عزل وإعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة للخلايا النجمية للفئران
Summary
هنا نصف بروتوكولا مفصلا لتوليد ثقافات عالية الإثراء من الخلايا النجمية المستمدة من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي للفئران بعد الولادة وتحويلها المباشر إلى خلايا عصبية وظيفية عن طريق التعبير القسري عن عوامل النسخ.
Abstract
إعادة البرمجة العصبية المباشرة هي نهج قوي لتوليد الخلايا العصبية الوظيفية من مجموعات الخلايا المبتدئة المختلفة دون المرور عبر وسيطات متعددة القدرات. هذه التقنية لا تحمل فقط وعودا كبيرة في مجال نمذجة الأمراض ، لأنها تسمح بتحويل ، على سبيل المثال ، الخلايا الليفية للمرضى الذين يعانون من أمراض تنكسية عصبية إلى خلايا عصبية ، ولكنها تمثل أيضا بديلا واعدا للعلاجات البديلة القائمة على الخلايا. في هذا السياق، كان الاختراق العلمي الرئيسي هو إثبات أن الخلايا غير العصبية المتباينة داخل الجهاز العصبي المركزي، مثل الخلايا النجمية، يمكن تحويلها إلى خلايا عصبية وظيفية في المختبر. ومنذ ذلك الحين، قدمت إعادة البرمجة المباشرة في المختبر للخلايا النجمية إلى خلايا عصبية رؤى جوهرية حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء التحويل القسري للهوية والعقبات التي تمنع إعادة البرمجة الفعالة. ومع ذلك ، يصعب مقارنة نتائج التجارب المختبرية التي أجريت في مختبرات مختلفة بسبب الاختلافات في الطرق المستخدمة لعزل الخلايا النجمية وزراعتها وإعادة برمجتها. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لعزل الخلايا النجمية واستزراعها بشكل موثوق به مع نقاء عال من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي للفئران في سن ما بعد الولادة عن طريق فرز الخلايا المغناطيسية. علاوة على ذلك ، نحن نقدم بروتوكولات لإعادة برمجة الخلايا النجمية المستزرعة في الخلايا العصبية عن طريق النقل الفيروسي أو نقل الحمض النووي. يمكن استخدام هذا البروتوكول المبسط والموحد للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الحفاظ على هوية الخلية ، وإنشاء هوية عصبية جديدة ، بالإضافة إلى توليد أنواع فرعية عصبية محددة وخصائصها الوظيفية.
Introduction
الجهاز العصبي المركزي للثدييات (CNS) معقد للغاية ، ويتكون من مئات أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك عدد كبير من الأنواع الفرعية العصبية المختلفة1،2،3،4،5،6. على عكس الأعضاء أو الأنسجة الأخرى7،8،9 ، فإن الجهاز العصبي المركزي للثدييات لديه قدرة تجديدية محدودة للغاية. فقدان الخلايا العصبية بعد إصابة الدماغ الرضحية أو التنكس العصبي لا رجعة فيه وغالبا ما يؤدي إلى عجز حركي ومعرفي10. بهدف إنقاذ وظائف الدماغ ، تخضع استراتيجيات مختلفة لاستبدال الخلايا العصبية المفقودة لتحقيق مكثف11. من بينها ، تظهر إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الجسدية إلى خلايا عصبية وظيفية كنهج علاجي واعد12. إعادة البرمجة المباشرة ، أو التمايز المتبادل ، هي عملية تحويل نوع خلية متمايزة واحدة إلى هوية جديدة دون المرور عبر حالة تكاثرية وسيطة أو متعددة القدرات13،14،15،16. رائدة من خلال تحديد MyoD1 كعامل كاف لتحويل الخلايا الليفية إلى خلايا عضلية17,18 ، تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لإعادة برمجة عدة أنواع من الخلايا إلى خلايا عصبية وظيفية19,20,21.
الخلايا النجمية ، وهي أكثر الخلايا الدبقية الكبيرة وفرة في الجهاز العصبي المركزي22,23 ، هي نوع من الخلايا الواعدة بشكل خاص لإعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة لعدة أسباب. أولا ، يتم توزيعها على نطاق واسع وبالتساوي عبر الجهاز العصبي المركزي ، مما يوفر مصدرا وفيرا في loco للخلايا العصبية الجديدة. ثانيا ، ترتبط الخلايا النجمية والخلايا العصبية ارتباطا وثيقا من الناحية التنموية ، لأنها تشترك في سلف مشترك أثناء التطور الجنيني ، الخلايا الدبقية الشعاعية24. يبدو أن الأصل الجنيني الشائع لنوعي الخلايا يسهل تحويل الخلايا العصبية مقارنة بإعادة برمجة الخلايا من طبقات جرثومية مختلفة19,21. علاوة على ذلك ، يتم الاحتفاظ أيضا بمعلومات الأنماط الموروثة من قبل الخلايا النجمية من خلال أصلها الدبقي الشعاعي في الخلايا النجمية البالغة25،26،27 ، ويبدو أنها تساهم في توليد الأنواع الفرعية العصبية المناسبة إقليميا28،29،30. وبالتالي ، فإن التحقيق في تحويل الخلايا النجمية إلى خلايا عصبية وفهمه هو جزء مهم من تحقيق الإمكانات الكاملة لهذه التقنية لاستراتيجيات الاستبدال القائمة على الخلايا.
أدى تحويل الخلايا النجمية المستزرعة في المختبر إلى خلايا عصبية إلى العديد من الاختراقات في مجال إعادة البرمجة العصبية المباشرة ، بما في ذلك: i) تحديد عوامل النسخ الكافية لتوليد الخلايا العصبية من الخلايا النجمية 15,19,31 ، ii) تفكك الآليات الجزيئية الناجمة عن عوامل إعادة برمجة مختلفة في نفس السياق الخلوي 32 ، و iii) تسليط الضوء على تأثير الأصل التنموي للخلايا النجمية على تحفيز أنواع فرعية عصبية مختلفة28،29،33. علاوة على ذلك ، كشف التحويل المباشر للخلايا النجمية في المختبر عن العديد من العقبات الرئيسية التي تحد من إعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة 34,35 ، مثل زيادة إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)34 والاختلافات بين بروتيوم الميتوكوندريا للخلايا النجمية والخلايا العصبية 35. وبالتالي ، تدعم هذه الملاحظات بقوة استخدام الثقافات الأولية للخلايا النجمية كنموذج لإعادة البرمجة العصبية المباشرة للتحقيق في العديد من الأسئلة الأساسية في علم الأحياء12 ، المتعلقة بالحفاظ على هوية الخلية ، وحواجز الطرق التي تمنع تغيرات مصير الخلية ، وكذلك دور التمثيل الغذائي في إعادة البرمجة.
نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لعزل الخلايا النجمية عن الفئران في سن ما بعد الولادة (P) بنقاء عال جدا ، كما يتضح من عزل الخلايا النجمية عن الحبل الشوكي الفئران29. كما نقدم بروتوكولات لإعادة برمجة الخلايا النجمية إلى خلايا عصبية عن طريق النقل الفيروسي أو نقل بلازميد الحمض النووي. يمكن تحليل الخلايا المعاد برمجتها في 7 أيام بعد النقل (7 DPT) لتقييم جوانب مختلفة ، مثل كفاءة إعادة البرمجة ومورفولوجيا الخلايا العصبية ، أو يمكن الحفاظ عليها في الثقافة لعدة أسابيع ، لتقييم نضجها بمرور الوقت. الأهم من ذلك ، أن هذا البروتوكول ليس خاصا بالخلايا النجمية في الحبل الشوكي ويمكن تطبيقه بسهولة لعزل الخلايا النجمية عن مختلف مناطق الدماغ الأخرى ، بما في ذلك المادة الرمادية القشرية والدماغ المتوسط والمخيخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
الثقافات الأولية للخلايا النجمية الفئران هي نظام نموذج رائع في المختبر لدراسة إعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة. في الواقع ، على الرغم من عزلها في مرحلة ما بعد الولادة ، تعبر الخلايا عن علامات الخلايا النجمية النموذجية 29 ، وتحتفظ بالتعبير عن الجينات النمطية 28,29…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر إينيس مولهان على استنساخ التركيبات لإعادة برمجتها، وبولينا شليبيك على الإنتاج الفيروسي، وماجدالينا غوتز وجوديث فيشر-ستيرنجاك على تعليقاتهما على المخطوطة.
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
References
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
- Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
- Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration – a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
- Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
- Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
- Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
- Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
- Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
- Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
- Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
- Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
- Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
- Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
- Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
- Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
- Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).
