הערכה ומניפולציה של פעילות עצבית באמצעות מיקרוסקופיה הולוגרפית דו-פוטונית
Summary
פיתחנו מיקרוסקופ הולוגרפי בעל שני פוטונים שיכול לדמיין, להעריך ולתפעל פעילות עצבית באמצעות רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה, במטרה להבהיר את הפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות הקשורות לפעילות עצבית חריגה.
Abstract
ההתקדמות האחרונה בתחום הדימות הביולוגי האופטי והאופטוגנטיקה אפשרה הדמיה ומניפולציה של תופעות ביולוגיות, כולל פעילות תאית, בבעלי חיים חיים. בתחום מדעי המוח, פעילות עצבית מפורטת הקשורה לתפקודי המוח, כגון למידה וזיכרון, נחשפה כעת, וניתן לבצע מניפולציה מלאכותית בפעילות זו כדי לבטא תפקודים מוחיים. עם זאת, ההערכה הקונבנציונלית של פעילות עצבית על ידי שני פוטונים Ca2+ הדמיה יש את הבעיה של רזולוציה טמפורלית נמוכה. בנוסף, מניפולציה של פעילות עצבית על ידי אופטוגנטיקה קונבנציונלית באמצעות סיב אופטי יכול רק בו זמנית לווסת את הפעילות של נוירונים עם אותו רקע גנטי, מה שמקשה על שליטה בפעילות של נוירונים בודדים. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו לאחרונה מיקרוסקופ עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה עבור יישומים ביולוגיים על ידי שילוב אופטוגנטיקה עם טכנולוגיה הולוגרפית דיגיטלית שיכולה לשנות קרני לייזר אינפרא אדום פמטו-שניות. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים להדמיה, הערכה ומניפולציה של פעילות עצבית, כולל הכנת דגימות ותפעול של מיקרוסקופ הולוגרפי בעל שני פוטונים (איור 1). פרוטוקולים אלה מספקים מידע מרחבי-זמני מדויק על הפעילות העצבית, אשר עשוי להיות שימושי להבהרת הפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות המובילות להפרעות בפעילות העצבית.
Introduction
הדמיית Ca2+ של שני פוטונים היא טכניקה שימושית להערכת הפעילות העצבית. זה יכול לשמש כדי לזהות לא רק את הפעילות העצבית הנדרשת להתנהגות וזיכרון בבעלי חיים נורמליים1,2, אלא גם פעילות עצבית חריגה המתרחשת מודלים עכבריים של הפרעות נוירופסיכיאטריות 3,4. הטכניקה שימשה להבהרת הבסיס העצבי של תפקודי המוח. עם זאת, למרות שהוא יכול לספק תמונות ברזולוציה גבוהה ובאיכות גבוהה, הרזולוציה הטמפורלית שלו נמוכה מזו של השיטה האלקטרופיזיולוגית 1,3.
אופטוגנטיקה סייעה לחדש את האופן שבו מדעני מוח מבינים את תפקוד המוח5. בהתחשב במגבלות הטכניות, רוב המחקר האופטוגנטי השתמש בסכמות הפעלה ברזולוציה מרחבית נמוכה, ובכך הגביל את סוגי המניפולציות של הפעילות העצבית שניתן לבצע בהתאם. עם זאת, מניפולציה של פעילות עצבית בסקאלות מרחביות-זמניות עדינות יותר יכולה להיות שימושית להבנה מלאה יותר של חישוב עצבי והפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות. טכנולוגיה הולוגרפית מדויקת מרחבית שיכולה לעצב פמטו-שנייה ליד קרני לייזר אינפרא אדום מבטיחה להתגבר על האתגר הזה ופותחת כמה מחלקות ניסוי חדשות שהיו בלתי אפשריות בעבר 6,7. טכנולוגיה זו מאפשרת למדעני מוח לחשוף את ההיבטים הבסיסיים והפתולוגיות של קודים עצביים חושיים, קוגניטיביים והתנהגותיים שהיו מעבר להישג יד.
הקרנה הולוגרפית כוללת יצירת תבניות אור רצויות כדי לגשת לתאים בודדים ולרשתות פונקציונליות באופן סלקטיבי. ניסויי In vivo דורשים העברת אור אופטימלית כדי לתקוף תאים במוח החי. אור אינפרא אדום חודר עמוק יותר לתוך רקמה חיה וניתן להשתמש בו לעירור לא ליניארי של שני פוטונים (2PE)8,9,10. לפיכך, ניתן להשתמש במיקרוסקופ הולוגרפי של שני פוטונים, המשלב הקרנה הולוגרפית ו-2PE, כדי להעריך ולתפעל פעילויות עצביות כדי לחקור רשתות סלולריות ותפקודיות in vivo. יישומים ביולוגיים עדכניים של מיקרוסקופיה הולוגרפית של שני פוטונים הבהירו את הפעילות העצבית והמעגלים החשמליים הדרושים ללמידה בקליפת המוח הראייתית 11,12, נורת הריח13 וההיפוקמפוס14.
מעבדות רבות ברחבי העולם דיווחו על תוצאות מלהיבות ושיפורים באמצעות מערכות הגירוי ההולוגרפי שלהן 15,16,17,18,19,20,21,22,23. במערכת המתוארת כאן, ניתן לבנות את מערכת הגירוי ההולוגרפי כמכשיר הרחבה למיקרוסקופ קונבנציונלי. אפנן האור המרחבי הפאזה בלבד (SLM) הוא התקן המפתח לאפנון חזית גל מישורית לכל צורה, ואפקט ההתאבכות משמש לשליטה בעוצמה ובמיקום של המוקדים. איור 2 מראה גירוי הולוגרפי והדמיית נתיבי אור. נתיב האור הראשון מיועד למצב הדמיה של סריקה נקודתית והוא מורכב מראש סריקה וגלאי תמונה. נתיב האור השני מיועד לגירוי הולוגרפי באורך גל של 1040 ננומטר והוא מורכב מ-SLM1. נתיב האור השלישי מיועד להארה הולוגרפית באורך גל של 920 ננומטר והוא מורכב מ-SLM2 וחיישן תמונה. מצב ההדמיה ההולוגרפית יכול להקליט עוצמות מאזורי עניין מרובים על ידי הארת נקודות מרובות בדגימה. בדרך זו, ניתן להגדיל את מהירות ההקלטה לכמה מאות מסגרות לשנייה. כדי להשיג דימות סריקה נקודתית או הדמיית הארה הולוגרפית, הלייזר 920 ננומטר פוצל לשני נתיבים על ידי מפצל קרן ביחס קבוע של 3:7. כל האלמנטים האופטיים היו מיושרים על לוח לחם אופטי במידות של 600 מ”מ × 600 מ”מ. האור המווסת נכנס דרך יציאת האור בצד הגוף המיקרוסקופי, ואילו אור ההדמיה הסורק הנקודתי נכנס דרך ראש הסריקה בחלק העליון של הגוף המיקרוסקופי. אורות אלה שולבו ממש מעל עדשת האובייקט ויצרו מוקדים במישור הדגימה. בנוסף, התוכנה בהתאמה אישית אפשרה לזרימת העבודה הרגילה להיות פשוטה ועקבית.
במאמר זה, פרוטוקול מלא מוצג לשימוש בגירוי הולוגרפי או תאורה כדי למדוד פעילות עצבית ולהעריך את הקישוריות התפקודית בין נוירונים. למטרות הדגמה, אנו מתארים כאן ניתוח מוח המתמקד באזור הגפיים האחוריות של קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית (S1HL) במוח העכבר ושיטה להעריך ולתפעל פעילות עצבית באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי של שני פוטונים. ההליך הניסיוני מחולק לארבעה חלקים. ראשית, לוחית הראש הייתה מקובעת לגולגולת העכבר באמצעות מלט דנטלי. שנית, וקטור ויראלי המבטא jGCaMP8f או GCaMP6m-P2A-ChRmine הוזרק באופן סטריאוטקטי לתוך S1HL. שלישית, מערכת הגירוי או התאורה ההולוגרפית כוילה. רביעית, לאחר התאוששות לאחר הניתוח וביטוי של שני חלבונים אלה, בוצעה הדמיה של In vivo Ca2+ כדי להעריך את הפעילות העצבית והקישוריות התפקודית בין נוירונים באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי של שני פוטונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להבין את תפקוד המוח, יש צורך להעריך במדויק את המעגלים העצביים העומדים בבסיס תפקוד המוח על ידי חילוץ הדינמיקה של הפעילות העצבית. יתר על כן, חיוני לזהות כיצד מעגל עצבי זה משתנה כדי להבהיר את הפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות. ואכן, ידוע כי הפעילות העצבית מוגברת במודלים עכבריים של מחלת אלצהיימר4 ותסמונת X שביר26 ובעכברים עם תפקוד לקוי של החומר הלבן3. יתר על כן, במודל עכבר של כאב דלקתי, סנכרון מוגבר של פעילות עצבית וקישוריות תפקודית בין נוירונים קשורה לסימפטומים24. מיקרוסקופיה הולוגרפית של שני פוטונים מאפשרת לנו לצפות בו זמנית בפעילות של נוירונים בודדים ובקשרים הפונקציונליים בין נוירונים, דבר הכרחי להבנת מעגלים עצביים. השתמשנו בעדשה אובייקטיבית 25x עם צמצם מספרי = 1.1 עם אורכי גל של 1,040 ננומטר. פונקציית התפשטות הנקודות התאורטית היא התפלגות גאוסית עם רוחב מלא בחצי מקסימום של 0.5 מיקרומטר לרוחב ו-1.7 מיקרומטר אקסיאלית. עם זאת, הצמצם המספרי בפועל קטן מ-1.1, וגודל הכתם הנמדד על חרוז פלואורסצנטי הוא 1.2 מיקרומטר לרוחב, ו-8.3 מיקרומטר באופן אקסיאלי. בהתחשב בכך שקוטר תא העצב הוא בערך 15 מיקרומטר ושגיאת הכיול היא בטווח של 3 מיקרומטר, המטרה היא בדרך כלל טובה. עם זאת, תאים בכיוון הציר עשויים להיות מושפעים מגודל הכתם הארוך יותר6. במאמר זה תיארנו את ההזרקה הנגיפית, הניתוח, הכיול של מערכות גירוי או תאורה הולוגרפיות ופרוטוקולי הדמיה להערכה ומניפולציה של הפעילות העצבית בעכברים חיים באמצעות מערכת המיקרוסקופ שלנו.
לוקח 2-4 שבועות להשלים את כל הליכי הניסוי, החל מהשתלת לוחית ראש והזרקת וירוסים ועד לרכישת נתונים להדמיית in vivo Ca2+ באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי. התהליך מורכב ומייגע, והצלחתו הסופית של הניסוי תלויה במספר גורמים, כולל מצב חלון הגולגולת, המושפע מדלקת לאחר הניתוח, הבחירה הנכונה של מחוון Ca2+ ואופסין, והאם ניתן לתקן ממצאי תנועה בתמונות הנרכשות. בפרט, שני שלבים חשובים לתוצאה מוצלחת. הראשון נוגע לקיבוע לוחית הראש וניתוח; חשוב מאוד שלוחית הראש תהיה מקובעת היטב לראש העכבר עם מלט דנטלי. כמו כן, חשוב לנקות שוב ושוב שברי עצם ודם קרוש באמצעות ACSF קר במהלך הניתוח. מאחר שהיצמדות להליך זה מפחיתה דלקת, צפינו בהצלחה בדינמיקה של מיקרוגליה, התאים האחראים על מערכת החיסון של המוח, מבלי להפעיל את התהליכים ואת עמוד השדרה שלהם או את המיקרו-מבנים של תאי עצב27,28. הנושא השני הוא הערכה ומניפולציה של פעילות עצבית. בחרנו AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 כדי לבטא את מחוון Ca2+ ואופסין בתא עצב אחד בו זמנית. הסיבה לכך היא שקשה להדביק ביעילות נוירון אחד עם סוגים שונים של AAV. סיבה נוספת לבחירה זו הייתה ש-ChRmine יכול להפעיל ביעילות פעילות עצבית ב-1,040 ננומטר באמצעות לייזר12 בעל שני פוטונים. לאחרונה, דווח כי ChRmine, על ידי מוטציה המבנה שלה מבוסס על מידע מבני המתקבל על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים קריו, משפר את הפונקציה שלה29, אשר נחשב שימושי עבור ניתוח תפקוד המטרה בתחום מדעי המוח. לאור סוגיות אלה, יש צורך לשתף שיטות יעילות להערכה ומניפולציה של נוירונים בעת קריאת פעילות עצבית וכתיבת מידע באמצעות מיקרוסקופיה הולוגרפית.
ההתקדמות האחרונה בדימות ובאופטוגנטיקה חשפה את הפעילות העצבית המפורטת המעורבת בתפקודי מוח כגון למידה וזיכרון, וניתן לבצע מניפולציה מלאכותית בפעילות עצבית זו כדי לבטא תפקודי מוח30. עם זאת, שיטות קונבנציונליות למניפולציה של פעילות עצבית הן פולשניות מאוד בגלל החדרת סיבים אופטיים למוח ומכיוון שקבוצה של תאים המבטאים אופסין מגורה בו זמנית, מה שלא מאפשר לתמרן את הפעילות העצבית בדיוק זמני ומרחבי. השיטה שלנו יכולה לתמרן את הפעילות העצבית על ידי גירוי נוירונים ספציפיים בלבד במוח, ובכך לאפשר מניפולציה של הפעילות העצבית עם דפוסי גירוי ספציפיים ורזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. יתר על כן, חשוב לציין כי קישוריות תפקודית בין נוירונים ניתנת להערכה רק במספר קטן של תאי עצב באמצעות ניסויי פרוסות מוח31; עם זאת, טכניקה זו מאפשרת הערכה בו זמנית של נוירונים מרובים בבעלי חיים חיים.
אחת המגבלות העיקריות של המיקרוסקופים ההולוגרפיים הנוכחיים היא הצורך לתקן את ראש העכבר, מה שמגביל את התנהגות העכבר. לאחרונה פותח מיקרוסקופ ממוזער של שני פוטונים32, ועם מזעור נוסף של המכשיר, הדמיה של in vivo Ca2+ עם גירוי הולוגרפי עשויה להיות אפשרית בעכברים הנעים בחופשיות. בנוסף, ניתן להרחיב את הפוטנציאל של מיקרוסקופ זה על ידי שיפור הרזולוציה הטמפורלית של הדמיה ושילובה עם חלבונים פלואורסצנטיים רגישים מאוד למתח33.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים בסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (19H04753, 19H05219 ו-25110732 ל-H. W.), מענקים בסיוע לתחומי מחקר טרנספורמטיביים (A) (20H05899 ל-H. W., 20H05886 ל-O. M. ו-21H05587 ל-D. K.), טיפוח מחקר בינלאומי משותף (B) (20KK0170 ל-H. W.), מענק סיוע למחקר מדעי (B) (18H02598 ל-H. W.), מענק סיוע למחקר מדעי (A) (21H04663 עד O. M.), מענק סיוע למדענים בתחילת הקריירה (20K15193 עד X. Q.), JST CREST מספר מענק JPMJCR1755, יפן, ומספר מענק JST A-STEP JPMJTR204C.
Materials
| 25x Objective | Nikon | N25X-APO-MP | Objective |
| A1MP | Nikon | A1MP | Microscope |
| AnesII | Bio machinery | AnesII | Anesthesia delivery system |
| C2 plus | Nikon | C2 plus | Microscope |
| DECADRON Phosphate Injection | Aspen | 21N024 | Avoid cerebral edema |
| Dental Drill | Jota | C1.HP.005 | Dental drill |
| Electric Microinjector | NARISHIGE | IM-31 | Pressure injection system |
| FEATHERS | FEARGER | FA-10 | Shaving |
| G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER | GC | 2110271 | Resin cement primer for dental adhesion |
| G-CEM ONE neo | GC | 43093 | Resin cement for dental adhesion |
| Glass Capillary with Filament | NARISHIGE | GDC-1 | Glass capillary |
| Image Detector | Hamamatsu | H10770PA-40 | GaAsP photocathode photomultiplier tube |
| Imaging Software | Nikon | NISelements | Imaging software |
| Isoflurane Inhalation Solution | Pfizer | 229KAR | Anesthetics |
| iXon EMCCD Camera | Andor | iXon Life 888 | Image sensor |
| Ketamine | daiitisannkyou | s9-018506 | Anesthetics |
| Leica-M60 | Leica | M60 | Stereoscope |
| Linicon | Linicon | LV-125 | Vacuum pump |
| Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser | Coherent | Chameleon Discovery NX | Femtosecond laser |
| Mos-Cure | U-VIX | mini 365 | Portable LED UV Light Source |
| PEN Bright | SHOFU INC. | PEN Bright | Dental light curing unit |
| Puller | SUTTER instaument | P-97 | Puller |
| Stereotaxic Instrument (for Mice) | NARISHIGE | SR-6M-H | Stereotaxic instrument |
| Stereotaxic Micromanipulator | NARISHIGE | SM-15R | Stereotaxic micromanipulator |
| Super-Bond CATALYST V | SUN MEDICAL | 8070 | Dental adhesive resin cement |
| Super-Bond Dental Adhesive Monomer | SUN MEDICAL | 8071 | Dental adhesive monomer |
| Super-Bond Teeth Color Polymer Powder | SUN MEDICAL | 145052000 | Teeth color polymer powder |
| Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% | Santen Pharmaceutical | TRN3952 | Eye ointment |
| UlTIMATE XL | NSK | Y141446 | Dental laboratory micromotor control unit |
| UV Curing Optical Adhesives | THORLABS | NOA61 | UV Curing Optical Adhesives |
| Xylazine | Bayer | KP0F2BK | Anesthetics |
References
- Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nature Neuroscience. 17 (7), 987-994 (2014).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Kato, D., et al. Motor learning requires myelination to reduce asynchrony and spontaneity in neural activity. Glia. 68 (1), 193-210 (2020).
- Busche, M. A., et al. Tau impairs neural circuits, dominating amyloid-β effects, in Alzheimer models in vivo. Nature Neuroscience. 22 (1), 57-64 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Quan, X., Kato, D., Daria, V., Matoba, O., Wake, H. Holographic microscope and its biological application. Neuroscience Research. 179, 57-64 (2022).
- Adesnik, H., Abdeladim, L. Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics. Nature Neuroscience. 24 (10), 1356-1366 (2021).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Carrillo-Reid, L., Han, S., Yang, W., Akrouh, A., Yuste, R. Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles. Cell. 178 (2), 447-457 (2019).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Gill, J. V., et al. Precise holographic manipulation of olfactory circuits reveals coding features determining perceptual detection. Neuron. 108 (2), 382-393 (2020).
- Robinson, N. T. M., et al. Targeted activation of hippocampal place cells drives memory-guided spatial behavior. Cell. 183 (6), 1586-1599 (2020).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Mardinly, A. R., et al. Precise multimodal optical control of neural ensemble activity. Nature Neuroscience. 21 (6), 881-893 (2018).
- Yang, W., Carrillo-Reid, L., Bando, Y., Peterka, D. S., Yuste, R. Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. Elife. 7, 32671 (2018).
- Forli, A., et al. Two-photon bidirectional control and imaging of neuronal excitability with high spatial resolution in vivo. Cell Reports. 22 (11), 3087-3098 (2018).
- Pégard, N. C., et al. Three-dimensional scanless holographic optogenetics with temporal focusing (3D-SHOT). Nature Communications. 8 (1), 1228 (2017).
- Dal Maschio, M., Donovan, J. C., Helmbrecht, T. O., Baier, H. Linking neurons to network function and behavior by two-photon holographic optogenetics and volumetric imaging. Neuron. 94 (4), 774-789 (2017).
- Russell, L. E., et al. All-optical interrogation of neural circuits in behaving mice. Nature Protocols. 17 (7), 1579-1620 (2022).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).
- Hernandez, O., et al. Three-dimensional spatiotemporal focusing of holographic patterns. Nature Communications. 7, 11928 (2016).
- Okada, T., et al. Pain induces stable, active microcircuits in the somatosensory cortex that provide a therapeutic target. Science Advances. 7 (12), 8261 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Gonçalves, J. T., Anstey, J. E., Golshani, P., Portera-Cailliau, C. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Haruwaka, K., et al. Dual microglia effects on blood brain barrier permeability induced by systemic inflammation. Nature Communications. 10 (1), 5816 (2019).
- Kishi, K. E., et al. Structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin ChRmine. Cell. 185 (4), 672-689 (2022).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Ko, H., et al. The emergence of functional microcircuits in visual cortex. Nature. 496 (7443), 96-100 (2013).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).
- Villette, V., et al. ultrafast two-photon imaging of a high-gain voltage indicator in awake behaving mice. Cell. 179 (7), 1590-1608 (2019).
