Determinando a permeabilidade intestinal usando o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out

Os enteroides são estruturas tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco intestinais humanas com restrição de órgãos ^1,2. Eles são compostos inteiramente de linhagem epitelial e contêm todos os tipos diferenciados de células epiteliais intestinais². Os enteróides também mantêm a polaridade celular composta por uma superfície luminal apical formando um compartimento interno e uma superfície basolateral voltada para o meio circundante. Os enteróides são um modelo único na medida em que preservam as características do hospedeiro a partir do qual foram gerados³. Assim, os enteroides gerados a partir de prematuros humanos representam um modelo útil para a investigação de doenças que acometem principalmente essa população, como a enterocolite necrosante (NEC).

O modelo enteróide tradicional é cultivado em uma conformação basolateral-out (BO), onde o enteróide é envolto em uma cúpula de matriz de membrana basal (BMM). A BMM induz o enteróide a manter uma estrutura 3D com a superfície basolateral do lado de fora. Os enteróides BO são um modelo adequado para NEC que preenche a lacuna entre linhagens celulares humanas primárias bidimensionais (2D) e modelos animais in vivo ^2,4. A NEC é induzida em enteroides pela colocação de patógenos como LPS ou bactérias no meio ao redor dos enteroides, seguida de exposição a condições hipóxicas ^2,3. O desafio com o modelo NEC enteróide BO é que ele não permite o estudo efetivo das interações hospedeiro-patógeno, que ocorrem na superfície apical in vivo. Alterações na permeabilidade intestinal são devidas a essas interações hospedeiro-patógeno. Para entender melhor como a permeabilidade afeta a base fisiopatológica da doença, um modelo deve ser criado que envolva o tratamento da superfície apical.

Co et al. foram os primeiros a demonstrar que enteroides BO maduros podem ser induzidos a formar uma conformação apical-out (AO) removendo as cúpulas de BMM e ressuspendendo-as em meio⁵. Este artigo demonstrou que os enteroides AO mantiveram a polaridade epitelial correta, continham todos os tipos de células intestinais, mantinham a barreira epitelial intestinal e permitiam o acesso à superfície apical⁵. O uso de enteroides AO como um modelo NEC alcança uma reprodução fisiológica do processo da doença e o estudo das interações hospedeiro-patógeno.

Um dos principais contribuintes para a fisiopatologia da NEC é o aumento da permeabilidade intestinal⁶. Diversas moléculas têm sido propostas como forma de testar a permeabilidade intestinal in vitro⁷. Dentre estes, o amarelo lúcifer (LY) é um corante hidrofílico com picos de excitação e emissão a 428 nm e 540 nm, respectivamente⁸. Ao atravessar todas as principais vias paracelulares, tem sido utilizado para avaliar a permeabilidade paracelular em diversas aplicações, incluindo as barreiras hematoencefálicas e epiteliais intestinais ^8,9. A aplicação tradicional de LY utiliza células cultivadas em monocamadas sobre uma superfície semipermeável¹⁰. O LY é aplicado à superfície apical e atravessa através de proteínas de junção apertada paracelular para se reunir no lado basolateral. Concentrações mais elevadas de LY no compartimento basolateral indicam diminuição das proteínas da junção apertada com subsequente quebra da barreira celular epitelial intestinal e aumento da permeabilidade¹⁰. Também foi descrita em modelos enteroides 3D BO onde LY foi adicionado ao meio e enteróides individuais foram fotografados para absorção de LY no lúmen¹¹. Embora isso permita a análise qualitativa através da visualização da absorção de LY, a análise quantitativa é limitada. Este protocolo descreve uma técnica única que usa LY para avaliar a permeabilidade paracelular usando um modelo enteróide NEC in vitro em enteróides AO, mantendo a orientação 3D. Este método pode ser usado para análise qualitativa e quantitativa da permeabilidade.