איתור מתווכי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות קשירת קרבה ו-PCR כמותי ב-Saccharomyces cerevisiae
Summary
מבחני לכידת לולאת D (DLC) והרחבת לולאת D (DLE) משתמשים בעקרון קשירת הקרבה יחד עם PCR כמותי כדי לכמת היווצרות לולאת D, הרחבת לולאת D והיווצרות מוצרים באתר של שבר דו-גדילי אינדוקטיבי ב- Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
נזק לדנ”א, כולל שברים דו-גדיליים בדנ”א וקישורים צולבים בין גדילים, שנגרם במהלך שלבי S ו-G2 של מחזור התא, ניתן לתיקון על-ידי רקומבינציה הומולוגית (HR). בנוסף, HR מייצג מנגנון חשוב של חילוץ מזלג שכפול לאחר עיכוב או קריסה. הסדרת הצעדים הרבים ההפיכים והבלתי הפיכים של מסלול מורכב זה מקדמת את נאמנותו. הניתוח הפיזיקלי של מתווכי הרקומבינציה שנוצרו במהלך HR מאפשר לאפיין בקרות אלה על ידי גורמי נוקלאופרוטאין שונים והאינטראקטורים שלהם. למרות שישנן שיטות מבוססות היטב לבחון אירועים ומתווכים ספציפיים במסלול הרקומבינציה, זיהוי היווצרות והרחבה של לולאת D, שני שלבים קריטיים במסלול זה, התגלה כמאתגר עד לאחרונה. כאן מתוארות שיטות יעילות לאיתור אירועי מפתח במסלול HR, כלומר היווצרות שבירה דו-גדילית של DNA, היווצרות לולאת D, הרחבת לולאת D והיווצרות מוצרים באמצעות שכפול המושרה על ידי שבירה (BIR) ב- Saccharomyces cerevisiae . מבחנים אלה מזהים את חומרי הביניים והמוצרים הרקומבינציה הרלוונטיים שלהם ברגישות גבוהה ואינם תלויים בכדאיות התאית. הזיהוי של לולאות D, הרחבת D-loop ומוצר ה- BIR מבוסס על קשירת קרבה. יחד, מבחנים אלה מאפשרים לחקור את הקינטיקה של HR ברמת האוכלוסייה כדי לטפל בעדינות בתפקודים של חלבוני משאבי אנוש ורגולטורים בשלבים משמעותיים במסלול.
Introduction
רקומבינציה הומולוגית (HR) היא מנגנון בעל נאמנות גבוהה של תיקון שברים דו-גדיליים בדנ”א (DSBs), קישורים צולבים בין גדילים ופערי ssDNA, כמו גם מסלול לעמידות בפני נזקי DNA. HR שונה ממסלולים מועדים לשגיאות לתיקון/סובלנות נזקי DNA, כגון צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) וסינתזת טרנסלציה, בכך שהוא משתמש בדנ”א דופלקס שלם והומולוגי כתורם לעיצוב אירוע התיקון. יתר על כן, רבים מהמתווכים המרכזיים במסלול משאבי אנוש הם הפיכים, ומאפשרים ויסות מעולה של שלבי המסלול הבודדים. במהלך שלבי S, G2 ו-M של מחזור התא, HR מתחרה עם NHEJ על תיקון ה-DSBs1 הדו-קצוות. בנוסף, HR חיוני לשכפול דנ”א לתיקון נזקי דנ”א הקשורים לשכפול, כולל פערי ssDNA ו- DSBs חד-צדדיים, וכמנגנון של מעקף נגע DNA2.
אמצעי ביניים קריטי במסלול משאבי אנוש הוא לולאת התזוזה, או לולאת D (איור 1). לאחר כריתת הסוף, הרקומבינאז המרכזי בתגובה, Rad51, נטען על ה-ssDNA החדש של המולקולה השבורה, ויוצר נימה סלילית2. לאחר מכן Rad51 מבצע חיפוש הומולוגי כדי לזהות תורם הומולוגי מתאים, בדרך כלל כרומטיד האחות בתאים סומטיים. לולאת D נוצרת כאשר נימה Rad51-ssDNA פולשת לדנ”א דופלקס הומולוגי, מה שמוביל לזיווג בסיס ווטסון-קריק של הגדיל השבור עם הגדיל המשלים של התורם, תוך הזזת גדיל התורם הנגדי. הרחבה של קצה ה-3′ של הגדיל השבור על ידי פולימראז דנ”א מחליפה את הבסיסים שאבדו במהלך אירוע הנזק לדנ”א ומקדמת את הרזולוציה של ביניים לולאת D המורחבת למכפלת dsDNA באמצעות חישול גדיל תלוי סינתזה (SDSA), צומת הולידיי כפול (dHJ), או תת-מסלולי HR של שכפול המושרה על ידי שבירה (BIR).
בדיקות המנטרות פיזית את המתווכים במסלול משאבי אנוש מאפשרות ניתוח של הדרישות הגנטיות לכל שלב (כלומר, ניתוח מסלול). היווצרות DSB, כריתת קצה, dHJs, בועות שכפול BIR ומוצרי HR נצפים בקלות על ידי כתם דרומי 3,4,5,6,7. עם זאת, כתם דרומי אינו מדווח על לולאות D מתהוות ומורחבות, ולכן נדרשתשיטה חלופית למדידה אמינה של מולקולות מפרקים אלה 4,8,9. אסטרטגיה נפוצה אחת לניתוח היווצרות לולאת D מתהווה היא כרומטין-מיצוי חיסוני (ChIP) של Rad51 בשילוב עם PCR כמותי (qPCR)10,11. עם זאת, הקשר של Rad51 עם dsDNA כפי שנמדד על ידי ChIP-qPCR אינו תלוי בהומולוגיה של רצף ובגורם האביזרים Rad51 Rad5410,11. לעומת זאת, אות ניכר המשתמש בשיטה של ניתוח לולאת D המוצגת כאן, הנקראת בדיקת לכידת לולאת D (DLC), תלוי בהיווצרות DSB, הומולוגיה של רצף, Rad51, וחלבוני העזר Rad51 Rad52 ו- Rad548. הממצא כי Saccharomyces cerevisiae Rad51-מקודם D-loop היווצרות תלויה ב- Rad54 in vivo עולה בקנה אחד עם ניסויים רבים בשחזור חוץ גופי המצביעים על כך ש- Rad54 נדרש לחיפוש הומולוגי ויצירת לולאת D על ידי ניצני שמרים Rad51 8,12,13,14,15.
הגישות הנוכחיות למדידת הארכת לולאת D, בעיקר באמצעות PCR כמותי למחצה, הן בעייתיות באופן דומה. בדיקה טיפוסית מבוססת PCR לאיתור הארכת D-loop מגבירה רצף ייחודי, הנובע מרקומבינציה בין אתר הפסקה לתורם חוץ רחמי ומסינתזת הדנ”א הקשורה לרקומבינציה שלאחר מכן, באמצעות פריימר במעלה הזרם של אזור ההומולוגיה על הגדיל השבור ופריימר נוסף במורד הזרם של אזור ההומולוגיה על גדיל התורם. באמצעות שיטה זו, זיהוי של סינתזת DNA הקשורה לרקומבינציה דורש את גורם העיבוד הלא חיוני של Pol δ Pol3216. ממצא זה סותר את התצפית כי למחיקה של POL32 יש השפעה קלה בלבד על המרת גנים in vivo17. יתר על כן, בדיקות מבוססות PCR אלה אינן מצליחות לפתור באופן זמני את הרחבת לולאת D ואת היווצרות המוצר של BIR, מה שמרמז על כך שהאות נובע ממוצרי dsDNA ולא מתווך ssDNA17,18,19. בדיקת הרחבת D-loop (DLE) פותחה לאחרונה כדי לטפל בפערים אלה. בדיקת ה-DLE מכמתת סינתזת דנ”א הקשורה לרקומבינציה באתר של ~400 זוגות בסיסים (bp) במורד הזרם של הקצה הפולש הראשוני 3′9. בשיטה זו, הרחבת D-loop אינה תלויה ב-Pol32 וניתנת לזיהוי תוך 4 שעות לאחר אינדוקציה של DSB, בעוד שתוצרי BIR נצפים לראשונה ב-6 שעות. ואכן, פרסום שפורסם לאחרונה במעבדות הבר ומלקובה ציין כי שימוש בשיטה זו של הכנת דנ”א גנומי מביא לשימור ssDNA 9,20.
כאן, מבחני DLC ו- DLE מתוארים בפירוט. מבחנים אלה מסתמכים על קשירת קרבה כדי לזהות לולאות D מתהוות ומורחבות ב-S. cerevisiae (איור 2)8,9. ניתן לכמת מוצרי BIR באמצעות אותה מערכת בדיקה. עבור שני המבחנים, היווצרות DSB באתר חיתוך אנדונוקלאז HO הממוקם בלוקוס URA3 על כרומוזום (Chr.) V מושרית על ידי הביטוי של אנדונוקלאז HO תחת שליטתו של מקדם גלקטוז הניתן להשרה. פלישת גדילי דנ”א בתיווך Rad51 מובילה להיווצרות לולאת D מתהווה באתר של תורם חוץ רחמי הממוקם במוקד LYS2 ב- Chr. II. מכיוון שהצד הימני של ה- DSB חסר הומולוגיה לתורם, תיקון באמצעות SDSA ו- dHJ אינו אפשרי. תיקון ראשוני של DSB על ידי BIR אפשרי, אבל היווצרות של מוצרים קיימא מעוכב על ידי נוכחות של centromere21. תכנון מכוון זה מונע תיקון DSB פרודוקטיבי, ובכך מונע את חידוש הצמיחה על ידי תאים עם DBSs מתוקנים, אשר אחרת יכול לעקוף את התרבית במהלך ניתוח מהלך הזמן.
במבחן DLC, קישור צולב פסורלן של שני הגדילים של הדנ”א ההטרודופלקס בתוך לולאת D משמר את ביניים הרקומבינציה. לאחר שיקום אתר אנזים ההגבלה על הגדיל השבור (שנכרת) והעיכול, הקישור הצולב מאפשר קשירת הרצפים הייחודיים במעלה הזרם של הדנ”א ההומולוגי השבור והתורם. באמצעות qPCR, ניתן לכמת את רמת מולקולת הדנ”א הכימרית הקיימת בכל דגימה. במבחן DLE, אין צורך בקישור צולב, ושיקום ועיכול אתר אנזים ההגבלה ואחריו קשירה תוך-מולקולרית מקשרים במקום זאת את קצה 5′ של המולקולה השבורה לקצה החדש של 3′. שוב, qPCR משמש לכימות הכמויות היחסיות של מוצר כימרי זה בכל דגימה. בהיעדר שחזור אתר אנזים הגבלה, בדיקת ה-DLE מדווחת על הרמות היחסיות של תוצר ה-BIR (dsDNA) שנוצר בעקבות הארכת לולאת D.
מוצגות תוצאות מייצגות עבור כל בדיקה המשתמשת בזן מסוג פראי, והקוראים מופנים לפיאצה et al.8 ולפיאצה ואחרים לשימוש במבחנים אלה לניתוח מוטציות רקומבינציה 8,9. מטרת תרומה זו היא לאפשר למעבדות אחרות לאמץ את מבחני DLC ו- DLE, ותמיכה בהם זמינה על פי בקשה.
Protocol
Representative Results
Discussion
המבחנים המוצגים מאפשרים זיהוי של לולאות D מתהוות ומורחבות (בדיקת DLC), הרחבת לולאת D (בדיקת DLE) ויצירת מוצר BIR (בדיקת DLE ללא אוליגונוקלאוטידים היברידיים) באמצעות קשירת קרבה ו- qPCR. ChIP-qPCR של Rad51 לאתרים מרוחקים מה-DSB שימש בעבר כפרוקסי לחיפוש הומולוגיה בתיווך Rad51 ויצירת לולאת D. עם זאת, אות ChIP-qPCR זה אינו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה במעבדת הייר נתמכת על ידי מענקים GM58015 ו- GM137751 ל- W.-D.H. המחקר במעבדת פיאצה נתמך על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC-StG 3D-loop, הסכם גדול 851006). D.R. נתמך על ידי T32CA108459 וקרן א.פ. ג’יאניני. אנו מודים ל-Shih-Hsun Hung (מעבדת הייר) על שיתוף תוצאות בדיקת DLC/DLE שלו ועל אימות השינויים במבחנים המפורטים בפרוטוקול זה.
Materials
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
- Heyer, W. -. D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
- Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
- Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
- Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
- Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
- Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
- Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
- Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -. D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
- Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
- Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
- Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
- Wright, W. D., Heyer, W. -. D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
- Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -. D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
- Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
- Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
- Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
- Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
- Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
- Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
- Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
- Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
- Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
- Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
- Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
- Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
- Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -. D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
- Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -. D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).
