ここで紹介するDループキャプチャ(DLC)アッセイと呼ばれるDループ分析の方法を使用したかなりのシグナルは、DSB形成、配列相同性、Rad51、およびRad51アクセサリータンパク質Rad52およびRad54^{に依存します8。}サッカロマイセス・セレビシエRad51が促進したDループ形成がin vivoのRad54に依存するという発見は、Rad54が相同性検索と出芽酵母Rad51によるDループ形成に必要であることを示す多数のin vitro再構成実験と一致しています8,12,13,14,15。

主に半定量的PCRによるDループ伸長の測定に対する現在のアプローチも同様に問題があります。D-loop伸長を検出するための典型的なPCRベースのアッセイは、切断部位と異所性ドナーとの間の組換えおよびその後の組換え関連DNA合成から生じる固有の配列を、切断鎖上の相同性領域の上流のプライマーおよびドナー鎖上の相同性領域の下流にある別のプライマーを介して増幅する。この方法を使用する場合、組換え関連DNA合成の検出には、必須ではないPol δ処理性因子Pol32が必要です¹⁶。この発見は、POL32欠失がインビボでの遺伝子変換に軽度の影響を与えるという観察と矛盾^する17。さらに、これらのPCRベースのアッセイは、Dループの伸長とBIR産物の形成を時間的に解決できず、シグナルがssDNA中間体ではなくdsDNA産物に起因することを示唆しています^17,18,19。Dループ伸長(DLE)アッセイは、これらの不一致に対処するために最近開発されました。DLEアッセイは、最初の3’浸潤末端⁹の下流~400塩基対(bp)の部位での組換え関連DNA合成を定量します。この方法では、Dループの伸長はPol32とは無関係であり、DSB誘導後4時間以内に検出可能ですが、BIRプロダクトは6時間で最初に観察されます。実際、ハーバー研究所とマルコバ研究所からの最近の出版物は、ゲノムDNAの調製この方法を単独で使用すると、ssDNAの保存がもたらされることを指摘しています^9,20。

ここでは、DLCおよびDLEアッセイについて詳細に説明する。これらのアッセイは、S. cerevisiaeの新生および伸長Dループを検出するために近接結紮に依存しています(図2)^8,9。BIR製品は、これと同じアッセイシステムを使用して定量できます。両方のアッセイについて、染色体上のURA3遺伝子座に位置するHOエンドヌクレアーゼ切断部位でのDSB形成(Chr.V)は、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でのHOエンドヌクレアーゼの発現によって誘導される。Rad51を介したDNA鎖の侵入は、Chr. IIのLYS2遺伝子座に位置する異所性ドナーの部位で新生Dループ形成を引き起こします。DSBの右側はドナーとの相同性を欠いているため、SDSAおよびdHJ形成による修復は実行不可能です。BIRによるDSBの初期修復は可能であるが、生存可能な生成物の形成はセントロメア²¹の存在によって阻害される。この意図的な設計により、生産的なDSB修復が妨げられ、それによって、時間経過分析中に培養物を追い越す可能性のある、修復されたDBSを持つ細胞による増殖の再開を回避します。

DLCアッセイでは、Dループ内のヘテロ二本鎖DNAの2本鎖のソラレン架橋は、組換え中間体を保存します。切断された(切除された)鎖上の制限酵素部位の修復および消化に続いて、架橋は相同な切断およびドナーDNAの上流のユニークな配列のライゲーションを可能にする。qPCRを使用して、各サンプルに存在するキメラDNA分子のレベルを定量します。DLEアッセイでは、架橋は不要であり、制限酵素部位の回復と消化に続いて分子内ライゲーションを行い、代わりに壊れた分子の5’末端を新しく伸長した3’末端に結合させます。ここでも、qPCRを使用して、各サンプル中のこのキメラ産物の相対量を定量します。制限酵素部位の修復がない場合、DLEアッセイは、Dループ伸長後に形成されるBIR(dsDNA)産物の相対レベルについて報告します。

野生型株を用いた各アッセイの代表的な結果が示され、組換え^{変異株の分析}のためのこれらのアッセイの使用について、読者はPiazzaら8およびPiazzaら9に参照される^8、9。この貢献の目的は、他のラボがDLCおよびDLEアッセイを採用できるようにすることであり、リクエストに応じてそれらのサポートを利用できます。