マウス腸間葉系の単離により、テロサイトの高収率が得られます

上記の腸間葉系分離プロトコルは、Wuら12およびShoshkes-Carmelら8の両方に記載されたプロトコルから改変された。Wuらに記載されているプロトコルは結腸用であり、Shoshkes-Carmelらのプロトコルは小腸用であるため、消化条件は酵素の組み合わせ、作業濃度、およびインキュベーション時間が異なります。ここで、記載されたプロトコールは、テロサイトを含む腸間葉系細胞を単離および培養するために首尾よく使用されている。簡単に説明すると、テロサイトを膜-GFP(緑)で標識し、他の間葉系細胞を膜-tdTomato(赤)で標識したFOXL1-Cre:Rosa-mTmGマウスモデル8を使用して、十二指腸から回腸まで小腸を解剖しました。消化酵素を用いて組織を解離させ、間葉を6ウェルプレートに播種した。解離後、テロサイトは細胞特性を失い、丸い細胞形態を示し(図2A)、これは1日目のGFP+細胞の定量不足に反映されています(図2F)。数日後、テロサイトは短い細胞突起を伴う小さな伸張細胞形態を示します(図2B、C)。しかし、播種後7〜10日で、テロサイトは細胞特性を取り戻し、長い細胞質プロセスを伴う大きな伸張細胞形態を示し(図2D、E)、オルガノイドとの共培養で使用して増殖をサポートする準備が整います。 図2:FOXL1Cre:Rosa-mTmGマウス腸から単離された培養間葉。FOXL1+テロサイトはGFPで標識されていますが、他の間葉系細胞はtdTomato+です。(A-E)現在のプロトコルを使用して単離された培養間葉の代表的な画像は、6ウェルプレートに播種され、1(A)、4(B、C)、および7(D、E)日の培養後に画像化されました。スケールバー= 100 μm。 (F)培養1、4、7日目における視野あたりのGFP/tdTomatoes細胞比率(パーセンテージ)の定量。略語:FOXL1 =フォークヘッドボックスL1タンパク質;GFP = 緑色蛍光タンパク質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 この単離プロトコルを評価し、細胞組成を明らかにするために、得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリーで分析しました(図3)。全体として、単離された細胞の69%がDAPI染色に基づいて生存可能でした(図3 III)。生細胞のうち、60.9%が上皮汚染と免疫細胞および内皮細胞(CD326+、CD45+、およびCD31+;図 3テロサイト画分(GFP +)は、それぞれ100kおよび70kのFSCおよびSSCの上に散在し(図3 VI)、ゲート付き間葉(生CD45-、CD326-、CD31-)からほぼ10%を表した(図3V)。 図3:単離された成体マウス腸間葉からテロサイトを選別するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。 (I)低レベルの側方散乱事象は除外した。(II)単一細胞をSSC面積によってSSC高さに応じてゲーティングした。(III)DAPI+イベントは、死細胞をソートから除外するためにゲートアウトされました。(IV)DAPI−CD45+/CD326+/CD31+イベントは、免疫細胞、上皮細胞、および内皮細胞をそれぞれ除外するためにゲーティングアウトされた。(V)GFP +テロサイトは、DAPI-CD45-/CD326-/CD31-細胞の10.3%を占めた。(VI)バックゲーティング解析により、FSC-A/SSC-AプロットでGFP+テロサイトの座標が明らかになりました。略語: SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FSC-A = 前方散乱ピーク面積;SSC-H = 側方散乱ピークの高さ;DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;GFP = 緑色蛍光タンパク質;APC =アロフィコシアニン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 並行して、野生型(WT)C57Bl6マウス腸から間葉を単離し、テロサイト画分をGFP標識したFOXL1Cre:Rosa-mTmGマウスモデルから分離した間葉で以前に分析した表面マーカーの組み合わせを使用して、テロサイト画分を評価しました。我々は、テロサイトのサブセットがCD201およびポドプラニン(GP38)に対する陽性染色によって定義できることを見出した(図4)。さらに、単離および培養1日後の免疫染色でこれらのマーカーを使用すると、細胞はまだ細胞特性を示していないものの、これらの分子マーカーの発現が得られ、GFP+ テロサイトの70%〜80%で染色を示すことを確認しました(図5)。 表面マーカーによって定義されるテロサイト画分は、FOXL1駆動レポーターマウスを使用して得られたものと同一ではありません。テロサイトは非常に不均一であり、いくつかのサブセットが含まれています。テロサイトの定義には、表面マーカーとFOXL1標識を組み合わせる必要があります。FOXL1Cre:Rosa-mTmGマウスの小腸では、GFP + 細胞の60%〜70%がCD201陽性であり、65%〜80%がGP38陽性です。表面マーカーを使用する場合、抗体の不適切な保存および反復的な凍結融解サイクルは結合効率を低下させることに注意することが重要です。さらに、酵素消化は表面マーカー発現を混乱させる可能性があります。間葉系細胞に発現する膜貫通プロテオグリカンであるCD138の発現が破壊され、解離とともに大幅に減少することを観察しました。 図4:現在のプロトコルを用いたFOXL1Cre:Rosa-mTmGマウス小腸から単離された単一細胞間葉系懸濁液のFACS分析。(I-II)単一細胞、(III)DAPI-、(IV-VI)Lin-(CD45-、CD326-、CD31-)GFP+細胞に関するFACS分析では、(VII)GFP+の65.3%およびトマト+の31.2%がGP38に対して陽性であるのに対し、(VIII)GFP+の60.5%およびトマト+の22.6%がCD201に対して陽性であることを示している。略語: SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FSC-A = 前方散乱ピーク面積;SSC-H = 側方散乱ピークの高さ;DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;GFP = 緑色蛍光タンパク質;APC =アロフィコシアニン;PE =フィコエリスリン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:培養初日目の間葉系、固定、間葉系マーカーの染色。 (A-D)GP38について染色した培養間葉系の代表的な画像。(F-I)CD201について染色された培養間葉系の代表的な画像。スケールバー= 100 μm。 (E)トマト+GP38+とトマト+ CD201+のダブルポジティブを総トマト+から定量。(J)総GFP+からのGFP+ GP38+およびGFP+ CD201+のダブルポジティブの定量。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 ソリューション A: HBSSには、2S、1 mM DL-ジチオスレイトール(DTT)、2 mM EDTA(pH 8.0)を添加しました。 補完培地1640(CM1640): 10S、ペン/連鎖球菌(100単位ペニシリン/ mL、100μgストレプトマイシン/ mL)を添加したRPMI 1640培地。 消化液: 100 U/mL コラゲナーゼ タイプVIII、75 mg/mL DNase I を 4 mL の予熱した CM1640 中。注:消化手順が始まる直前にコラゲナーゼとDNase Iを追加します。 培地: 10 μg/mLのゲンタマイシン、10 mM HEPES、グルタミン、ペン/連鎖球菌(100単位のペニシリン/mL、100 μgのストレプトマイシン/mL)を添加したDMEM-F12培地。 FACS バッファ: PBSには5Sと1 mM EDTAを添加した。 表1:プロトコルで使用されるすべてのソリューションの構成。 補足表S1:現在のプロトコルと2つの参照プロトコルの主な違いをここにリストします。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。