C.エレガンス 免疫蛍光およびDAPI染色のための生殖腺解離および凍結亀裂

1. C.エレガンス 畜産 注:詳細については、 C.エレガンス メンテナンスプロトコル16 およびElginら32 を参照してください。 C.エレガンス 株は、 カエノラブディティス 遺伝学センター(https://cgc.umn.edu)から簡単に入手でき、米国内の任意の場所に普通郵便で出荷されます。各菌株の費用は10ドルで、各ラボ/ユーザーは30ドルの年会費を支払います。 滅菌技術を用いて、6cm線虫増殖培地寒天プレート(NGM寒天プレート)を調製する。注いだプレートは、元のプラスチックスリーブまたは密閉容器に4°Cで数か月間逆さまに保管できます。NGM寒天プレートを作るには、3 gのNaCl、2.5 gのバクトペプトン、20 gのNGM寒天、およびddH2Oを1 L(~975 mL)に加えます。121°Cで20分間保持する液体サイクルを使用して培地をオートクレーブします。55°Cに冷却し、滅菌技術を使用して、コレステロール1 mL、1 M CaCl 20.5 mL、1 M MgSO4 1 mL、および1 M リン酸カリウムバッファー(pH 6)25 mLを加えます。注:1 Mリン酸カリウムバッファーを作るには、108.3 gのKH 2 PO 4(一塩基性)と35.6 gのK2HPO4(二塩基性)を混合します。必要に応じて、KOHを使用してpHを6に調整します。ddH2Oを最大1 L(通常~900 mL)まで加え、オートクレーブを121°Cで40分間行います。 1 LのNGMは、それぞれ10 mLを含む約100枚のプレートを作ります。 血清学的ピペットまたはトランスファーピペットを使用して、大腸 菌 OP50細菌培養物(~150 μL)を3滴入れてプレートを見つけます。プレートの中央にスポットを配置し、スポットをプレートの端に近づけないようにしてください。これは動物がプレートの側面を這い上がって乾燥するのを思いとどまらせるでしょう。 バクテリアの芝生が乾いたら、斑点を付けたプレートを室温(RT)で最大2週間逆さまに保管します。使用の少なくとも1〜2日前にプレートをスポッティングすると、バクテリアの芝生が厚くなり、より高密度の動物を支えることができます。注:OP50細菌培養を準備するために、OP50はカエノラブディティス遺伝学センターから注文できます。OP50細菌は、グリセロールストックからLBプレートにストリークされ、単一のコロニーを確保し、4°Cで4〜6週間保持されます。OP50細菌培養物は、単一のコロニーから37°Cで一晩LBで増殖します–振とうは必要ありません。LB培地を調製するには、トリプトン10 g、NaCl10 g、酵母エキス5 g、ddH 2 O950 mLを加え、10 N NaOHでpHを7に調整し、ddH2Oで最終容量を1 Lに調整します。 100 mLの量に分注し、121°Cで20分間オートクレーブします。 各株の作業ストックを作成するには、斑点を付けられたNGMプレート上に3つのL4ステージ雌雄同体を選びます。プレートは15〜25°Cで保管してください。 標準的な培養条件は20°Cです。 温度管理されたインキュベーターにアクセスできない場合は、RTのベンチトップで培養物を維持します。注:L4段階の雌雄同体は、サイズ(成体よりも小さい)と、体の途中に明確な半円(発達中の外陰部)が存在することの両方で簡単に病期分類できます。20°Cでは、動物は孵化後34〜46時間(胚が産卵されてから約40〜52時間後)にL4段階に達する。発達段階のタイミングの詳細については、Corsi et al.14 を参照してください。培養物をさまざまな温度にシフトして、発育速度を制御します。動物は高温でより速く成長し、低温で遅く成長します。それらは25°Cより高い温度で無菌になり始めます。注:一部の変異遺伝子型は温度感受性であり、培養温度に応じて異なる表現型を示します。 4日ごとに3つのL4ステージ雌雄同体を新しい斑点のあるNGMプレートにピッキングして、作業ストックを維持します。そうすることで、幅広い発達段階を持つ一定の栄養のある人口を確保できます。 2.生殖腺解剖 年齢に合った成虫の収集:解剖の12〜24時間前に、L4段階の雌雄同体を新しい斑点のあるNGMプレートに選びます-これらは翌日若年成人に成長し、解剖に理想的です。L4段階の雌雄同体の数は、実施されている細胞学的分析によって異なります。通常、スライドごとに10〜20個の雌雄同体が解剖され、条件ごとに2〜4枚のスライドが生成されます。注:生殖腺は、十分に給餌された動物で最も効率的に押し出されます。飢えていない(つまり、プレート上に目に見えるバクテリアの芝生がまだ残っている)作業株からL4雌雄同体を選ぶようにしてください。飢えた動物は不完全な生殖腺の押し出しを受ける傾向があり、視覚化が困難になります。ジアキネシスのような減数分裂の後期を評価する場合は、ジアキネシス段階の核をより多く蓄積し、分析を簡素化するため、高齢者(L4の48時間後)を解剖します。ただし、研究者は、一部の影響が母親の高齢によって引き起こされる可能性があることに注意する必要があります。 解剖の準備をします。M9の調製:3gのKH 2 PO 4(一塩基性)、6gのNa 2 HPO4(二塩基性)、5gのNaClを加え、ddH2Oを100mLに加える。溶液を121°Cで20分間オートクレーブし、放冷した後、滅菌技術を使用して1 mLの1 M MgSO4を加えます。 解剖バッファーの調製:1 μLの10%トゥイーン20、12 μLの100 mMレバミゾール、10 μLの10x M9、および77 μLのddH2Oを混合します。注:Tween 20は、表面張力を低下させ、組織膜をさらに透過するために解剖バッファーに含まれています。 固定溶液(2%PFA [100 μL])を調製する:12.5 μLの16%パラホルムアルデヒド(PFA)、10 μLの10x M9、および77.5 μLのddH2Oを混合します。必ずPFAの新しいアンプルを使用してください(2週間以内に開封)。注意: PFAは危険な化学物質であるため、固定溶液はヒュームフードで準備する必要があります。 凍結方法を設定する-液体窒素は管理が簡単ですが、必要に応じて、ドライアイスの上にアルミニウムブロックを使用できます。液体窒素法:プラスチック製のビーカーまたはプラスチック製のコプリンジャーをポリスチレンの箱に入れます。ビーカーに液体窒素を入れます(ポリスチレン容器へのオーバーフローは問題ありません)。ピンセットを近くに置きます。理想的には、ビーカーは顕微鏡のスライドが完全に水平に落ちるのを防ぐのに十分な幅でなければなりません-スライドは傾きがあり、ピンセットでつかみやすい必要があります。注意: 急速な冷却による粉々を避けるために、ガラスではなく液体窒素で作業する場合はプラスチック容器を使用することが重要です。 ドライアイス法:平らなアルミニウムブロックをポリスチレン容器または長方形の氷バケツのドライアイスの上に置きます。ブロックの上部がコンテナの上部より上にあると、スライドをフリーズする方が簡単です。 手袋を着用し、アルミブロックをそっと押し下げてドライアイスとの良好な接触を確保し、冷却プロセスを早めます(金属が急速に冷えるときしむ音がすることがあります)。かみそりの刃を近くに置きます。 凍結クラックを停止する前に、アルミニウムブロックをドライアイスの上に少なくとも30分間放置して、急速凍結に必要な完全なクールダウンを可能にします。注意: 理想的には、表面を水平に保つのに役立つドライアイスの固体ブロックを使用する必要があります。必要に応じて、ドライアイスペレットの上にアルミニウムブロックを置くことができますが、表面が水平に保たれるように注意する必要があります。 アルミニウムブロックの表面は霜を集め、スライドとブロックの間の密接な接触を妨げる可能性があります。かみそりの刃を使用して表面から霜をこすり落とし、各スライドの領域をクリアします。ポリスチレン容器を蓋で覆うと、過度の霜の蓄積を防ぐのに役立ちます。 コプリンジャーに~40mLの95%エタノールを入れます。 3つのコプリンジャーに~40 mLのPBS-Tを入れます。注:PBS-Tを作るには、100 mLの10x PBS、5 mLのトリトンX-100、および2 mLの0.5 M EDTA(pH 8)を混合します。873 mLのddH2Oを追加します。激しく振ってトリトンX-100を溶かします。10x PBSを作るには、25.6 gのNa 2 HPO4・7H 2 O、80 gのNaCl、2 gのKCl、および2 gのKH2PO4を混合します。ddH2Oを加えて容量を1 Lまで上げ、オートクレーブを121°Cで40分間行います。 洗剤Triton X-100は洗浄バッファーPBS-Tに含まれており、表面張力を低下させ、スライド上の動物全体の保持力を高めます。 18 mm x 18 mmのガラスカバーガラスで動物を解剖します。このステップは、解剖バッファーの蒸発により時間に敏感です。解剖を完了するのに5分もかかりません。注:レバミゾールは、動物を解剖しやすくするために動物を固定するために使用されますが、レバミゾールに長時間放置すると、生殖腺の押し出しが悪くなります。5分の時間枠内に収まるように、スライドごとに解剖される動物の数を減らすのが最も簡単です。解剖顕微鏡のステージに保持スライドを置きます-保持スライドはカバーガラスをより簡単に動かすために使用され、無期限に再利用できます(図2A、左の写真)。 カバーガラスを保持スライドの上に置き、4 μLの解剖液をカバーガラスの中央にピペッティングします。保持スライドをステージの片側に移動して、ビューを解放します。 解剖液の滴に10〜20個の雌雄同体を選びます。スライドごとに~10匹を画像化するのに十分な動物を選択しますが、5分以内に解剖できないほど多くはありません。 両手に1本ずつ、2本の注射針を使用して動物を解剖します(図2A)。針の先端を交差させてX字型を作り、Xの底を使用して大人をカバーガラスの表面に固定します。注意: 角度と回転の観点から各針を保持する最良の方法を見つけるには、練習が必要です。斜角(斜めのエッジ)を下に向けて針を保持することから始めます。より大きなボリュームで解剖することを最初に学ぶための提案については、ディスカッションを参照してください(図2D)。 X字型を咽頭のすぐ後ろ、若年成人の体長の約1/5、または頭の透明な部分のすぐ下に配置します(図2A、右図)。 1回のはさみの動き(ナイフとフォークで食べ物をスライスするなど)で動物を斬首します。良好な押し出しにより、生殖腺の片方の腕(または場合によっては両腕)が、腸の片方または両方の半分とともに体腔から完全に解放されます(図2B、左の画像)。腸はより暗く、均一な幅で見えますが、生殖腺は遠位の先細りの先端ではっきりと見えます。各動物は一度だけ切るべきです。カット後に生殖腺が押し出されない場合は、次の動物に移ります。最初のカットは体内の静水圧を大幅に低下させるため、それ以上カットしても押し出しが良くなる可能性は低くなります。不完全または不十分な押し出しは、イメージング中にすぐに表示され、無視できます(図2B、右の画像)。注:生殖腺を死体から分離しようとしないでください-そうすると、通常、組織が裂け、分析できる減数分裂段階の数が制限されます。 カバースリップの残りの動物について解剖を繰り返します。 サンプルをホルムアルデヒドで固定します。穏やかに作業しながら、動物との滴に非常に近いカバーガラス上の固定溶液4μLをピペットで留めます。理想的には、液滴はマージするのに十分近いです。解剖ドロップに直接ピペッティングしたり、解剖された死骸を移動させたりしないでください。 1本の指でカバーガラスを保持スライドに固定します。もう一方の手で、カバーガラスを数回そっとフリックして、滴を混ぜます。最終的な固定濃度は0.8%PFAです。 正に帯電したスライドを前面に押し下げて、スライドの中央にあるカバーガラスを持ち上げます。サンプルドロップにそっと触れると、ドロップの表面張力がカバーガラスを拾います。注意: 正に帯電したスライドには、組織が表面に付着してサンプルの損失を防ぐのに役立つ静電コーティングが施されています。必要に応じて、片方の角がスライドの上端または下端から1 mm垂れ下がるようにカバーガラスを斜めに配置します。オーバーハングを残すと、凍結後にカバーガラスを割るのが簡単になります(図2C)。 スライドをベンチに置き、RTで正確に5分間固定します。この間、スライドに鉛筆でラベルを付けます。注:サンプルを過剰に固定するのが一般的であり、核またはすべての組織から抗体を除外することによって検出できます。さらに、一部の抗体はホルムアルデヒドに特に敏感です。このような場合は、固定時間を短縮するか、使用するホルムアルデヒドの最終濃度を下げてください。 フリーズクラック修正の直後に、スライドをフリーズします。液体窒素を使用する場合:スライドのラベルの付いた端をピンセットで持ち、液体窒素にそっと下げます。カバーガラス面を上にして、ビーカーの側面に寄りかかるようにスライドを解放します。スライドは10秒以内に凍結されます(液体が沸騰しなくなったら)。 ドライアイスを使用する場合:かみそりでアルミニウムブロックの表面から霜をこすり落とします。スライドのラベルの付いた端をしっかりと持ち、透明な面に置き、下向きに圧力を加えてブロックと完全に接触させます。カバーガラスは完全にブロック表面にある必要があります。凍結は10秒以内に発生し、カバーガラスの下のサンプルが氷に変わるときに視覚的に確認できます。 どちらの方法でも、スライドを少なくとも5分間放置して完全にフリーズさせます。注意: 凍結したら、スライドは凍結したままである限り、液体窒素またはブロック上に15〜20分間放置できます。これにより、この段階で複数のスライドを収集してから、クラッキングステップに進むことができます。 すばやく作業して、サンプルからカバーガラスを割ってください。この手順は時間に敏感です。カバーガラスを取り外し、サンプルが解凍を開始する前にスライドをエタノールに浸します。凍結したスライドを取り外します(液体窒素用のピンセットを使用)。 スライドのラベルの付いた短い端をしっかりとつかみ、一方の長い端をベンチに固定します。 もう一方の手で、かみそりをしっかりと握り、かみそりの端をスライドの下にスライドさせて、カバーガラスをはじいてサンプルから遠ざけます。カバーガラスがコーナーオーバーハングで配置されている場合、この手順はわずかに簡単です(図2C)。 すぐにスライドをRTの95%エタノールを含むCoplinジャーに入れます。 スライドをエタノールに少なくとも5分間放置します。注:スライドはエタノールにしばらく置いておくことができます-これにより、洗浄に進む前に、このステップで複数のスライドを収集することができます。スライドは、このステップで数日間保存することもできます。保存する場合は、スライドのコプリンジャーをエタノール中-20°Cに移動します。 PBS-TのスライドをRTでそれぞれ5分間3回洗浄します。 抗体で染色する場合は、ステップ3(抗体染色)に進みます。染色体を可視化するためにDAPIのみで染色する場合は、手順4(マウントとイメージング)に進みます。 3. 抗体染色 一次抗体インキュベーション注:新しい抗体の適切な条件を作成する際には、蛍光シグナルの特異性を検証するために、次のネガティブコントロールを含めることが重要です:1)一次抗体がなく、二次抗体のみを含むスライド。2)二次抗体を欠く一次抗体のみのスライド。これらのネガティブコントロールのそれぞれは、信号の完全な欠如を生成するはずです。二次抗体のみのスライドで蛍光が確認された場合は、二次抗体の希釈率を上げるか、別の二次抗体を使用する必要があります。一次抗体のみのスライドで蛍光が確認された場合は、自家蛍光またはその他の潜在的な汚染物質が原因である可能性があります。一次抗体を抗体希釈バッファー(BSA50 mg + 10%アジ化ナトリウム50 μL+ PBS-T10 mL)で希釈します-スライドあたり20〜30 μLを使用するのに十分な抗体希釈液を調製します。 湿ったチャンバーを準備する:プラスチック容器の底を湿らせたペーパータオルで気密蓋で裏打ちします。ペーパータオルの上にガラスパスツールピペットの単層を置きます。これらのピペットは、スライドを水平に保ち、ペーパータオルから高く保つことができる表面を作成します。注意: 湿気の多いチャンバーの場合は、スナップ蓋付きのプラスチック製の食品保存容器を使用するのが最適です。パスツールピペットに十分な長さであるが、スライドを完全に水平に休ませることができるようにくぼみのない比較的平らな底を持っているものを探してください。 最後のPBS-Tウォッシュからスライドを取り外します。このステップから迅速に作業して、サンプルを常に濡れたままにし、蒸発を防ぎます。サンプルが乾燥すると、抗体染色に悪影響を及ぼします。 コンパクトな長方形に折り畳まれた拭き取りティッシュを使用して、スライドの表面全体を乾燥させます。スライドの前面と背面を拭きますが、サンプルの周りに十分なスペースを残します。サンプルの近くの表面を乾燥させるときは特に注意してください-カバーガラスのサイズほどの領域が乾燥しないままになるサンプルに近づきすぎないようにしてください。ただし、次のステップでは、サンプルの周囲が乾いていることを確認してください。 疎水性PAPペンを使用してサンプルの周りに円を描きます。サンプル領域全体を囲むように注意してくださいが、スライドの表面に見える動物の死骸を乱さないようにしてください。バリアが完全に乾くまで~5秒待ちます。注:スライドの表面は界面活性剤を含むPBS-Tでコーティングされているため、一次抗体溶液を封じ込めるには疎水性バリアが必要です。PAPペンは乾燥したスライド面で最適に機能するため、サンプルの周囲に乾燥した周囲を作成することが重要です。サンプルに最も近い領域を乾燥させないままにしておくと、このステップ中にサンプルが保護されます すばやく作業し、折りたたまれた拭き取り組織の角または端を使用して、疎水性バリア内のサンプルから液体を吸い取ります。動物の死骸を乱さないように注意してください。 直ちに20 μLの一次抗体溶液を疎水性バリアによって作成されたリングにピペットで入れます。死体が乱れないように、穏やかに斜めにピペットを打つように注意してください。死体に直接ピペッティングすることは避けてください。 スライドを軽く傾けて、疎水性バリア内の表面全体が溶液で覆われていることを確認します。注:疎水性バリアの内周が1〜1.5 cmで、20 μLの抗体溶液で完全に覆われている場合が最適です。円周幅は、凍結亀裂ステップ中に死骸がどのように分布するかによって異なります。障壁が広いほど、大量の抗体溶液が必要になる場合があります。必要に応じて、パラフィルムの小さな正方形(18 mm x 18 mmカバーガラスのサイズにカット)をサンプルの上にそっと配置できます。パラフィルムの正方形は、抗体溶液がサンプル全体をカバーすることを保証し、蒸発を防ぐのにも役立ちます。 残りのスライドについて、手順 3.1.3-3.1.8 を繰り返します。 スライドを湿度の高いチャンバーに慎重に移し、溶液が疎水性バリア内に含まれたままで、スライドが完全に水平になっていることを確認します。 抗体に応じて、このステップを6時間に短縮するか、湿度の高いチャンバーを冷蔵室または冷蔵庫に保管することで4°Cで一晩実行することができます。注:通常、長時間のインキュベーションであっても、抗体溶液の蒸発を防ぐには、湿度の高いチャンバーと疎水性バリアを使用するだけで十分です。ただし、蒸発が問題になることが判明した場合は、パラフィルムの小さな正方形を各サンプルにそっと配置して、蒸発を防ぐのに役立ちます。これらは最初の洗浄ステップで除去できます:PBS-Tで満たされたCoplinジャー(他のスライドを含まない)に各スライドを浸し、パラフィルムをサンプルから浮かせます。同じジャーを使用して次のスライドからパラフィルムを削除する前に、コプリンジャーからパラフィルムを取り外します。 ~40 mLのPBS-Tが入ったコプリンジャーでスライドをRTでそれぞれ5分間3回洗浄します。これらの洗浄中に、二次抗体を抗体希釈バッファーで希釈します。スライドあたり20〜30 μLを使用するのに十分な抗体希釈液を調製します。1:200に希釈したAlexa Fluor結合二次抗体を使用するのが一般的です。 二次抗体インキュベーション最後のPBS-Tウォッシュからスライドを取り外します。このステップから迅速に作業して、サンプルを常に濡れたままにし、蒸発を防ぎます。 折りたたんだ拭き取りティッシュを使用してスライドを乾かします。疎水性バリアに含まれる領域を乾燥させないでください。 すばやく作業し、折りたたまれた拭き取り組織の角または端を使用して、疎水性バリア内のサンプルから液体を吸い取ります。動物の死骸を乱さないように注意してください。 直ちに20 μLの二次抗体溶液を疎水性バリアによって作成されたリングにピペットで入れます。死体が乱れないように、穏やかに斜めにピペットを打つように注意してください。 死体に直接ピペッティングすることは避けてください。疎水性バリア内の表面全体が溶液で覆われていることを確認してください。バリアの周囲が広いほど、より多くの抗体溶液が必要になる場合があります。必要に応じて、サンプルを小さな正方形のパラフィルムで覆います(手順3.1.8の下の注を参照)。 スライドを湿度の高いチャンバーに慎重に移し、溶液が疎水性バリア内に収まり、スライドが完全に水平になっていることを確認します。湿気のあるチャンバーの蓋を元に戻して、スライドを暗所に保ちます。 残りのスライドについて、手順3.3.1〜3.3.6を繰り返します。 RTで4時間暗闇でインキュベートします。注:抗体に応じて、このステップは2時間に短縮することも、6時間に延長することもできます。湿気の多いチャンバーが暗くない場合は、引き出しに入れるか、段ボール箱で覆います。あるいは、湿ったチャンバーをアルミホイルで包んで、スライドを暗闇に保つこともできます。 ~40 mLのPBS-Tが入ったコプリンジャーでスライドをRTでそれぞれ5分間3回洗浄します。 4.取り付けとイメージング 封入剤+ DAPI(2 μg/mL)、18 mm x 18 mmのガラスカバースリップ、マニキュアを手の届くところに置いて、サンプルをマウントする準備をします。 最後の洗浄からスライドを取り出し、折りたたんだ拭き取りティッシュを使用して乾かします。疎水性バリアに含まれる領域を乾燥させないでください。 折りたたまれた拭き取りティッシュの角を使用して、バリア内のサンプルから液体を注意深く吸い取ります。このステップでほとんどの液体を取り除きますが、死体を完全に乾かさずに取り除きます。 すばやく作業し、8 μLの封入剤をサンプルに追加します。死体が乱れるのを防ぐために、ピペットを穏やかにそして斜めに。死体に直接ピペッティングすることは避けてください。 それでもすばやく作業しながら、ガラスカバーガラスをサンプルに慎重に下げます。気泡はイメージングを妨害し、サンプルの劣化につながる可能性があります。気泡を最小限に抑えるには、カバーガラスの片方の端をサンプルの隣のスライドに置き、サンプルの対角線上に保持します。カバーガラスの上端を鉛筆やピンセットの上に置くのに役立ちます。次に、カバーガラスの上端をゆっくりと下げます-この動きにより、封入媒体は一方の端からもう一方の端に進む液体シールを作成できます。 残りのスライドについて、手順4.2〜4.5を繰り返します。 カバーガラスをマニキュアで密封します。カバーガラスを押し下げたり(サンプルを押しつぶしたり)、カバースリップを水平に外したり(サンプルを汚す)しないように注意してください。カバーガラスの各角(幅~1 mm)にマニキュアの小さなドットを追加します。これらは、カバーガラスを所定の位置に保持するのに役立ちます。ドットを完全に乾かします。 角が完全に乾いたら、マニキュアで端をシールします。ポリッシュがカバーガラスとスライドの間の隙間を完全に埋めることを確認しますが、カバーガラスをサンプルに覆いすぎないようにしてください。カバーガラスに1mmの重なりを維持するのが最善です。必要な量のマニキュアのみを使用してください。多すぎたり、研磨液が過剰になったりすると、乾燥に時間がかかり、顕微鏡の対物レンズが損傷するリスクがあります。注意: 透明ではなく色付きのマニキュアを使用することをお勧めします, シールの境界を見やすくし、マニキュアの境界の下にある動物のイメージングを防ぐのに役立ちます. イメージングする前に、マニキュアを完全に乾かしてください。濡れたマニキュアは顕微鏡の対物レンズに深刻な損傷を与える可能性があるため、このステップは重要です。注:スライドは、今後はできるだけ暗闇に保つ必要があります。平らな段ボール箱を使用して、ベンチで乾くときに覆います。 イメージングの前に、スライドを4°Cの暗所で1〜2週間保管します。必要に応じて、スライドを-20°Cで長期間保管します。 標準的な蛍光化合物光学顕微鏡を用いた画像。各スライドについて、まず、DAPIチャネルの10倍でサンプル全体を調べて、よく押し出された生殖腺を特定し、それらの配置をメモします。ほとんどのアプリケーションでは、動物の別の部分によって切断された、不完全な、または部分的に覆われた生殖腺のイメージングは避けてください。ほとんどの動物では、生殖腺の腕が完全に押し出されて見えるようになります。注:DAPIチャネルの生殖腺全体の10倍で低倍率の画像を撮影して、後の向きに使用したり、特定の核の位置を特定したりするのに役立つ場合があります。 アプリケーションに応じて、画像は40倍、63倍、または100倍で撮影できます。生殖腺全体をキャプチャする場合は、境界が重なり合うモンタージュを作成します。イメージング中、生殖腺は中空の管であり、核は上部と下部で最も密集していることを忘れないでください。