Detectie van homologe recombinatietussenproducten via nabijheidsligatie en kwantitatieve PCR in saccharomyces cerevisiae

Homologe recombinatie (HR) is een high-fidelity mechanisme voor reparatie van DNA dubbelstrengsbreuken (DSB’s), interstrengs dwarsverbindingen en ssDNA-hiaten, evenals een route voor DNA-schadetolerantie. HR verschilt van foutgevoelige routes voor DNA-schadeherstel / -tolerantie, zoals niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en translesiesynthese, omdat het een intact, homoloog duplex-DNA als donor gebruikt om de reparatiegebeurtenis te templaten. Bovendien zijn veel van de belangrijkste tussenpersonen in het HR-traject omkeerbaar, waardoor de individuele trajectstappen uitstekend kunnen worden gereguleerd. Tijdens de S-, G2- en M-fasen van de celcyclus concurreert HR met NHEJ voor de reparatie van de tweezijdige DSB’s¹. Bovendien is HR essentieel voor DNA-replicatie voor het herstel van replicatie-geassocieerde DNA-schade, inclusief ssDNA-hiaten en eenzijdige DSB’s, en als een mechanisme van DNA-laesie bypass².

Een kritisch tussenproduct in de HR-route is de verplaatsingslus of D-lus (figuur 1). Na eindresectie laadt het centrale recombinase in de reactie, Rad51, op het nieuw gereseceerde ssDNA van het gebroken molecuul en vormt een spiraalvormig filament². Rad51 voert vervolgens een homologieonderzoek uit om een geschikte homologe donor te identificeren, meestal de zusterchromatide in somatische cellen. De D-lus wordt gevormd wanneer het Rad51-ssDNA-filament een homoloog duplex-DNA binnendringt, wat leidt tot de Watson-Crick-basisparing van de gebroken streng met de complementaire streng van de donor, waardoor de tegenovergestelde donorstreng wordt verplaatst. Verlenging van het 3′-uiteinde van de gebroken streng door een DNA-polymerase vervangt de basen die verloren zijn gegaan tijdens de DNA-schadegebeurtenis en bevordert de resolutie van het uitgebreide D-lustussenproduct in een dsDNA-product via de synthese-afhankelijke strenggloeiing (SDSA), de dubbele Holliday-junctie (dHJ) of de break-induced replication (BIR) HR-subroutes.

Assays die de tussenproducten in de HR-route fysiek monitoren, maken de analyse van de genetische vereisten voor elke stap mogelijk (d.w.z. pathway-analyse). DSB-vorming, eindresectie, dHJ’s, BIR-replicatiebubbels en HR-producten worden gemakkelijk waargenomen door Southern blotting 3,4,5,6,7. Toch rapporteert Southern blotting niet over ontluikende en uitgebreide D-lussen, en dus is een alternatieve methode nodig om deze gewrichtsmoleculen betrouwbaar te meten ^4,8,9. Een veelgebruikte strategie om ontluikende D-lusvorming te analyseren is chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) van Rad51 in combinatie met kwantitatieve PCR (qPCR)^10,11. Rad51 associatie met dsDNA zoals gemeten door ChIP-qPCR is echter onafhankelijk van sequentie homologie en de Rad51 accessoirefactor Rad54^10,11. Daarentegen is een merkbaar signaal met behulp van de hier gepresenteerde methode van D-loop-analyse, de D-loop capture (DLC) -test genoemd, afhankelijk van DSB-vorming, sequentie homologie, Rad51 en de Rad51-accessoire-eiwitten Rad52 en Rad54⁸. De bevinding dat Saccharomyces cerevisiae Rad51-bevorderde D-lusvorming afhankelijk is van Rad54 in vivo, komt overeen met talrijke in vitro reconstitutie-experimenten die aangeven dat Rad54 nodig is voor homologieonderzoek en D-lusvorming door ontluikende gist Rad51 8,12,13,14,15.

De huidige benaderingen voor het meten van D-loop-uitbreiding, voornamelijk via semi-kwantitatieve PCR, zijn eveneens problematisch. Een typische PCR-gebaseerde test om D-loop extensie te detecteren versterkt een unieke sequentie, resulterend uit recombinatie tussen een breukplaats en een ectopische donor en de daaropvolgende recombinatie-geassocieerde DNA-synthese, via een primer stroomopwaarts van het gebied van homologie op de gebroken streng en een andere primer stroomafwaarts van het gebied van homologie op de donorstreng. Met behulp van deze methode vereist de detectie van recombinatie-geassocieerde DNA-synthese de niet-essentiële Pol δ processiviteitsfactor Pol32¹⁶. Deze bevinding is in strijd met de constatering dat POL32-deletie slechts een mild effect heeft op de genconversie in vivo¹⁷. Bovendien slagen deze PCR-gebaseerde assays er niet in om D-loop-uitbreiding en BIR-productvorming tijdelijk op te lossen, wat suggereert dat het signaal het resultaat is van dsDNA-producten in plaats van ssDNA-tussenproducten 17,18,19. De D-loop extension (DLE) assay is onlangs ontwikkeld om deze discrepanties aan te pakken. De DLE-test kwantificeert recombinatie-geassocieerde DNA-synthese op een plaats ~ 400 basenparen (bp) stroomafwaarts van de initiële 3 ‘binnendringende eind⁹. Volgens deze methode is D-loop-extensie onafhankelijk van Pol32 en detecteerbaar binnen 4 uur na DSB-inductie, terwijl BIR-producten voor het eerst worden waargenomen na 6 uur. Inderdaad, een recente publicatie van de Haber en Malkova laboratoria merkte op dat het gebruik van deze methode van bereiding van genomisch DNA enkelvoud resulteert in ssDNA-conservering ^9,20.

Hier worden de DLC- en DLE-assays in detail beschreven. Deze testen zijn gebaseerd op nabijheidsligatie om ontluikende en verlengde D-lussen in S. cerevisiae te detecteren (figuur 2)^8,9. BIR-producten kunnen worden gekwantificeerd met behulp van hetzelfde testsysteem. Voor beide testen wordt DSB-vorming op een HO-endonuclease-cutplaats op de URA3-locus op chromosoom (Chr.) V geïnduceerd door de expressie van het HO-endonuclease onder controle van een galactose-induceerbare promotor. Rad51-gemedieerde DNA-strenginvasie leidt tot ontluikende D-lusvorming op de plaats van een ectopische donor op de LYS2-locus op Chr. II. Omdat de rechterkant van de DSB homologie aan de donor mist, is reparatie via SDSA en dHJ-vorming niet haalbaar. Initiële reparatie van de DSB door BIR is mogelijk, maar de vorming van levensvatbare producten wordt geremd door de aanwezigheid van het centromeer²¹. Dit opzettelijke ontwerp voorkomt productieve DSB-reparatie, waardoor de hervatting van de groei door cellen met gerepareerde DBS’en wordt vermeden, die anders de cultuur zouden kunnen inhalen tijdens de analyse van de tijdskoers.

In de DLC-test behoudt psoralen crosslinking van de twee strengen van het heteroduplex DNA binnen de D-loop het recombinatiemiddel. Na herstel van de restrictie-enzymplaats op de gebroken (gereseceerde) streng en de spijsvertering, maakt de crosslinking het mogelijk om de unieke sequenties stroomopwaarts van de homologe gebroken en donor-DNA’s te binden. Met behulp van qPCR wordt het niveau van chimere DNA-molecuul in elk monster gekwantificeerd. In de DLE-test is crosslinking niet vereist, en restrictie-enzymplaatsherstel en -vertering gevolgd door intramoleculaire ligatie verbinden in plaats daarvan het 5′-uiteinde van het gebroken molecuul met het nieuw verlengde 3′-uiteinde. Nogmaals, qPCR wordt gebruikt om de relatieve hoeveelheden van dit chimere product in elk monster te kwantificeren. Bij afwezigheid van herstel van de restrictie-enzymplaats rapporteert de DLE-test over de relatieve niveaus van het BIR (dsDNA) -product dat wordt gevormd na D-loop-uitbreiding.

Representatieve resultaten voor elke test met behulp van een wildtype stam worden getoond, en lezers worden verwezen naar Piazza et ^al.8 en Piazza et ^al.9 voor het gebruik van deze assays voor de analyse van recombinatiemutanten ^8,9. De bedoeling van deze bijdrage is om andere laboratoria in staat te stellen de DLC- en DLE-assays te adopteren, en ondersteuning hiervoor is op aanvraag beschikbaar.