Investigación de la cooperación microbiana a través del análisis de espectrometría de masas de imágenes de colonias bacterianas cultivadas en agar y en tejidos durante la infección

El microbioma humano es un ecosistema altamente dinámico que involucra interacciones moleculares de bacterias, virus, arqueas y otros eucariotas microbianos. Si bien las relaciones microbianas han sido intensamente estudiadas en los últimos años, queda mucho por entender sobre los procesos microbianos a nivel químico ^1,2. Esto se debe en parte a la falta de disponibilidad de herramientas capaces de medir con precisión entornos microbianos complejos. Los avances en el campo de la espectrometría de masas (IMS) de imágenes en la última década han permitido el mapeo espacial in situ y libre de etiquetas de muchos metabolitos, lípidos y proteínas en sustratos biológicos ^3,4. La desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) se ha convertido en la técnica de ionización más común utilizada en la espectrometría de masas de imágenes, que implica el uso de un láser UV para extirpar material de la superficie de una sección de tejido delgado para su medición por espectrometría de masas⁴. Este proceso se ve facilitado por la aplicación de una matriz química aplicada homogéneamente a la superficie de la muestra, lo que permite realizar mediciones secuenciales en un patrón ráster a través de la superficie de la muestra. Los mapas de calor de las intensidades de iones de analito se generan después de la adquisición de datos. Los avances recientes en las fuentes de ionización y las técnicas de muestreo han permitido el análisis de sustratos no tradicionales como las bacterias⁵ y los especímenes celulares ^6,7,8 de mamíferos cultivados en agar nutriente. La información espacial molecular proporcionada por IMS puede proporcionar una visión única de la comunicación bioquímica de las interacciones microbio-microbio y huésped-microbio durante la infección 9,10,11,12,13,14.

Tras la infección por Clostridioides difficile (CDI), C. difficile está expuesta a un ambiente microbiano que cambia rápidamente en el tracto gastrointestinal, donde es probable que las interacciones polimicrobianas afecten los resultados de la infección^15,16. Sorprendentemente, se sabe poco sobre los mecanismos moleculares de las interacciones entre C. difficile y la microbiota residente durante la infección. Por ejemplo, los enterococos son una clase de patógenos comensales oportunistas en el microbioma intestinal y se han asociado con una mayor susceptibilidad y gravedad de la ICD^17,18,19,20. Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos moleculares de las interacciones entre estos patógenos. Para visualizar la comunicación de moléculas pequeñas entre estos miembros del microbioma intestinal, se cultivaron macrocolonias bacterianas en agar para simular las interacciones microbio-microbio y la formación de biopelículas bacterianas en un ambiente controlado. Sin embargo, la obtención de distribuciones metabólicas representativas en el análisis de espectrometría de masas de imágenes MALDI de muestras de cultivo bacteriano es un desafío debido al alto contenido de agua y la topografía superficial desigual de estas muestras. Esto se debe en gran parte a la naturaleza altamente hidrófila del agar y la respuesta superficial no uniforme del agar durante la eliminación de humedad.

El alto contenido de agua del agar también puede dificultar la obtención de un recubrimiento homogéneo de la matriz MALDI y puede interferir con el análisis MALDI posterior realizado en el vacío²¹. Por ejemplo, muchas fuentes MALDI operan a presiones de 0.1-10 Torr, que es un vacío suficiente para eliminar la humedad del agar y puede causar la deformación de la muestra. Estos cambios morfológicos en el agar inducidos por el ambiente de vacío causan burbujeo y agrietamiento en el material de agar seco. Estos artefactos reducen la adherencia del agar al portaobjetos y pueden causar el desmontaje o la descamación de la muestra en el sistema de vacío del instrumento. El grosor de las muestras de agar puede estar a una distancia de hasta 5 mm del portaobjetos, lo que puede crear un espacio libre insuficiente de la óptica de iones dentro del instrumento, causando contaminación y / o daños a la óptica de iones del instrumento. Estos efectos acumulativos pueden resultar en reducciones de la señal iónica que refleja la topografía de la superficie, en lugar de las interacciones bioquímicas microbianas subyacentes. Las muestras de agar deben secarse homogéneamente y adherirse fuertemente a un portaobjetos de microscopio antes del análisis en vacío.

Este documento demuestra un flujo de trabajo de preparación de muestras para el secado controlado de macrocolonias de cultivo bacteriano cultivadas en medios de agar. Este proceso de secado más lento y de varios pasos (en relación con los informados anteriormente) garantiza que el agar se deshidrate uniformemente al tiempo que minimiza los efectos del burbujeo o agrietamiento de las muestras de agar montadas en portaobjetos de microscopio. Mediante el uso de este método de secado gradual, las muestras se adhieren fuertemente al portaobjetos del microscopio y son susceptibles de aplicación posterior en matriz y análisis MALDI. Esto se ejemplifica utilizando colonias bacterianas modelo de C. difficile cultivadas en agar y modelos de tejido murino que albergan CDI con y sin la presencia del patógeno comensal y oportunista, Enterococcus faecalis. Los análisis de espectrometría de masas de imágenes MALDI de modelos bacterianos y tisulares permiten el mapeo espacial de perfiles de metabolitos de aminoácidos, proporcionando una nueva visión del metabolismo microbiano bioenergético y la comunicación.