インビボ 大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

PVDCラップ法を用いた大型頭蓋窓の評価手術直後は、損傷や虚血による出血や色の変化など、皮質表面の状態によって一目で成否を確認することができます。手術後長期間、感染により皮質表面が不透明な白い膜で覆われたり、出血により血液が窓を覆ったりすることがあります(図2G)。これらの場合、皮質は健康な状態ではない可能性があり、イメージングは不可能である可能性があります。これらは、部分的に切断されたラップまたは接着剤によるラップの不十分な固定によって引き起こされる可能性があります。感染が繰り返し観察される場合は、抗生物質、例えば硫酸ゲンタマイシン(10μL、50mg/mL)を窓の配置時に脳表面に塗布することが効果的である可能性がある。髄膜または骨の再生は、皮質表面とラップとの間の垂直方向のギャップが大きい場合にも見られる。これを防ぐには、ウィンドウの準備中にラップを脳表面にできるだけしっかりと適用することが重要です。これは、脳の表面にラップを置き、できるだけ多くのACSFを吸い出すことで実現できます。ACSFがない場合は、ラップを脳表面に置くだけで実行できます。脳と血管は、脳の色が変色せず、血管が切断されていないという事実によって損傷を受けていないと判断されます。 窓の寿命は手術の質に大きく依存します。状態が良好な場合、手術後1か月以上感染、出血、または再生の兆候はありません(図2F および 図3B)。10匹中8匹のマウスでは、ウィンドウは10週間以上クリアに維持できました。.2匹のマウスの窓は、感染または出血のために適切に維持できなかった。大きな窓は機械的ストレスや衝撃を受けやすいかもしれませんが、窓の破損やひび割れは観察されませんでした。 ラップ、シリコーン、ガラスを用いた新しい頭蓋窓のイメージング品質を評価するために、寒天中の0.1 μm蛍光ビーズをイメージングすることにより、新しい窓の下での点像分布関数と従来のガラス窓の下の点像分布関数を比較しました( 補足ファイル1を参照)。結果は、両方の条件で半値全幅(FWHM)に差がないことを示しました。[X軸(μm):ガラスのみ、1.99 ± 0.07、ラップ、1.76 ± 0.13、Y軸(μm):ガラスのみ、2.11 ± 0.27、ラップ、1.90 ± 0.15、Z軸(μm):ガラスのみ、25.29 ± 0.71、ラップ、26.64 ± 1.02、N = 7ビーズ、p > 0.05、マン・ホイットニーU検定、 補足図2A、B]。 したがって、添加された新しい元素(ラップおよびシリコーン)は、画像品質を低下させなかった。 呼吸、心拍、および体の動きによって引き起こされる振動アーチファクトは、広視野および2光子イメージングに存在します。新しい頭蓋窓がどれだけ振動するかを決定するために、 in vivo の2光子イメージングデータから小さな蛍光粒子を選択し、その画像が60秒間にどれだけ移動するかを調べました。その結果、その蛍光粒子の重心の標準偏差は約0.3μmであり、従来のガラス窓下と同等であることがわかりました(補足図2C)。これは、脳が透明なシリコンプラグとカバーガラスで押さえられていたため、振動は従来の小さな窓で観察されたものに匹敵し、オフライン画像登録は振動アーチファクトを排除するのに十分であったことを示しています。 広視野カルシウムイメージングでは、感覚刺激によって誘導される皮質を横切って皮質活動が伝播するのを観察することができました(図3A-D、K-N)。二光子イメージングにより、神経細胞とグリア細胞に特異的な単一細胞蛍光画像の観察が可能になりました(図3E、O)。感覚刺激によって誘導される蛍光変化は、個々の細胞で観察することができた(図3E-J、O-T)。 PVDCラップとAAVを用いた大脳皮質の広域における遺伝子コードカルシウム指標(GECI)の発現窓のPVDCラップは、皮質の広い領域で機能タンパク質を発現するために適用することができます。これは、生体材料として広く応用されているカイコの繭の構成タンパク質であるAAVおよびフィブロインを用いて達成される37。以前の研究では、フィブロインをAAVと混合して、脳に埋め込まれた膜を形成して、光活性化可能なオプシンやGECIなどの機能タンパク質を発現できることが示されました36。本研究では、GECIとフィブロインを発現するAAVをラップ上で混合して乾燥させ、頭蓋窓にAAVコーティングラップを使用しました。これにより、手術後2〜4週間で皮質の広い領域にわたってGECIが発現しました(図3K-M)。ウィンドウが大きかったので、同じマウスの異なる皮質領域を画像化することができる(図3M-T)。 この方法の発現効率を確認するため、固定脳においてGECIを発現する細胞の数を計数した(補足図2D)。フィブロイン-AAVでラップを用いた本戦略は、表層と深層の両方で約20%の効率でGECIを発現させることがわかりました(L2/3:20.78%、XCaMP-R発現細胞:32細胞、DAPI:154箇所、L5:20.08%、XCaMP-R発現細胞:51細胞、DAPI:254箇所)。したがって、この方法は、表層だけでなくより深い層でも細胞内でGECIを発現させた。 図1:大きな頭蓋窓の概念図。 (A)左、新しい頭蓋窓の概略図。従来の窓(直径3mm)よりも大きくなっています。右、断面図。大きな頭蓋窓を作る方法は、フードラップ、透明なシリコーンエラストマー、およびカバーガラスを使用して、同じマウスからの広視野および2光子イメージングを可能にします。(B)頭蓋窓の作製手順:(a)骨の除去。(b)ラップの下でのACSFの削除。(c)ACSFを除去することによる脳表面へのラップの付着。(d)余分なラップを切り取ります。(e)透明シリコーンを塗布する。(f)カバーガラスを貼る。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:頭蓋窓手術の概要 。 (A)頭蓋窓に必要な材料と機器。(a)ポリ塩化ビニリデン(PVDC)ラッピングフィルム。(b)ミキシングチップを備えた透明シリコーンエラストマーのディスペンサー。(c)カバーガラス。(d)カバーガラスの2つの部分の間に置かれた透明なシリコーン。(B)頭蓋骨を露出させるために切開されたマウスの頭部皮膚の写真。マウスを麻酔し、マウスの頭部を耳バーを用いて固定した。その後、頭部を脱毛し、局所鎮痛剤で治療し、皮膚を切開した。(C)ヘッドプレート取り付け後の写真。ヘッドプレート(3Dプリンターの樹脂製)を歯科用セメントでマウスの頭部に取り付けた。(D)頭蓋窓の写真。頭蓋窓は、マウス脳の右半球の皮質に作成されました。硬膜を取り除き、ラップを所定の位置に接着しました。(E)透明なシリコンとカバーガラスを上にしたラップで作られた窓の写真。(F)成功したウィンドウの典型的な例(右半球、手術後7週間)。(G)失敗したウィンドウの例(両方の半球、手術後5週間)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:大きなウィンドウにより、同じマウスから広視野および2光子のカルシウムイメージングが可能です。 (A)カルシウムイメージングは、アストロサイト40において膜アンカーGECI(Lck-GCaMP6f)を発現するトランスジェニックマウスにおいて行った。(B)左は、ラップ、透明シリコン、カバーガラスで大きな窓を作成しました。広視野イメージングはこのウィンドウを通して行われた。右、写真は頭蓋窓の設置から79日後に撮影されました。(C)対側ウィスカーにエアパフ刺激を加えると、蛍光変化が認められた。(D)体性感覚皮質(Cの赤四角)における蛍光変化の経時変化をプロットした。赤と青のバーは、エアパフのタイミングと、(C)の「前」、「最中」、「後」のタイミングをそれぞれ示します。(E)2光子カルシウムイメージングの視野(CのFOV1)。GCaMP6fは膜に局在するように発現していたため、関心領域(白い四角)を手動で配置して、星状細胞プロセスにおける局所応答を検出しました。(F)(E)における色付きの四角の蛍光変化をプロットする。(G)(E)のすべての正方形における蛍光変化がプロットされる。横軸と縦軸はそれぞれ時間とセル数を示します。(H-J)(C)におけるFOV2(視覚野内)についてのデータが示されている。FOV2をFOV1で撮像した後に撮像した。(k)赤色GECI、XCaMP-Rを、野生型マウスにおいてフィブロイン-AAV法によりニューロンに発現させた。(L)フィブロイン膜を用いて窓を作成した術後2週間の写真。(m)このマウスで広視野カルシウムイメージングを行った。(N)ウィスカー刺激によって誘発される蛍光変化を、最も顕著な部位(体性感覚皮質、(M)の赤い四角)からプロットした。赤と青の線は、エアパフのタイミングと(M)の「前」と「最中」のタイミングをそれぞれ示しています。(O)深さ300μmでの2光子カルシウムイメージングの視野(体性感覚皮質、FOV1(M))。ROIは手動でニューロン体細胞に配置されました。(P)(O)における色付きの四角形の蛍光変化をプロットする。(Q)(O)のすべての正方形の蛍光変化をカラーでプロットします。(R-T)頭頂皮質に位置するFOV2in(M)についてのデータが示されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 補足図1:メスのヒント。 新しいメスの先端(上)と、鈍い先端(下)で頭蓋骨を切断するために使用されたメスと比較します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図2:新しい頭蓋窓とフィブロイン-AAV発現法の検証。 (A)寒天中の0.1 μm蛍光ビーズの蛍光強度プロファイル。上段は寒天に混合した蛍光ビーズの上にカバーガラスのみを置いた条件のデータ、下段はラップ、透明シリコーン、カバーガラスを載置した条件のデータです。灰色のトレースは各ビーズの蛍光強度プロファイルに対するガウスフィットを示し、赤色のトレースはそれらの平均値(n = 7)を示します。(B)(A)のデータの概要。各グラフは、XYZ軸上の点像分布関数の半値幅(FWHM)を示しています。灰色のプロットは各ビーズのデータを示し、赤色のプロットはそれらの平均誤差と標準誤差を示します。(C)2,000フレーム(60秒記録)の in vivo イメージングデータから、小さな蛍光粒子を選択し、60秒間に画像がどれだけ動いたかを調べた。中央の蛍光画像は平均2,000フレームを表しています。画像は、X軸方向とY軸方向に平均化することによって投影されました。ヒストグラムは、各フレームの重心の分布を示します。重心の標準偏差はX:0.36およびY:0.315μmであった。 (d)フィブロイン-AAV法によるGECI発現の例。左:フィブロイン-AAV発現法を適用した大脳皮質のスライス。赤と青はそれぞれXCaMP-RとDAPIからの蛍光を示します。XCaMP-Rは、第2/3層細胞だけでなく、第5層細胞でも発現していた。中央と右。左図のレイヤー2/3と5の拡大図(シアンの正方形)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ファイル1:(A)フィブロイン-AAVフィルム法によるラップの発現効率、(B)2光子イメージング時の点像分布関数の評価。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。