Bestimmung der Darmpermeabilität mit Lucifer Yellow in einem apikalen enteroiden Modell
Summary
Das vorliegende Protokoll skizziert eine Methode, die Luzifergelb in einem apikalen enteroiden Modell verwendet, um die Darmpermeabilität zu bestimmen. Diese Methode kann verwendet werden, um die parazelluläre Permeabilität in Enteroiden zu bestimmen, die entzündliche Darmerkrankungen wie nekrotisierende Enterokolitis modellieren.
Abstract
Enteroide sind ein aufstrebendes Forschungsinstrument bei der Untersuchung entzündlicher Darmerkrankungen wie nekrotisierender Enterokolitis (NEC). Sie werden traditionell in der basolateralen (BO) Konformation angebaut, wo die apikale Oberfläche der Epithelzelle dem inneren Lumen zugewandt ist. In diesem Modell ist der Zugang zur luminalen Oberfläche von Enteroiden für Behandlung und Experimente eine Herausforderung, was die Fähigkeit zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen einschränkt. Um dies zu umgehen, wurde ein neonatales apikales Out-Modell (AO) für nekrotisierende Enterokolitis erstellt. Da Veränderungen der Permeabilität von Darmepithelzellen für NEC pathognomonisch sind, beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von Lucifergelb (LY) als Marker für parazelluläre Permeabilität. LY durchquert die intestinale Epithelbarriere über alle drei wichtigen parazellulären Signalwege: Pore, Leck und uneingeschränkt. Die Verwendung von LY in einem AO-Modell ermöglicht eine breitere Untersuchung der Permeabilität in NEC. Nach IRB-Genehmigung und elterlicher Zustimmung wurden chirurgische Proben von Darmgewebe von menschlichen Frühgeborenen gesammelt. Darmstammzellen wurden durch Kryptenisolierung gewonnen und zum Züchten von Enteroiden verwendet. Enteroide wurden bis zur Reife gezüchtet und dann AO transformiert oder in BO-Konformation belassen. Diese wurden entweder nicht behandelt (Kontrolle) oder mit Lipopolysaccharid (LPS) behandelt und hypoxischen Bedingungen zur Induktion von in vitro NEC ausgesetzt. LY wurde verwendet, um die Permeabilität zu beurteilen. Immunfluoreszenzfärbung des apikalen Proteins Zogula occludens-1 und des basolateralen Proteins β-Catenin bestätigte die AO-Konformation. Sowohl AO- als auch BO-Enteroide, die mit LPS und Hypoxie behandelt wurden, zeigten im Vergleich zu Kontrollen eine signifikant erhöhte parazelluläre Permeabilität. Sowohl AO- als auch BO-Enteroide zeigten im Vergleich zu Kontrollen eine erhöhte Aufnahme von LY in das Lumen der behandelten Enteroide. Die Verwendung von LY in einem AO-Enteroidmodell ermöglicht die Untersuchung aller drei Hauptwege der parazellulären Permeabilität. Es ermöglicht auch die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen und wie sich dies auf die Permeabilität im Vergleich zum BO-Enteroid-Modell auswirken kann.
Introduction
Enteroide sind dreidimensionale (3D) Strukturen, die von organbeschränkten menschlichen Darmstammzellen abgeleitetsind 1,2. Sie bestehen vollständig aus epithelialen Linien und enthalten alle differenzierten Darmepithelzelltypen2. Enteroide behalten auch die zelluläre Polarität bei, die aus einer apikalen luminalen Oberfläche besteht, die ein inneres Kompartiment bildet, und einer basolateralen Oberfläche, die dem umgebenden Medium zugewandt ist. Enteroide sind ein einzigartiges Modell, da sie die Eigenschaften des Wirts bewahren, aus dem sie erzeugt wurden3. Daher stellen Enteroide, die von Frühgeborenen erzeugt werden, ein Modell dar, das für die Untersuchung von Krankheiten nützlich ist, die hauptsächlich diese Population betreffen, wie z.B. nekrotisierende Enterokolitis (NEC).
Das traditionelle enteroide Modell wird in einer basolateralen Out-Konformation (BO) gezüchtet, bei der das Enteroid in einer Kuppel aus Basalmembranmatrix (BMM) eingeschlossen ist. BMM induziert das Enteroid, eine 3D-Struktur mit der basolateralen Oberfläche auf der Außenseite aufrechtzuerhalten. BO-Enteroide sind ein geeignetes Modell für NEC, das die Lücke zwischen zweidimensionalen (2D) primären menschlichen Zelllinien und in vivo Tiermodellen schließt 2,4. NEC wird in Enteroiden induziert, indem Krankheitserreger wie LPS oder Bakterien in die die Enteroide umgebenden Medien eingebracht werden, gefolgt von einer Exposition gegenüber hypoxischen Bedingungen 2,3. Die Herausforderung beim BO-enteroiden NEC-Modell besteht darin, dass es keine effektive Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen ermöglicht, die an der apikalen Oberfläche in vivo auftreten. Veränderungen der intestinalen Permeabilität sind auf diese Wirt-Pathogen-Interaktionen zurückzuführen. Um besser zu verstehen, wie sich die Permeabilität auf die pathophysiologischen Grundlagen von Krankheiten auswirkt, muss ein Modell erstellt werden, das die Behandlung der apikalen Oberfläche beinhaltet.
Co et al. waren die ersten, die zeigten, dass reife BO-Enteroide dazu gebracht werden können, eine apikale Out-Konformation (AO) zu bilden, indem die BMM-Kuppeln entfernt und in Medien resuspendiertwerden 5. Dieser Artikel zeigte, dass AO-Enteroide die korrekte epitheliale Polarität beibehielten, alle Darmzelltypen enthielten, die intestinale Epithelbarriere aufrechterhielten und den Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglichten5. Die Verwendung von AO-Enteroiden als NEC-Modell erreicht eine physiologische Reproduktion des Krankheitsprozesses und die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen.
Ein wesentlicher Beitrag zur Pathophysiologie von NEC ist eine erhöhte Darmpermeabilität6. Mehrere Moleküle wurden vorgeschlagen, um die Darmpermeabilität in vitro7 zu testen. Unter diesen ist Lucifergelb (LY) ein hydrophiler Farbstoff mit Anregungs- und Emissionspeaks bei 428 nm bzw. 540 nm8. Da es alle wichtigen parazellulären Signalwege durchquert, wurde es verwendet, um die parazelluläre Permeabilität in verschiedenen Anwendungen zu bewerten, einschließlich der Blut-Hirn- und Darmepithelbarrieren 8,9. Die traditionelle Anwendung von LY verwendet Zellen, die in Monoschichten auf einer semipermeablen Oberfläche10 gezüchtet werden. LY wird auf die apikale Oberfläche aufgetragen und durchquert parazelluläre Tight-Junction-Proteine, um sich auf der basolateralen Seite zu versammeln. Höhere LY-Konzentrationen im basolateralen Kompartiment deuten auf eine verminderte Tight Junction-Proteine mit anschließendem Abbau der intestinalen Epithelzellbarriere und eine erhöhte Permeabilität hin10. Es wurde auch in 3D-BO-Enteroidmodellen beschrieben, bei denen LY zu den Medien hinzugefügt wurde und einzelne Enteroide für die Aufnahme von LY in das Lumenabgebildet wurden 11. Obwohl dies eine qualitative Analyse über die Visualisierung der LY-Aufnahme ermöglicht, ist die quantitative Analyse begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Technik, die LY verwendet, um die parazelluläre Permeabilität unter Verwendung eines in vitro NEC enteroiden Modells in AO-Enteroiden unter Beibehaltung der 3D-Orientierung zu bewerten. Diese Methode kann sowohl für die qualitative als auch für die quantitative Analyse der Permeabilität verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die intestinale Permeabilität ist komplex und spiegelt die epitheliale Barrierefunktion wider. Die Darmbarriere besteht aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen, die den transzellulären und parazellulären Transport vermittelt14. Parazelluläre Permeabilität beruht auf Tight-Junction-Proteinen, die den Raum zwischen Epithelzellen abdichten14. Innerhalb dieses parazellulären Transports gibt es drei verschiedene Wege, auf denen sich Moleküle kreuzen können: Pore, Le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Ashley Nelson vom University of Rochester Medical Center für ihre instrumentelle Hilfe bei unserem enteroiden Modell. Wir danken auch der Abteilung für Kinderchirurgie der University of Oklahoma für die Unterstützung dieses Projekts. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], dem Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research und dem Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 unterstützt, der an die Abteilung für Chirurgie am Health Sciences Center der University of Oklahoma vergeben wurde.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
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