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Reconstituindo e caracterizando compósitos de actina-microtúbulo com dinâmica e mecânica sintonizáveis acionadas por motor

Published: August 25, 2022
doi:
10.3791/64228
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1Department of Physics and Biophysics,University of San Diego, 2W. M. Keck Science Department,Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College, 3Department of Physics,Syracuse University

Summary

Este trabalho apresenta protocolos para engenharia e caracterização de redes compostas tridimensionais sintonizáveis de filamentos de actina co-emaranhados e microtúbulos. Os compósitos sofrem reestruturação ativa e movimento balístico, impulsionados pelos motores de miosina II e cinesina, e são sintonizados pelas concentrações relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras e reticulantes passivos.

Abstract

O citoesqueleto composto, composto por redes interativas de filamentos de actina semiflexíveis e microtúbulos rígidos, reestrutura e gera forças usando proteínas motoras como miosina II e cinesina para conduzir processos-chave como migração, citocinese, adesão e mecanosensing. Embora as interações actina-microtúbulo sejam fundamentais para a versatilidade e adaptabilidade do citoesqueleto, uma compreensão de sua interação com a atividade da miosina e da cinesina ainda é incipiente. Este trabalho descreve como projetar redes compostas tridimensionais ajustáveis de filamentos de actina co-emaranhados e microtúbulos que sofrem reestruturação ativa e movimento balístico, impulsionados por motores de miosina II e cinesina, e são sintonizados pelas concentrações relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras e reticulantes passivos. Protocolos para marcação de fluorescência dos microtúbulos e filamentos de actina para visualizar de forma mais eficaz a reestruturação e o movimento dos compósitos usando imagens confocais multiespectrais também são detalhados. Finalmente, são apresentados os resultados dos métodos de análise de dados que podem ser utilizados para caracterizar quantitativamente a estrutura, a dinâmica e a mecânica do não-equilíbrio. Recriar e investigar essa plataforma biomimética ajustável fornece informações valiosas sobre como a atividade motora acoplada, a mecânica composta e a dinâmica do filamento podem levar a uma miríade de processos celulares, desde a mitose até a polarização e a sensação mecanogênica.

Introduction

O citoesqueleto é uma rede composta dinâmica de biopolímeros que interagem e fornece suporte estrutural e mecânico às células. Os motores moleculares associados e as proteínas de ligação reestruturam e adaptam o citoesqueleto para permitir que as células cresçam, mudem de forma, enrijeçam, se movam e até se auto-curem, permitindo uma miríade de processos celulares que vão desde a migração e divisão até o mecanosense 1,2. Além de sua importância na biofísica celular, o citoesqueleto também é um exemplo por excelência de matéria ativa com potenciais aplicações de materiais que vão desde a cicatrização de feridas e administração de drogas até filtração e robótica suave 1,3,4,5,6,7,8,9.

As duas principais características que dotam o citoesqueleto de sua diversidade e multifuncionalidade estrutural e mecânica únicas são: 1) sua natureza composta, compreendendo múltiplos filamentos proteicos de interação, como filamentos de actina semiflexíveis e microtúbulos rígidos, bem como suas proteínas de ligação e reticulação associadas 3,5,10; e 2) sua capacidade de reestruturar, mover, engrossar e realizar trabalhos continuamente por meio de motores consumidores de energia, como miosinas e cinesinas, empurrando e puxando as proteínas filamentosas 1,7,11,12,13. Embora essa complexidade elegante permita que o citoesqueleto medie processos tão diversos quanto a motilidade celular, a citocinese e a cicatrização de feridas 3,6,7,11, ela dificulta a capacidade dos pesquisadores de reproduzir as características in vivo do citoesqueleto em sistemas in vitro reconstituídos.

Os atuais esforços de reconstituição de fronteiras concentram-se em compósitos de filamentos de actina e microtúbulos emaranhados e reticulados3,10,14,15,16,17, redes de actomiosina geradoras de força 2,8,18,19,20,21 e nemática ativa impulsionada por cinesina-microtúbulo interações 22,23,24,25,26. Compósitos actina-microtúbulos de estado estacionário demonstraram apresentar propriedades mecânicas emergentes15,16,27, como maior mobilidade do filamento e maior rigidez em comparação com sistemas de componente único 27. Estudos sobre sistemas de actomiosina in vitro têm relatado uma ampla gama de propriedades estruturais e dinâmicas que dependem das concentrações de actina, miosina e reticulantes 28,29,30,31. Por exemplo, com reticulação suficiente, as redes de actomiosina sofrem contração em larga escala e engrossamento 2,28,30,32,33,34,35,36, enquanto que sem reticulantes, as redes exibem fluxo rápido, desestabilizador e ruptura 19,29 . Nemática ativa baseada em microtúbulos reconstituída que usa aglomerados de motores de cinesina para reticular e puxar feixes de microtúbulos tem sido relatada como exibindo fluxos turbulentos de longa duração, extensão, flambagem, fraturamento e cicatrização 12,22,23,24,25,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47.

Mais recentemente, compósitos actina-microtúbulos impulsionados por minifilamentos de miosina II demonstraram levar a uma contração mais ordenada e integridade da rede em comparação com o fluxo desordenado e a ruptura da rede que as redes de actomiosina sem reticulantes exibem 17,26,48. Além disso, a combinação de robustez composta e geração de força é otimizada quando a actina e os microtúbulos estão presentes em concentrações comparáveis. As principais características emergentes nessa região do espaço de formulação incluem maior resistência mecânica 26, movimento coordenado de actina e microtúbulos26, contração sustentada constante e reestruturação de mesoescala17.

Aqui, são descritos protocolos para projetar e sintonizar compósitos co-emaranhados e reticulados de microtúbulos e filamentos de actina que são empurrados para fora do equilíbrio por minifilamentos de miosina II e aglomerados de cinesina que atuam sobre filamentos de actina e microtúbulos, respectivamente (Figura 1). A dinâmica, estrutura e mecânica desta classe de compósitos podem ser ajustadas pelas concentrações relativas dos filamentos, motores e reticulantes para exibir um rico espaço de fase de fluxo advectivo e turbulento, contração isotrópica, aceleração, desaceleração, desmistura, enrijecimento, relaxamento e ruptura. O foco deste trabalho é preparar e ajustar esta classe de compósitos citoesqueléticos ativos. No entanto, para auxiliar os pesquisadores no benchmarking e caracterização dos compósitos ativos descritos, métodos de imagem eficazes usando microscopia confocal multiespectral também são detalhados. Finalmente, os resultados dos principais métodos de análise computacional que podem ser usados para medir a dinâmica, a estrutura e a mecânica dos compósitos são apresentados. Os pesquisadores são incentivados a adotar esses métodos, que incluem microscopia dinâmica diferencial (DDM), autocorrelação de imagem espacial (SIA) e velocimetria de imagem de partículas (PIV), pois foram otimizados para caracterizar a dinâmica complexa e a diversidade estrutural dos compósitos 17,26,49.

As etapas descritas abaixo se concentram na preparação dos compósitos e na imagem deles usando microscopia confocal. Protocolos que descrevem a análise de dados pós-aquisição e medidas de pinças ópticas podem ser encontrados em trabalhos anteriores 17,26,48,50, e fornecidos mediante solicitação. Todos os materiais estão listados na Tabela de Materiais fornecidos.

Protocol

1. Prepare lâminas de cobertura silanizadas e lâminas de microscópio para evitar a adsorção de proteínas às superfícies da câmara NOTA: Este é um processo de 2 dias. As lâminas silanizadas podem ser preparadas com até 1 mês de antecedência do uso. Coloque as tampas nº 1 (24 mm x 24 mm) e as lâminas do microscópio (1 pol x 3 pol) em um rack designado que caberá no limpador de plasma. Coloque o rack no limpador de plasma e execute por 20 min. Transfira as tampas e deslizamentos para um novo rack designado apenas para uso com silano e coloque o rack no recipiente de vidro para limpar os vidros, conforme descrito abaixo.Mergulhe as coberturas e as lâminas em acetona a 100% durante 1 h. Mergulhe as coberturas e lâminas em etanol a 100% por 10 min. Mergulhe as coberturas e lâminas em água deionizada (DI) por 5 min. Repita as etapas de limpeza mais duas vezes. Mergulhe as folhas de cobertura e as lâminas em KOH 0,1 M recém-preparados por 15 min. Mergulhe as tampas e as lâminas em DI fresco por 5 minutos. Repita esta etapa mais duas vezes. Deslizamentos de cobertura e deslizamentos secos ao ar por 10 min. Trate as coberturas e lâminas limpas com silano para produzir superfícies hidrofóbicas, conforme descrito abaixo.NOTA: Conclua as etapas a seguir em um exaustor.Mergulhe as coberturas secas e as lâminas em silano a 2% (dissolvido em tolueno) por 5 min. Use um funil para despejar o silano de volta em sua garrafa designada para reutilizar até cinco vezes. Mergulhe as coberturas e as lâminas em etanol a 100% por 5 min. Substitua o etanol pelo etanol fresco. Mergulhe as tampas e as lâminas por 5 minutos. Mergulhe as tampas e as lâminas em DI fresco por 5 minutos. Repita a etapa de lavagem de etanol e DI mais duas vezes usando etanol fresco e DI de cada vez. Deslizamentos de cobertura e deslizamentos secos ao ar por 10 min. 2. Preparação de compósito ativo actina-microtúbulo impulsionado por minifilamentos de miosina Remova a miosina inativa através da ligação do filamento de actina e realize pull-down via ultracentrifugação, conforme descrito abaixo.Polimerizar actina em filamentos. Usando uma micropipeta de precisão e pontas de pipeta estéreis, misture em um tubo de microcentrífuga: 1,87 μL de DI, 1,3 μL de 10x G-buffer, 1,3 μL de 10x F-buffer, 1,63 μL de 4 M KCl, 4,53 μL de actina (47,6 μM) e 1,08 μL de 100 μM de faloidina.NOTA: Para garantir uma polimerização suficiente, a concentração de actina e a relação molar actina:faloidina devem ser de 18,4 μM e 2:1, respectivamente. Canalize suavemente a solução para cima e para baixo para misturar e, em seguida, coloque no gelo no escuro durante ≥1 h. Ultracentrífuga fria a 4 °C. Remover a alíquota de miosina de -80 °C e colocar gelo.NOTA: Conclua a etapa 2.2 neste ponto, enquanto a actina está polimerizando. Após ≥1 h de polimerização de actina, adicionar 1,3 μL de ATP de 10 mM e 2 μL de miosina de 19 μM à actina polimerizada.NOTA: A relação molar actina:miosina deve ser >5 para garantir a remoção suficiente dos motores de miosina inativos (ou seja, cabeças mortas). Canalize suavemente a solução para cima e para baixo para misturar. Transferência para um tubo de grau ultracentrífugo.Centrífuga a 4 °C e 121.968 x g durante 30 min. Preparar uma rede composta co-emaranhada de filamentos de actina e microtúbulos, conforme descrito abaixo.NOTA: Comece 30 minutos antes da cisão da miosina (passo 2.1.4).Ajuste um bloco de calor para 37 °C. Use uma micropipeta de precisão e pontas de pipeta estéreis para adicionar o seguinte a um tubo de microcentrífuga: 13,9 μL de PEM, 3 μL de 1% de Tween20, 1,55 μL de 47,6 μM de actina, 0,36 μL de 34,8 μM R-actina, 0,3 μL de 250 mM de ATP, 0,87 μL de 100 μM de faloidina, 1,91 μL de 5-488-tubulina, 0,3 μL de 100 mM GTP, e 0,75 μL de 200 μM de Taxol, para um volume total de 23 μL.NOTA: As concentrações de actina e tubulina listadas são para um composto com 2,9 μM de actina e 2,9 μM de tubulina. A concentração total de proteína é c = c A + c T = 5,8 μM e a fração de actina molar é c A/(c A + cT) = Φ A = 0,5. Consulte a etapa 2.5 para ajustar esses valores. Canalizar suavemente a solução para cima e para baixo para misturar e colocar num bloco de calor de 37 °C protegido da luz durante 1 h. Prepare câmaras de amostra para experimentos de imagem confocal, conforme descrito abaixo.NOTA: Conclua as etapas 2.1.4 e 2.2.2 durante os períodos de espera.Coloque duas lâminas silanizadas lado a lado em uma placa quente (desligada), coloque duas tiras de filme de vedação termoplástica sobre as lâminas ~ 3 mm de distância e coloque duas tampas silanizadas sobre o filme de vedação termoplástica para formar uma câmara de amostra. Gire a placa quente em uma configuração baixa até que as tampas se liguem firmemente às corrediças com filme de vedação termoplástico derretido (~1-2 min). Pressione para baixo com pressão uniforme para garantir a colagem, mantendo o espaçamento de ~100 μm entre as duas superfícies. Retire as câmaras e desligue a placa quente. Rotular câmaras com (+) e (-). A câmara (+) será para a amostra ativa (com miosina) e a câmara (-) será a câmara controle (sem miosina). Certifique-se de que cada câmara possa acomodar ≤10 μL de fluido. Prepare amostras para a imagem conforme descrito abaixo.Observação : é importante concluir esta etapa imediatamente após as etapas 2.1 e 2.2 são concluídas.Retirar cuidadosamente a amostra de miosina-actina da ultracentrífuga (passo 2.1.4) e canalizar imediatamente os 7,5 μL superiores do sobrenadante e transferir para um novo tubo de microcentrífuga. Remova a amostra de actina-microtúbulo do bloco de calor e misture suavemente 1,5 μL de 10x D-glicose, 1,5 μL de 10x GOC e 1,5 μL de 1 mM de blebbistatina. Dividir a solução em duas alíquotas de 13,7 μL e rotular como (+) e (-). Misturar em 1,28 μL do sobrenadante da alíquota do passo 2.4.1 a (+). Misture em 1,28 μL de DI à alíquota (-). Fluir lentamente cada solução para a câmara correspondente (passo 2.3) através de acção capilar. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar no canal. Sele as duas extremidades abertas de cada canal com epóxi de secagem rápida ou cola UV. Certifique-se de que o adesivo esteja completamente seco antes de colocá-lo no microscópio. Imagem imediatamente, conforme descrito na etapa 3.NOTA: A cola UV é vantajosa porque cura quase instantaneamente após a exposição UV. No entanto, como a blebbisstatina é sensível aos raios UV, é importante iluminar localmente apenas a cola (nas bordas da câmara de amostra) usando uma pequena varinha UV para evitar a desativação da blebistatina. Opcional: variar as concentrações de proteína para ajustar a dinâmica e a estrutura dos compósitos.NOTA: As etapas a seguir são sugeridas alterações nas etapas acima para variar as concentrações de actina, microtúbulos e miosina, se desejado.Siga as etapas descritas acima, exceto para as seguintes modificações nas etapas 2.2.1 e 2.4.3. Para variar as concentrações de actina e microtúbulos, ajustando assim c e ΦA, aumentar ou diminuir o volume de actina, R-actina e 5-488-tubulina utilizados na etapa 2.2.1, conforme desejado26. Ao variar a concentração de actina, ajuste as concentrações molares de R-actina e faloidina proporcionalmente para manter as mesmas proporções molares com a actina. Ajustar o volume de PEM de modo a que o volume final da mistura permaneça 23 μL. Todos os outros volumes e concentrações de componentes permanecem os mesmos. Para variar a concentração de miosina, ajuste o volume de miosina adicionado à alíquota (+) na etapa 2.4.3 conforme desejado. Ajuste o volume DI adicionado à alíquota (-) de acordo. Ajuste o volume PEM na Etapa 2.2.1 para levar em conta o aumento ou diminuição do volume de miosina (+) e DI (-), garantindo que o volume final de cada amostra ((+) e (-)) seja de 14,98 μL. 3. Imagem e caracterização de compósitos ativos utilizando microscopia confocal Para obter imagens de compósitos de actomiosina-microtúbulos preparados na etapa 2, use um microscópio confocal de varredura a laser (LSCM), ou microscópio similar, com uma objetiva de imersão em óleo de 60x 1,4 NA. Para visualizar simultaneamente filamentos de actina e microtúbulos em canais de fluorescência separados, use um laser de 561 nm com filtros de excitação/emissão de 565/591 nm e um laser de 488 nm com filtros de excitação/emissão de 488/525 nm. Coloque a câmara de amostra no microscópio de modo que o canal de controle seja posicionado diretamente sobre a objetiva. Certifique-se de que existe uma interface de óleo entre a objetiva e a tampa. Use os controles de palco para colocar o compósito de controle em foco e, em seguida, encontre as duas superfícies da câmara de amostra. Mova a posição z para o centro da câmara de amostragem. Verifique a presença de redes filamentosas claras, como mostra a Figura 2. Ainda visualizando a câmara de controle, ajuste a intensidade de cada laser para permitir a visualização simultânea de filamentos de actina e microtúbulos. Mantenha a menor intensidade de laser possível para evitar o fotobranqueamento (mais prevalente no canal de actina) e sangre (tipicamente dos microtúbulos para o canal de actina). Para caracterizar a amostra de controle inativa, coletar três séries temporais (vídeos) de imagens de 256 x 256 pixels quadrados (213 μm x 213 μm) a 2,65 fps para um total de ≥1000 quadros. Coletar cada série temporal em uma região diferente da câmara de amostragem, separada por ≥500 μm. Certifique-se de que há um movimento detectável mínimo e nenhum fluxo ou reestruturação. Desligue o laser de 488 nm e use os controles de palco para se mover para a câmara (+). Usando o laser de 568 nm, visualize os microtúbulos no canal (+) para garantir a formação adequada da rede (Figura 2) e identifique o centro axial da câmara de amostra (que pode ser diferente da posição z central da câmara de controle). Ligue o laser de 488 nm e repita a etapa 3.5 acima com as seguintes modificações. Colete séries temporais por até 45 min, interrompendo a aquisição quando a amostra se mover para fora do campo de visão, rupturas ou fotobranqueamentos. Registre de 5 a 10 séries temporais e acompanhe o horário em que cada série temporal começa em relação ao início da primeira série temporal. Analise os dados usando DDM, SIA e PIV, conforme descrito na Figura 3, Figura 4, Figura 5 e anteriormente17,48,50,51.NOTA: O laser de 488 nm ativa localmente a atividade da miosina ATPase desativando a blebistatina, por isso só deve ser ativado no início da aquisição de dados, de modo que t = 0 esteja no início da série temporal. Esses parâmetros de aquisição são otimizados para análise de microscopia dinâmica diferencial (DDM), como feito anteriormente26. 4. Preparação de compósitos ativos actina-microtúbulos acionados por motores de cinesina NOTA: As etapas a seguir criam compósitos actina-microtúbulos que são conduzidos para fora do equilíbrio por motores de cinesina ou uma combinação de cinesina e miosina50. Prepare os motores de cinesina e miosina conforme descrito abaixo.Se incorporar miosina, siga o passo 2.1. Para formar aglomerados motores de cinesina que se ligam e exercem forças entre pares de microtúbulos, use uma micropipeta e pontas de pipeta estéreis para adicionar o seguinte a um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL: 1,16 μL PEM, 2,74 μL 8,87 μM dímeros de cinesina, 7,29 μL 83,3 μM NeutrAvidin, 0,81 μL 2mM DTT . Misturar suavemente pipetando a solução para cima e para baixo e incubar protegida da luz (utilizar um tubo de microcentrífuga preto ou envolver em folha) durante 30 minutos a 4 °C.NOTA: A razão molar dos dímeros de cinesina para NA é de 1:25. Siga a etapa 2.3 para preparar as câmaras de amostra e fazer três câmaras em vez de duas. Efectuar esta etapa durante a incubação da cinesina (etapa 4.1.2) e a ultracentrifugação da miosina (etapa 4.1.1). Preparar rede composta co-emaranhada de filamentos de actina e microtúbulos.Ajuste o bloco de calor para 37 °C. Use uma micropipeta e pontas de pipeta estéreis para adicionar o seguinte a um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL: 3,21 μL de PEM, 4,5 μL de 1% de Tween20, 2,18 μL de 47,6 μM de actina, 3,46 μL de 5-R-tubulina, 4,5 μL de 100 mM ATP, 4,5 μL de 10 mM GTP, 1,13 μL de 200 μM de taxol e 1,57 μL de 20 μM 488-faloidina. Certifique-se de que o volume total é de 25 μL. Canalizar suavemente a solução para cima e para baixo para misturar e colocar no bloco de calor de 37 °C protegido da luz durante 1 h. Remova o tubo do bloco de calor e use uma micropipeta para misturar suavemente 0,84 μL de faloidina de 100 μM. Incubar por 5-10 min à temperatura ambiente, protegido da luz.NOTA: A adição de faloidina nesta etapa, em vez de na etapa 4.3.1, melhora a marcação de fluorescência de filamentos de actina, pois a 488-faloidina não precisa competir com a faloidina não marcada para locais de ligação à actina. Prepare compósitos ativos para imagens confocais.Adicionar 1,13 μL de blebistatina de 200 μM, 1,35 μL de 10x Glu e 1,35 μL de 10x GOC à solução a partir da etapa 4.3.2 e misturar suavemente pipetando para cima e para baixo. Divida a solução em três alíquotas de 10 μL e rotule como (K), (K+M) e (-). Misture 2,54 μL de miosina do passo 2.1.4 até à alíquota (K+M). Misture em alíquotas PEM a (K) e (-) de 2,54 μL. Use uma micropipeta e pontas de pipeta estéreis para adicionar 2,5 μL de aglomerados de cinesina da etapa 4.1.2 às alíquotas (K) e (K+M). Pipete para cima e para baixo para misturar. Misture em PEM de 2,5 μL a (-) usando a mesma técnica.NOTA: As concentrações de actina e tubulina listadas são para um composto com 2,32 μM de actina e 3,48 μM de tubulina. A concentração total de proteína é c = c A + c T = 5,8 μM e a fração de actina molar é c A/(c A + cT) = Φ A = 0,4. As concentrações de cinesina e miosina são de 0,35 μM e 0,47 μM, respectivamente. Consulte a etapa 2.5 para obter diretrizes gerais para ajustar c A, cT, c e ΦA. Com uma micropipeta, fluir lentamente cada solução para o canal correspondente das câmaras de amostra preparadas (passo 4.2) através da acção capilar. Empurre para baixo muito lenta e suavemente sobre a pipeta para não introduzir bolhas de ar no canal. Sele as duas extremidades abertas de cada canal com epóxi de secagem rápida ou cola curável por UV. Certifique-se de que o adesivo esteja completamente seco antes de colocá-lo no microscópio.NOTA: É importante que esta etapa seja feita rapidamente para minimizar o tempo que a cinesina está agindo sem ser monitorada. Por esta razão, o epóxi que cura em 1 min (em vez de 5 ou 10 min) é recomendado. A cola curável por UV é vantajosa a este respeito, porque cura quase instantaneamente após a exposição aos raios UV. A imagem preparou amostras imediatamente, seguindo a etapa 3, exceto para as seguintes modificações importantes. Como a cinesina não é controlada pela ativação da luz, ela começa a funcionar imediatamente após a etapa 4.4.3, então marque esse tempo como t = 0. Para obter uma imagem do composto o mais próximo possível do estado inativo inicial (t = 0), imagine os canais (K) e (K+M) primeiro e observe o tempo decorrido entre a etapa 4.4.3 e o início da aquisição de dados (etapa 3.8). Na prática, esse tempo decorrido é de ~ 5 min. 5. Incorporação de reticulantes passivos em compósitos ativos NOTA: Estes passos descrevem como utilizar as subunidades de actina e tubulina biotiniladas e NeutrAvidin (NA) para reticular passivamente a actina a actina (A-A) ou microtúbulos a microtúbulos (M-M) nos compósitos activos descritos no passo 4. Prepare complexos reticulantes A-A ou M-M com proteínas biotiniladas (biotina-actina ou biotina-tubulina), NA e biotina na proporção de 2:2:1 biotina-actina/tubulina:biotina:NA. Inicie este processo antes da Etapa 4 .Para reticuladores A-A, use uma micropipeta e pontas de pipeta estéreis para adicionar 2 μL de biotina-actina de 11,6 μM, 1,39 μL de 8,33 μM de NA, 2,27 μL de biotina de 1,02 μM e 4,34 μL de PEM a um tubo de microcentrífuga. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo. Para reticuladores M-M, use uma micropipeta e pontas de pipeta estéreis para adicionar 1,86 μL de 4,55 μM de biotina-tubulina, 1,11 μL de 8,33 μM NA, 1,82 μL de biotina 1,02 μM e 5,21 μL de PEM a um tubo de microcentrífuga. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo. Envolver o(s) tubo(s) da etapa 5.1.1 e/ou 5.1.2 em película termoplástica de vedação para criar uma vedação estanque. Coloque em uma jangada de flutuação em um banho de sonicador com temperatura controlada ajustado para 4 °C. Sonicate durante 90 min a 4 °C. Na prática, é melhor colocar o sonicator em uma sala fria e adicionar compressas de gelo ao banho de sonicação para manter a baixa temperatura. Para incorporar complexos de reticulação em amostras para geração de imagens, siga a etapa 4.3, modificando a etapa 4.3.1 conforme descrito abaixo para a reticulação A-A (etapa 5.2.1) ou a reticulação M-M (etapa 5.2.2).Para a reticulação A-A, combinar o seguinte num tubo de microcentrífuga: 1,94 μL de PEM, 4,50 μL de 1% de Tween20, 2,18 μL de 47,6 μM de actina, 3,46 μL de 45,5 μM de 5-R-tubulina, 1,13 μL de reticulantes A-A (passo 5.1.1), 4,50 μL de 100 mM ATP, 4,50 μL de 10 mM GTP, 1,13 μL de 200 μM de taxol, e 1,57 μL de 20 μM 488-faloidina. Certifique-se de que o volume total é de 25 μL. Para a reticulação M-M, combinar o seguinte num tubo de microcentrífuga: 1,97 μL de PEM, 4,50 μL de Tween20 a 1%, 2,18 μL de actina de 47,6 μM, 3,76 μL de 45,5 μM de tubulina 5-R-M, 1,13 μL de diluição 1:4 de reticulantes M-M (passo 5.1.2), 4,50 μL de ATP de 100 mM, 4,50 μL de GTP de 10 mM, 1,13 μL de taxol de 200 μM, e 1,57 μL de 20 μM 488-faloidina. Certifique-se de que o volume total é de 25 μL. Siga as etapas 4.3.2-4.5 com as concentrações específicas para uma relação molar reticulante:actina de RA = 0,02 e razão molar reticulante:tubulina de RT = 0,005. Estes valores de R A e R T resultam em comprimentos semelhantes entre reticulantes ao longo de filamentos de actina e microtúbulos (d A 60 nm e d MT 67 nm), estimados utilizando d A = I monómero/2R A, em que I monómero é o comprimento de ummonómero de actina, e d MT = Ianel/26RT, em que I anel é o comprimento de umanel de 13 tubulinas 15, 17.

Representative Results

Para determinar o preparo bem-sucedido de compósitos ativos (Figura 1) e caracterizar sua dinâmica e estrutura, um microscópio de fluorescência de varredura a laser com pelo menos dois canais de fluorescência é utilizado para visualizar os filamentos de actina e microtúbulos simultaneamente (Figura 2 e Figura 6). Todos os filamentos de actina e microtúbulos nos compósitos são esparsamente marcados, em vez de doping em filamentos brilhantes traçadores, como é frequentemente feito em estudos in vitro. Este método garante que a dinâmica e a estrutura medidas são representativas do próprio compósito e não dos traçadores que são formados em condições diferentes dos compósitos. Por esta razão, filamentos de actina individuais e microtúbulos normalmente não podem ser resolvidos, em vez disso, as imagens retratam a estrutura da rede de mesoescala (Figura 2 e Figura 6). Essa abordagem de marcação foi otimizada para análises de autocorrelação de imagem espacial (SIA) e microscopia dinâmica diferencial (DDM) que examinam a dinâmica e a estrutura no espaço recíproco de Fourier (Figura 4, Figura 5 e Figura 8)52,53,54,55. A velocimetria por imagem de partícula (PIV) também pode ser usada para descrever e caracterizar campos dinâmicos e de fluxo (Figura 3 e Figura 7), mas requer pixel-binning (menor resolução espacial) e maiores incrementos de tempo de atraso (menor resolução temporal) do que SIA e DDM para eliminar vetores errôneos que surgem do ruído nas imagens densas e de baixo sinal. No entanto, o PIV é recomendado para exame qualitativo dos campos de fluxo e corroboração dos resultados do DDM (Figura 4 e Figura 8)26,50. A caracterização amostral das redes descritas usando essas análises (ou seja, DDM, SIA, PIV) é fornecida para auxiliar os pesquisadores na adoção de análises semelhantes para benchmark e caracterização de suas amostras. No entanto, descrições detalhadas dessas técnicas estão fora do escopo deste trabalho. Para obter descrições detalhadas de como executar DDM nesses e em outros sistemas similares, incluindo código Python fácil de usar, consulte os trabalhos anteriores 17,26,49,50 e as referências lá dentro. Para detalhes sobre como realizar SIA e PIV nos sistemas aqui descritos, o leitor é direcionado para trabalhos anteriores 17,50. Vários controles, descritos abaixo, devem ser feitos para garantir que os compósitos estejam funcionando conforme o esperado. Um compósito sem miosina ou cinesina deve parecer essencialmente estático com flutuações térmicas mínimas ou deriva. Os filamentos de actina e os microtúbulos devem aparecer co-emaranhados e distribuídos homogeneamente, com agrupamento mínimo, agregação ou separação de fases da actina e dos microtúbulos ao longo de um campo de visão de ~200 μm x 200 μm (Figura 2, extrema esquerda)17. Deve-se esperar um resultado semelhante para compósitos que contêm miosina, mas não são expostos à luz de 488 nm (para desativar a blebbistatina). Após a incorporação de miosina e exposição à luz de 488 nm, os compósitos sofrem contração em grande parte isotrópica e semelhante para actina e microtúbulos, como visto em imagens de microscópio tiradas antes e após a atividade da miosina (Figura 2), bem como campos de fluxo de VPI correspondentes para tempos variados durante a atividade (Figura 3). Para determinar se o movimento é balístico, difusivo, subdifusivo, etc., o tempo de descorrelação característico τ(q) determinado a partir de DDM é avaliado em função do vetor de onda (ou seja, espaço recíproco). Veja como descrito em detalhes anteriormente 17,26,49. A Figura 4 também demonstra como usar o DDM para caracterizar esses compósitos. A escala da lei de potência τ(q)~1/vq β, com β = 1, indica movimento balístico com velocidade v. Para referência, β = 2 representa a dinâmica difusiva com v sendo o coeficiente de difusão. Todos os compósitos ativos apresentam descamação balística (Figura 4A) com velocidades que são sintonizadas pelas concentrações de actina e miosina (Figura 4B), e que podem variar no tempo durante a atividade, acelerando ou desacelerando (Figura 4C,D). A reestruturação e o agrupamento da rede, visíveis na Figura 2 e mais evidentes para maiores concentrações de actina e miosina, podem ser caracterizados por meio do SIA, conforme descrito na Figura 5, e descrito anteriormente 17,48,50. Resumidamente, um comprimento de correlação ξ, que é uma medida do tamanho característico das características em uma imagem, pode ser determinado ajustando cada curva de autocorrelação de intensidade espacial g(r) a uma função exponencial de distância r entre pixels. Picos g(r) maiores que persistem por distâncias mais longas indicam características estruturais maiores (ou seja, empacotamento, agrupamento dos filamentos individuais). Como mostrado na Figura 5, para maiores frações de actina e concentrações de miosina, a reestruturação e agregação significativas se refletem no aumento de ξ ao longo do tempo. As propriedades viscoelásticas e a resposta mecânica não linear dos compósitos ativos também podem ser medidas usando microrreologia de pinças ópticas (OTM). No entanto, protocolos e resultados representativos para esses experimentos estão fora do escopo deste trabalho. Os leitores interessados são encaminhados para trabalhos anteriores48,56 que descrevem minuciosamente como realizar medições OTM e os resultados esperados. Usando o mesmo programa de ferramentas experimentais e de análise descrito acima, a seção a seguir descreve como a dinâmica e a estrutura mudam quando os motores de cinesina e os reticulantes de biotina-NA são incorporados aos compósitos (Figura 6, Figura 7 e Figura 8). A Figura 6 mostra imagens confocais representativas de compósitos acionados por cinesina somente (K) ou cinesina e miosina (K+M), com e sem reticulação passiva (XL) de filamentos de actina ou microtúbulos. A incorporação de cinesina em compósitos inicialmente resulta em dinâmica e reestruturação semelhantes às dos compósitos impulsionados pela miosina, como visto na linha superior da Figura 7 (Classe 1). No entanto, a dinâmica normalmente transita para o fluxo anisotrópico em larga escala (Figura 7 linha do meio, Classe 2), aceleração e desaceleração (Figura 7 linha inferior, Classe 3). Essas características se acoplam ao agrupamento e agregação da mesoescala após 5-30 min (Figura 6 e Figura 8B). Os campos de fluxo gerados pelo PIV e os mapas temporais de cores mostrados na Figura 7 mostram exemplos de reestruturação isotrópica (Classe 1, painel superior), fluxo direcionado (Classe 2, painéis do meio) e aceleração bidirecional (Classe 3, painéis inferiores). As velocidades de actina e microtúbulos em diferentes pontos de tempo durante a atividade, determinadas através de ajustes às curvas τ(q), ilustram a aceleração seguida de desaceleração (Figura 8), que depende da reticulação. Como também mostrado na Figura 8, quando ambas as proteínas motoras são incorporadas, a dinâmica é realmente mais lenta do que os compósitos somente de cinesina, e há um início tardio do fluxo de mesoescala. A miosina também suporta uma interpenetração mais homogênea das redes de actina e microtúbulos ao longo da duração da atividade, bem como menos agregação e reestruturação. Esses efeitos podem ser observados nas imagens da Figura 6 e são quantificados pelos comprimentos de correlação variáveis no tempo computados via SIA, que geralmente são menores na presença de miosina (Figura 8B). Figura 1. Projeto e caracterização de compósitos ativos actina-microtúbulos com múltiplos motores geradores de força e reticuladores passivos. (A) Monômeros de actina e dímeros de tubulina são copolimerizados nas concentrações molares c A e c T de 0,73-11,6 μM e frações molares de actina Φ A= c A/ (c A+ c T) = 0, 0,25, 0,5, 0,75 e 1, para formar redes co-emaranhadas de filamentos de actina (verde) e microtúbulos (vermelho). A reticulação passiva é obtida usando NA para ligar filamentos de actina biotinilados (Actin XL) ou microtúbulos (MT XL) nas relações molares de reticulação:proteína de R A = 0,01-0,08 e RMT = 0,001-0,01 para actina e microtúbulos, respectivamente. Minifilamentos de miosina-II (roxo) e aglomerados de cinesina (laranja), nas concentrações de c M= 0,12 – 0,48 μM e cK= 0,2 – 0,7 μM, empurram e puxam os filamentos para expulsar os compósitos do estado estacionário. (B) Esquema do espaço de formulação. Minifilamentos de miosina II (M), aglomerados de cinesina (K) ou ambos os motores (K+M) são incorporados em compósitos sem reticulantes passivos (No XL), ligações cruzadas actina-actina (Actin XL) e ligações cruzadas microtúbulo-microtúbulo (MT XL). Nem todos os desenhos animados são desenhados em escala. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Imagem confocal de duas cores de compósitos de citoesqueleto acionados por miosina com concentrações variáveis de miosina cM e frações de actina molar ΦA. (A) Imagens de microscopia confocal de duas cores de 256 x 128 pixels quadrados (212 x 106 μm 2) mostram como compósitos de filamentos de actina (verde) e microtúbulos (vermelho) são rearranjados através da atividade motora da miosina. Não há motores de cinesina ou reticulantes passivos presentes. Em cada painel, são mostradas imagens tiradas no início (esquerda, antes) e no final (direita, depois) da ativação da miosina de 45 min (via iluminação com luz de 488 nm para desativar a blebistatina). Os painéis são ordenados pelo aumento da concentração molar de miosina (cM), indo da esquerda para a direita, e pelo aumento da fração molar de actina (ΦA), indo de cima para baixo. As cores que delineiam cada painel correspondem ao código de cores usado na Figura 4 e na Figura 5. As barras de escala são de 50 μM. Para melhor capturar a dinâmica e a estrutura para análise, usamos taxas de quadros de 1-5 fps, ROIs com lados de 50-250 μm e durações de séries temporais de 5-45 min, dependendo da taxa de contração e rearranjo. Painéis nos quais as imagens de antes e depois parecem semelhantes indicam uma reestruturação mínima, como visto nos painéis rosa, magenta e ciano. O agrupamento em pequena escala, evidenciado pelo aumento da heterogeneidade e pela presença de características pontuais brilhantes, pode ser visto nos painéis laranja, verde e vermelho. A contração em larga escala, vista como uma rede uniformemente encolhida, é evidente nos painéis azul e roxo. Este valor foi modificado a partir da referência17. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. A velocimetria por imagem de partículas (PIV) mostra que a atividade da actomiosina desencadeia a dinâmica contrátil coordenada da actina e dos microtúbulos em compósitos co-emaranhados. Campos de fluxo PIV para actina (linha superior) e microtúbulos (linha inferior) em um composto acionado por miosina com (ΦA, cM) = (0,5, 0,24) em tempos crescentes durante uma série temporal de 6 minutos. Os campos de fluxo foram gerados usando o plugin Fiji/ImageJ PIV com um tempo de atraso de 20 s e 2 pixels x 2 pixels. Tanto a actina quanto os microtúbulos mostram um movimento consistente direcionado para a região central do campo de visão durante toda a duração do filme. As barras de escala em todas as imagens são de 50 μm. Diferentes cores de seta correspondem a diferentes velocidades, conforme indicado na escala de cores à direita dos campos vetoriais. Este valor foi modificado a partir da referência26. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. A microscopia dinâmica diferencial (DDM) resolvida pelo tempo mede a taxa e o tipo de movimento da actina e dos microtúbulos em compósitos ativos. (A) O DHM é realizado em canais de microtúbulos (símbolos abertos) e actina (inferior, símbolos preenchidos) de séries temporais para determinar os tempos de decaimento característicos τ vs número de onda q para actina (símbolos preenchidos) e microtúbulos (símbolos abertos), conforme descrito anteriormente17,26. Todas as curvas seguem a escala τ ~ q-1, indicando movimento balístico, com velocidades v que são determinadas via ajustes para τ(q) = (vq)-1. Velocidades mais rápidas correspondem a valores τ(q) menores para qualquer dado q. As cores e formas dos símbolos correspondem a (Φ A, cM) combinações mostradas em B. (B) As velocidades de contração v são determinadas através de ajustes às curvas τ(q) mostradas em A, que são calculadas em média em todos os tempos de atraso para a duração de cada série temporal de 45 minutos. (C) DDM resolvido pelo tempo (trDDM) quantifica como a dinâmica varia ao longo do tempo, avaliando τ(q) para actina (símbolos preenchidos, esquerda) e microtúbulos (símbolos abertos, direita) para intervalos consecutivos de 6 minutos (denotados por diferentes tons da mesma cor) durante o tempo de ativação de 45 minutos. trDDM é realizado para cada combinação (ΦA, cM) (denotada por diferentes símbolos e cores), conforme descrito na legenda no canto inferior direito. As curvas τ(q) mostradas em C seguem escalas e tendências semelhantes às de A, mas também mostram dependência de tempo para certas composições (Φ A, cM), mais notavelmente para Φ A = 0,75. (D) As velocidades de contração dos filamentos de actina (símbolos fechados) e dos microtúbulos (símbolos abertos) são determinadas a partir de ajustamentos às curvas τ(q) correspondentes. As barras de erro em todos os gráficos representam o erro padrão de valores em três a cinco replicações. Este valor foi modificado a partir da referência17. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5. A análise de autocorrelação de imagem espacial (SIA) quantifica a reestruturação motora de compósitos citoesqueléticos ativos. (A) Autocorrelação g(r) para os microtúbulos no início (esquerda, t = 0 min, tons escuros) e final (direita, t = 42 min, tons claros) do experimento para (ΦA, cM) formulações listadas na legenda. Inserção: exemplo ajusta-se de dados aos tempos inicial e final para (ΦA, cM) = (0,75, 0,12). (B) Comprimentos médios de correlação ξ para actina (símbolos fechados) e microtúbulos (símbolos abertos) para cada (Φ A, cM) determinados através de ajustes exponenciais de cada curva g(r), como mostrado na inserção em A. Os dados são divididos naqueles que exibem reestruturação mínima (esquerda) versus substancial (direita). As barras de erro em A e B representam o erro padrão em três a cinco replicações. Este valor foi modificado a partir da referência17. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6. Incorporando motores de cinesina e reticuladores passivos em compósitos ativos para aumentar a programabilidade e expandir o espaço de fase da dinâmica e da estrutura. (A) Imagens confocais de duas cores de actina (verde) e microtúbulos (vermelho) em compósitos ativos mostram uma reestruturação complexa dependente da formulação ao longo do tempo (listada em min). As cinco imagens em cada linha correspondem a cinco quadros de uma série temporal de 2000 quadros adquiridos para um composto impulsionado por cinesina (K, linhas 1, 3, 5) ou cinesina e miosina (K+M, linhas 2, 4, 6), e incluindo sem reticulantes passivos (No XL, linhas 1, 2), ligações cruzadas actina-actina (Actina XL, linhas 3, 4) ou ligações cruzadas microtúbulo-microtúbulo (MT XL, linhas 5, 6). As barras de escala são todas de 50 μm. As cores do contorno correspondem ao esquema de cores na Figura 8. (B) Canais separados de fluorescência de actina e microtúbulos para os compósitos somente de cinesina mostram estruturas variadas com co-localização de actina-MT e separação de microfases. As imagens mostradas são para compósitos com c A= 2,32 μM, c T= 3,48 μM, c K = 0,35 μM, cM= 0,47 μM (linhas 2, 4, 6), R A= 0,02 (linhas 3, 4) e R MT = 0,005 (linhas 5, 6). Todos os compósitos começam com redes interpenetrantes uniformemente distribuídas de actina e microtúbulos (coluna 1). Compósitos orientados por Kinesin sem reticulantes (linha 1) formam clusters amorfos vagamente conectados que são ricos em MT. A actina co-localiza-se nos centros desses agregados inicialmente, mas depois é espremida para fora das regiões ricas em MT que continuam a se contrair e se desconectar umas das outras. A reticulação actina-actina (linha 3) dificulta essa separação actina-MT em microescala e, em vez disso, os agregados ricos em MT são conectados através de longas cadeias de actina. A reticulação de actina também permite a absorção lenta de actina nas regiões ricas em MT, de modo que o composto se torna uma rede conectada de aglomerados de actina e MT co-localizados. A reticulação de microtúbulos (linha 5) leva ao agrupamento amorfo de MTs que se aglutinam ao longo do tempo, resultando em maior separação de fase de actina e MTs. A adição de miosina (linhas 2, 4, 6) reduz a desmistura e a reestruturação impulsionadas pela cinesina. Sem reticuladores (linha 2), os compósitos mostram pouco rearranjo ao longo de horas. A reticulação aumenta a reestruturação e a co-localização da actina e dos microtúbulos (linhas 4, 6). Especificamente, quando os microtúbulos são reticulados (linha 6), há uma interpenetração e reorganização significativas em redes de fibras semelhantes a redes. Este valor foi modificado a partir da referência50. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7. O PIV mostra que os compósitos ativos exibem três classes de campos de fluxo espaçotemporalmente distintos. (A) Campos de fluxo PIV para o primeiro (t i) e o último (tf) quadros de três séries temporais representativas, mostrando as diferentes classes dinâmicas que os compósitos mostrados na Figura 6 exibem. Campos de fluxo PIV para microtúbulos (superior) e actina (inferior) para vídeos de exemplo de classe 1 (superior, roxo), classe 2 (meio, laranja) e classe 3 (inferior, magenta), com cores de seta correspondentes à escala de velocidade universal na parte inferior e o mapa de cores em escala de cinza mostrando a distribuição de velocidade espacial, normalizado separadamente para cada campo de fluxo de acordo com a escala mostrada na parte inferior. As barras de escala são todas de 50 μM. (B) Distribuições angulares de vetores de velocidade de A (em unidades de radianos) com desvios-padrão iniciais e finais listados σ i e σf. (C) Os mapas temporais de cores para os vídeos analisados em A e B mostram a posição quadro a quadro de cada pixel em relação ao seu ponto de partida. Os mapas de classe 1 mostram movimentos aleatórios em pequena escala; os mapas de classe 2 retratam movimento unidirecional rápido com variação espacial ou temporal mínima; Os mapas da classe 3 exibem características das classes 1 e 2. Este valor foi modificado a partir da referência50. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8. DDM e SIA medem a dinâmica e a estrutura variáveis no tempo de compósitos de actina-microtúbulo de dois motores. (A) As velocidades dos compósitos descritas na Figura 6 e na Figura 7, medidas via DDM, mostram aceleração e desaceleração dos compósitos, programadas por reticulação e atividade de miosina. As velocidades dos microtúbulos (MT, círculos fechados) e da actina (A, círculos abertos) são plotadas em função do tempo de atividade em compósitos sem reticulação (topo, azul), reticulação de actina (meio, verde), reticulação de microtúbulos (inferior, vermelho), sem miosina (K, tons mais escuros) e com miosina (K+M, tons mais claros). Para casos de classe 3, que têm duas velocidades, a velocidade mais lenta é indicada por uma estrela. Os pontos de dados delimitados por círculos pretos tracejados correspondem à velocidade máxima vmaxpara cada formulação. As barras de erro (a maioria muito pequena para ver) são o erro padrão sobre os ajustes da lei de potência do τ(q) correspondente. (B) Comprimentos de correlação estrutural ξ, determinados via SIA, versus tempo de atividade, para o mesmo conjunto de séries temporais avaliadas em A. Cada ponto de dados é uma média dos comprimentos de correlação determinados para o primeiro e o último quadro da série temporal correspondente. Em geral, ξ aumenta no tempo para actina e microtúbulos em todos os sistemas compósitos, e os compósitos impulsionados exclusivamente pela cinesina têm maiores comprimentos de correlação do que aqueles em que a miosina também está presente. Os pontos de dados em A e B que correspondem às três séries temporais analisadas na Figura 7 são circulados na cor da classe correspondente (1 = roxo, 2 = laranja, 3 = magenta). Este valor foi modificado a partir da referência50. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Um dos principais avanços do sistema reconstituído descrito acima é a sua modularidade e ajustabilidade, de modo que os usuários são encorajados a modificar as concentrações de proteínas, motores, reticulantes, etc. para se adequar aos resultados desejados, seja para emular um determinado processo celular ou projetar um material com funcionalidade específica ou propriedades mecânicas. As limitações na faixa de concentração de actina e tubulina são estabelecidas no limite inferior pela concentração crítica necessária para polimerizar a actina (~0,2 μM)57,58,59 e tubulina (~3 – 4 μM)60, e no limite superior pela transição para o alinhamento nemático de filamentos de actina (~90 μM)61,62 ou microtúbulos (~35 μM)63 . Monômeros de actina e dímeros de tubulina devem ser polimerizados em filamentos juntos, em vez de misturados após a polimerização, para garantir que eles formem redes percoladas homogeneamente interpenetrantes que se apoiem sinergicamente umas às outras. A nova dinâmica que os compósitos exibem depende dessa interação. Embora geralmente seja importante seguir todas as etapas descritas no protocolo para reproduzir com sucesso os resultados mostrados, algumas etapas são mais exigentes, enquanto outras têm espaço para modificar e ajustar para atender às necessidades específicas e aos recursos disponíveis.

Por exemplo, um passo importante para garantir resultados reprodutíveis é preparar e armazenar adequadamente os reagentes seguindo as diretrizes fornecidas na Tabela de Materiais. As proteínas citoesqueléticas (actina, tubulina, miosina, cinesina) são lábeis e devem ser alíquotadas, congeladas com nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C em alíquotas de uso único. Uma vez removidas de -80 °C, as alíquotas devem ser mantidas no gelo. As proteínas citoesqueléticas não retêm de forma confiável a função após ciclos adicionais de congelamento-descongelamento.

Os microtúbulos são mais sensíveis à despolimerização e desnaturação do que a actina. Uma vez removida de -80 °C, a tubulina deve ser mantida no gelo antes da polimerização e usada dentro de 12 h. Uma vez polimerizados, os microtúbulos devem ser mantidos à temperatura ambiente. Também é fundamental estabilizar os microtúbulos com taxol para evitar a despolimerização. A estabilização da faloidina dos filamentos de actina também é importante para suprimir a esteira de actina consumidora de ATP que compete com a atividade da miosina e da cinesina.

A ultracentrifugação dos motores da miosina é outro passo crítico, pois remove as cabeças mortas inativas da miosina. Não remover os monômeros enzimaticamente inativos resulta em reticulação passiva da rede de actina e perda de atividade. Para prolongar a atividade da ATPase dos motores, um sistema de regeneração de ATP, como fosfato de creatina e creatina fosfoquinase64 , pode ser incorporado.

Finalmente, a manutenção da atividade composta requer a inibição da adsorção de filamentos e motores às paredes da câmara de amostra, o que pode ser alcançado pela passivação das tampas e lâminas do microscópio. As proteínas motoras são particularmente propensas à adsorção, o que resulta no compósito sendo puxado para a superfície da câmara de amostra, movendo-se para fora do campo de visão, colapsando para 2D e não passando mais por atividade. Silanizar as coberturas e deslizamentos é uma maneira eficaz de passivar as superfícies e evitar a adsorção (ver etapa 1). Um método alternativo de passivação utilizado de forma eficaz em experimentos de citoesqueleto in vitro é o revestimento da superfície com uma bicamada lipídica, semelhante à membrana celular18. Este método é vantajoso se se deseja amarrar proteínas à superfície ou introduzir outras interações específicas proteína-superfície, porque a bicamada pode ser funcionalizada. Para experimentos com pinças ópticas, a passivação das microesferas também é crítica, e pode ser alcançada pelo revestimento de microesferas carboxiladas com BSA ou PEG via química de reticulação de carbodiimida48.

Existem alguns aspectos dos protocolos apresentados que os pesquisadores podem considerar alterar para atender às suas necessidades. Em primeiro lugar, os pesquisadores podem optar por substituir os reticulantes não nativos de biotina-NA por reticuladores biológicos, como a alfa-actinina ou o MAP65, que cruzam actina e microtúbulos, respectivamente 28,65,66. O uso de reticulantes não nativos nos compósitos descritos aqui é motivado por sua maior reprodutibilidade, estabilidade e sintonia em comparação com os reticulantes nativos. Devido à forte ligação biotina-NA, os reticulantes podem ser considerados permanentes, em vez da maioria dos reticulantes nativos que se ligam transitoriamente a taxas de rotatividade abrangentes. A dinâmica da reticulação transitória complica a análise das contribuições de reticuladores e motores para a dinâmica. Além disso, os ligadores de biotina-NA podem ser versatilmente usados para reticular actina e microtúbulos, bem como reticular actina a microtúbulos. Desta forma, uma comparação inequívoca entre os motivos de reticulação pode ser feita, mantendo todas as outras variáveis (por exemplo, tamanho do reticulante, afinidade de ligação, estequiometria, etc.) fixas. Finalmente, os reagentes necessários para incorporar ligadores de biotina-NA são amplamente disponíveis comercialmente, bem caracterizados e comumente usados em muitos laboratórios de biofísica. No entanto, um dos principais pontos fortes da plataforma in vitro descrita aqui é sua modularidade, de modo que os pesquisadores devem ser capazes de substituir perfeitamente os ligadores de biotina-NA por ligadores nativos, caso escolham.

Em segundo lugar, no protocolo atual, monômeros de actina e dímeros de tubulina são polimerizados em filamentos juntos em um tubo de centrífuga antes de serem adicionados à câmara de amostra. O fluxo da solução de proteínas filamentosas emaranhadas para a câmara de amostra pode causar alinhamento de fluxo, especialmente dos microtúbulos, o que quebra a isotropia desejada e a homogeneidade dos compósitos. De fato, um grande avanço em trabalhos prévios sobre compósitos actina-microtúbulos de estado estacionário foi a capacidade de copolimerizar actina e microtúbulos in situ (na câmara de amostra) para garantir a formação de redes interpenetrantes isotrópicas de actina e microtúbulos15,16,27. No entanto, estender essa abordagem a compósitos ativos exigiria adicionar os motores à amostra antes da polimerização de actina e tubulina e ter toda a amostra incubada em conjunto a 37 °C antes dos experimentos. Testes dessa variação do protocolo resultaram em polimerização reduzida da actina e nenhuma atividade motora discernível, provavelmente devido à atividade concorrente da ATPase e à incubação prolongada de 37 °C dos motores. Felizmente, não há alinhamento de fluxo discernível dos compósitos ao seguir os protocolos atuais, como pode ser visto na Figura 2, Figura 3 e Figura 6. No entanto, os pesquisadores são encorajados a projetar protocolos que permitam a formação in situ de compósitos ativos.

Outro ponto de consideração é o esquema de marcação por fluorescência, que envolve a marcação esparsa de todos os filamentos de actina e microtúbulos na rede. Esta abordagem de marcação foi otimizada para visualizar diretamente a estrutura da rede, em vez de inferir estrutura e dinâmica através de filamentos traçadores ou microesferas. No entanto, a desvantagem é que os filamentos individuais não são brilhantemente rotulados e resolúveis. Uma abordagem que os pesquisadores poderiam adotar tanto para resolver filamentos únicos quanto para visualizar a estrutura da rede é dopar filamentos pré-formados marcados com outro fluoróforo, para que tanto a rede circundante quanto os filamentos individuais pudessem ser fotografados simultaneamente. No entanto, ao usar mais de dois fluoróforos e canais de excitação / emissão, o sangramento entre os canais é muitas vezes difícil de eliminar, portanto, deve-se tomar cuidado na escolha dos fluoróforos, filtros e intensidades de laser.

Uma limitação relacionada é a incapacidade de visualizar os motores de miosina ou cinesina nos compósitos. Os monômeros de actina marcados com fluorescência e dímeros de tubulina usados estão comercialmente disponíveis, enquanto a visualização de miosina ou cinesina em compósitos requer marcação interna. Os pesquisadores são encorajados a dar o próximo passo para rotular motores, como feito anteriormente18,67, para serem capazes de vincular inequivocamente a atividade motora e a ligação à dinâmica e às estruturas que nossos compósitos exibem.

Finalmente, é importante notar que, no protocolo atual, o início e a duração da atividade da cinesina não são controlados. Como a atividade da miosina é controlada usando a foto-desativação da blebistatina, conforme descrito acima, para construir uma ativação semelhante da luz da cinesina, pode-se incorporar ATP ativado pela luz.

Para aumentar a complexidade dos projetos aqui descritos, para melhor imitar as condições celulares e ampliar o espaço de parâmetros dinâmico-estrutura-função, trabalhos futuros se concentrarão na incorporação de filamentos intermediários, como a vimentina68,69, bem como outros motores, como a dineína13,70. A gelsolina também será incorporada em diferentes concentrações para controlar o comprimento da actina14, bem como a proteína tau para controlar a rigidez dos microtúbulos.

Em resumo, os protocolos apresentados descrevem como projetar, criar e caracterizar a dinâmica, a estrutura e a mecânica dos sistemas de matéria ativa inspirados no citoesqueleto, que contêm dois componentes separados geradores de força ativa que atuam em diferentes substratos em um único sistema. Esta plataforma ajustável e modular traz esforços de reconstituição um passo importante mais perto de imitar o citoesqueleto celular e oferece a capacidade única de programar suas propriedades em um amplo espaço de fase, incorporando, removendo e ajustando de forma independente os diferentes componentes. Além disso, todos os componentes deste sistema versátil estão comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais), exceto os dímeros de cinesina que são purificados no Ross Lab, conforme descrito anteriormente50, e disponíveis mediante solicitação. Finalmente, todo o código de análise está disponível gratuitamente através do GitHub49 e é baseado em linguagens de programação e software livres (Python e Fiji). Espera-se que a disseminação transparente de protocolos para projetar esses sistemas torne essa plataforma mais acessível a um grupo diversificado de usuários com diferentes conhecimentos, origens, afiliações institucionais e objetivos de pesquisa.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Maya Hendija e ao Dr. Jonathan Michel pela assistência com a análise de dados, e à Dra. Janet Sheung, ao Dr. Moumita Das e ao Dr. Michael Rust por discussões e orientações úteis. Esta pesquisa foi apoiada por uma Bolsa de Pesquisa da Fundação William M. Keck e pelo Prêmio DMREF NSF (DMR 2119663) concedido à RMRA e JLR e aos Subsídios R15 dos Institutos Nacionais de Saúde (R15GM123420, 2R15GM123420-02) concedidos à RMR-A e RJM.

Materials

(-)-Blebbistatin
 Abbreviation used in paper: blebbistatin		 Sigma Aldrich B0560 Stock Concentration: 200 μM in DMSO
Storage: dessicated, in DMSO, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: dissolve 1 mg of powder to 200 μM in DMSO
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: limited shelf-life, typically stops functioning reliably after 3-4 months. purchase and prepare new solution every 3 months. 
1:20 488-tubulin:tubulin mixture
 Abbreviation used in paper: 5-488-tubulin		 NA NA Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and 488-tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
1:20 R-tubulin:tubulin mixture
 Abbreviation used in paper: 5-R-tubulin		 NA NA Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and rhodamine tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
actin (biotin): skeletal muscle
 Abbreviation used in paper: biotin-actin		 Cytoskeleton AB07 Stock Concentration: 1 mg/ml in G-buffer
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: (1) immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM, (2) once removed from -80ºC, store  aliquot on ice at 4ºC for up to 1 week
actin (rhodamine): rabbit skeletal muscle
 Abbreviation used in paper: R-actin		 Cytoskeleton AR05 Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store  aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week
adenosine triphosphate
 Abbreviation used in paper: ATP		 Thermo Fisher Scientific A1048 Stock Concentration: 100 mM
Storage: in solution (pH 7), -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconsitute in DI H20, bring pH to 7 with NaOH
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: routinely check pH and adjust as needed, hydrolyzes over time, replace every ~6-12 months
AlexaFluor488 Phalloidin
 Abbreviation used in paper: 488-phalloidin		 Thermo Fisher Scientific A12379 Stock Concentration: 100 μM DMSO
Storage: protected from light, dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 20 μM in PEM (1 μL in 4 μL PEM)
AlexaFluor488–labeled actin
 Abbreviation used in paper: 488-actin		 Thermo Fisher Scientific A12373 Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: this item has been discontinued
Basic Plasma Cleaner
 Abbreviation used in paper: plasma cleaner		 Harrick Plasma PDC-32G
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
 Abbreviation used in paper: transparent film		 Thermo Fisher Scientific 13-374-5
D-(+)-Glucose
 Abbreviation used in paper: 		 Thermo Fisher Scientific A1682836 Stock Concentration: 100x
Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 4.5 mg/ml in DI H20
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should 45 μg/mL 
D-Biotin
 Abbreviation used in paper: biotin		 Fisher Scientific BP232-1 Stock Concentration: 1.02 mM in PEM
Storage: dessicated, 4ºC
deionized nanopure water
 Abbreviation used in paper: DI
Dimethyldichlorosilane
 Abbreviation used in paper: silane		 Thermo Fisher Scientific D/3820/PB05 Stock Concentration: 2% dissolved in Toulene
Dithiothreitol
 Abbreviation used in paper: DTT		 Thermo Fisher Scientific R0861 Stock Concentration: 1 M in DMSO
Storage: dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: dilute to 2 mM in PEM immediately before each experiment
DMSO Anhydrous
 Abbreviation used in paper: DMSO		 Thermo Fisher Scientific D12345
F-Buffer
 Abbreviation used in paper: F-buffer		 NA NA Stock Concentration: 10x
Storage: dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: 10 mM Imidazole (pH 7.0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.2 mM ATP
G-Buffer
 Abbreviation used in paper: G-buffer		 NA NA Stock Concentration: 10x
Storage: dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: 2.0 mM Tris (pH 8), 0.2 mM ATP, 0.5 mM DTT, 0.1 mM CaCl2. Store at -20°C.
glass microscope slide
 Abbreviation used in paper: slide		 Thermo Fisher Scientific 22-310397
Glucose oxidase + catalase + β-mercaptoethanol
 Abbreviation used in paper: GOC		 Sigma Aldrich G2133-250KU, C1345, 63689  Stock Concentration: 100x
Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC
Stock and Experiment Recipes: For 100x: 4.3 mg/ml glucose oxidase, 0.7 mg/ml catalase, 0.5% v/v  β-mercaptoethanol in DI H20
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should be: 0.005% β-mercaptoethanol, 43 μg/mL glucose oxidase, 7 μg/mL catalase
glu-GOC oxygen scavenging system
 Abbreviation used in paper: glu-GOC		 NA NA Stock Concentration: 100x
Storage: prepare fresh each time
Stock and Experiment Recipes: mix equal parts Glu and GOC and add at 1/100 final sample volume immediately before imaging
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: prepare from Glu and GOC immediately before imaging
Guanosine triphosphate
 Abbreviation used in paper: GTP		 Thermo Fisher Scientific R0461 Stock Concentration: 100 mM
Storage: 100 μL aliquots at -20ºC
Instant Mix 1-minute epoxy
 Abbreviation used in paper: epoxy		 Loctite 1366072 
Kinesin-1 401 BIO 6x HIS
 Abbreviation used in paper: kinesin		 Prepared in JL Ross Lab at Syracuse University NA Stock Concentration: 8.87 μM in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: biotinylated dimers form kinesin clusters, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC
NeutrAvidin
 Abbreviation used in paper: NA		 Thermo Fisher Scientific 31000 Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM
No 1. glass coverslips (24 mm x 24 mm)
 Abbreviation used in paper: coverslip		 Thermo Fisher Scientific 12-548-CP
Paclitaxel 
 Abbreviation used in paper: Taxol		 Thermo Fisher Scientific P3456 Stock Concentration: 2 mM in DMSO
Storage: protected from light, dessicated, -20ºC
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mM with DMSO
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 200 μM in DMSO (0.4 μL in 3.6 μL DMSO)
PEM-100
 Abbreviation used in paper: PEM		 NA NA Stock Concentration: 1x
Storage: room temperature (RT)
Stock and Experiment Recipes: 100 mM K-PIPES (pH 6.8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: use KOH to adjust pH to 6.8, recheck pH often and adjust accordingly
phalloidin
Abbreviation used in paper: phalloidin		 Thermo Fisher Scientific P3457 Stock Concentration: 100 μM in DMSO
Storage: protected from light, dessicated, -20ºC, adhere closely to storage/handling conditions
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: susceptible to impurities in its preparation and denaturing, identifiable as large amorphous aggregates of actin in samples
porcine brain tubulin
 Abbreviation used in paper: tubulin		 Cytoskeleton T240 Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC
Potassium Chloride
 Abbreviation used in paper: KCl		 Thermo Fisher Scientific AM9640G Stock Concentration: 4 M
Storage: RT
Rabbit skeletal actin
 Abbreviation used in paper: actin		 Cytoskeleton AKL99 Stock Concentration: 2 mg/ml in G-buffer
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store  aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week
Rabbit skeletal myosin II
 Abbreviation used in paper: myosin		 Cytoskeleton MY02 Stock Concentration: 10 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 10 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: monomers form minifilaments at low KCl, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC
Tubulin (biotin): porcine brain
 Abbreviation used in paper: biotin-tubulin		 Cytoskeleton T333P Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM
Tubulin (fluorescent HiLyte 488): porcine brain
 Abbreviation used in paper: 488-tubulin		 Cytoskeleton TL488M Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
tubulin (rhodamine): porcine brain
 Abbreviation used in paper: R-tubulin		 Cytoskeleton TL590M Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM
Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles
Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2
Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light
Tween 20
 Abbreviation used in paper: Tween20		 Thermo Fisher Scientific J20605.AP Stock Concentration: 1% v/v in DI H20
Storage: RT
ultracentrifuge grade microtubes
 Abbreviation used in paper: Beckman-Coulter Optima Max XP 		 Beckman Coultier 343776 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: 8×34 mm PC
UV light curing glue
 Abbreviation used in paper: UV glue		 Pharda SKG-2869
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Sasanpour, M., Achiriloaie, D. H., Lee, G., Leech, G., Hendija, M., Lindsay, K. A., Ross, J. L., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics. J. Vis. Exp. (186), e64228, doi:10.3791/64228 (2022).
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