Оценка термических повреждений от роботизированной краниотомии для хирургии черепного окна у мышей

Черепные окна стали повсеместно использоваться в областях неврологии, нейронной инженерии и биологии, чтобы обеспечить прямую визуализацию и визуализацию коры головного мозга у живых животных 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Мощная комбинация трансгенных мышей и многофотонной визуализации дала чрезвычайно ценную информацию об активности цепи и других биологических знаниях в мозге in vivo 12,13,14,15,16,17,18. Миниатюрные микроскопы, установленные на черепе, еще больше расширили эти возможности, чтобы обеспечить запись бодрствующих, свободно движущихся животных¹⁹. Процесс создания черепного окна требует силового сверления для истончения или полного удаления черепной кости для получения достаточно больших краниотомий, чтобы закрепить прозрачный кусок стекла над корой²⁰. Полидиметилсилоксан (ПДМС) и другие полимеры также были испытаны в качестве материалов для черепных окон ^9,21. В конечном счете, идеальное черепное окно – это то, которое не изменяет и не мешает нормальной эндогенной активности под ним. Тем не менее, общепризнано, что сверление черепного окна усугубляет подлежащую ткань, что приводит к повреждению мозга, нарушению окружающей среды и влиянию на мозговые оболочки до такой степени, что закупоривает многофотонную визуализацию глубиной²². Возникающее в результате нейровоспаление имеет широкий спектр эффектов, начиная от проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и заканчивая активацией и рекрутированием глиальных клеток вокруг места^{имплантации 23}. Таким образом, определение более безопасных и воспроизводимых методов сверления черепных окон имеет решающее значение для стабильного качества визуализации и снижения смешанных факторов.

В то время как принимаются меры для минимизации травмы подлежащих тканей, акт сверления кости может вызвать как термические, так и механические возмущения мозга^24,25. Механическая травма в результате случайного проникновения сверла в твердую мозговую оболочку может дополнительно вызвать повреждение коры головного мозга различной степени²⁴. В исследовании, проведенном Shoffstall et al.25, тепло от сверления костей приводило к повышенной проницаемости ГЭБ, о чем свидетельствует присутствие красителя Evans Blue (EB) в паренхиме головного мозга ²⁵. Краситель БЭ, вводимый внутривенно, связывается с циркулирующим альбумином в кровотоке и, следовательно, обычно не проникает через здоровый ГЭБ в заметных концентрациях. В результате краситель EB обычно используется в качестве чувствительного маркера проницаемости ГЭБ^26,27. Хотя их исследование напрямую не измеряло влияние проницаемости ГЭБ на последующие биологические последствия, предыдущие исследования коррелировали проницаемость ГЭБ с повышенной нейровоспалительной реакцией на хронически имплантированные микроэлектроды и изменениями двигательной функции²⁸.

В зависимости от целей исследования, величина термических и механических повреждений может способствовать источнику экспериментальной ошибки, отрицательно влияя на строгость и воспроизводимость исследования. Существуют десятки цитируемых методов изготовления черепных окон, каждый из которых использует различное буровое оборудование, скорости, методы и пользователей 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 сообщили, что наблюдаемые изменения в результатах нагрева были связаны с изменчивостью приложенной силы бура, скорости подачи и угла применения, а также с другими аспектами, которые не могут контролироваться при бурении вручную ²⁵. Существует мнение, что автоматизированные системы бурения и другое стереотаксическое оборудование могут улучшить воспроизводимость и согласованность результатов, но опубликованные исследования методов не проводили строгой оценки температуры или проницаемости ГЭБ в качестве одного из результатов. Таким образом, существует потребность в более воспроизводимых и последовательно применяемых методах изготовления черепных окон, а также в методах, строго применяемых для оценки воздействия сверления черепных окон на подлежащую нервную ткань.

Основное внимание в этом исследовании уделяется определению и разработке последовательных и безопасных методов бурения черепных окон. Размер трепанации черепа для установки черепного окна значительно больше, чем у стандартной трепанации для имплантированных в мозг микроэлектродов. Такая трепанация черепа не может быть выполнена с помощью одного отверстия для заусенцев при использовании стандартного оборудования, тем самым привнося большую вариабельность техники между хирургами при выполнении рукой²⁰. Хирургические буровые роботы были введены в поле, но не получили широкого распространения ^1,6,29. Автоматизация бурения обеспечивает контроль над переменными, способствующими наблюдаемым изменениям от испытания к испытанию, предполагая, что использование оборудования может уменьшить меж- и внутрихирургические эффекты. Это представляет особый интерес, учитывая дополнительную сложность большой трепанации черепа, необходимой для установки черепного окна. Хотя можно было бы предположить, что автоматизация бурения дает очевидные преимущества для контроля, было мало оценок внедрения этого оборудования. Хотя видимых поражений не наблюдалось⁵, желателен тест с более высокой чувствительностью с использованием БЭ.

Здесь проницаемость ГЭБ измеряется с помощью коммерчески доступного хирургического сверлильного робота с соответствующим программным обеспечением, которое позволяет программировать стереотаксические координаты, планировать/картировать трепанацию черепа и выбирать стили бурения («точка за точкой» и «горизонтально»), ссылаясь на маршрутизированную траекторию бурового долота. Вначале просверливаются восемь «семенных» точек (рис. 1А), очерчивающих краниальное окно. Отсюда пространство между семенами вырезается с помощью «точечного» или «горизонтального» метода сверления. «Точка за точкой» выполняет вертикальные пропилы пилотных отверстий (аналогично сверлильному станку с ЧПУ), а «горизонтальный» выполняет горизонтальные разрезы по окружности черепного окна, которые очерчивают отверстие (аналогично фрезерному станку с ЧПУ). Результатом обоих методов является кусок черепа, который можно удалить, чтобы открыть черепное окно. Чтобы изолировать повреждения от сверления, черепное окно физически не удаляется, чтобы избежать каких-либо дополнительных повреждений. Комбинация красителя EB в сочетании с флуоресцентной визуализацией используется для измерения проницаемости ГЭБ после выполнения краниотомии у мышей, а вставленная термопара используется для непосредственного измерения температуры поверхности мозга во время сверления (рис. 1B, C). Предыдущие наблюдения показали, что импульсное включение/выключение бурения с интервалом 2 с было достаточным для смягчения нагрева^{сверла 25} и, следовательно, включено в экспериментальный подход для хирургического робота.

Целью представленной работы является демонстрация методов оценки термических повреждений от трепанации черепа. Хотя методы представлены в контексте автоматизированного бурения, такие методы могут быть применены и к схемам ручного бурения. Эти методы могут быть использованы для проверки использования оборудования и/или схем бурения перед принятием в качестве стандартной процедуры.

Рисунок 1: Схема экспериментального трубопровода. Схема, демонстрирующая процесс, которому подверглись животные для количественной оценки БЭ после процедуры черепного окна. (A) Схематическая установка мыши со стереотаксической рамой и дрелью хирургического робота. Пример черепного окна показан над моторной корой с начальными точками (зеленый) и краевыми точками (синий). (B) Перфузионная установка включает в себя инъекцию 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) по всему животному для удаления крови с последующим извлечением мозга. (C) Затем мозг помещают в камеру флуоресцентной системы визуализации EB для проведения флуоресцентной визуализации на красителе Evans Blue. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.