キャプチャHi-C による 高分解能3Dクロマチン構成の解読

この研究で使用されたマウス胚性幹細胞(mESC)は、キュリー研究所(パリ)51の動物飼育ガイドラインに従って、TX / TX R26rtTA / rtTA雌50とMus musculus castaneus雄の交配から得られました。 1. プローブ設計 目的のターゲット領域をカバーするビオチン化プローブ(120-mer RNAオリゴヌクレオチド)のアレイを設計します。ターゲット内の各配列が平均して2つの固有のプローブ(2倍のカバレッジ)で覆われるように、重複するオリゴヌクレオチドで関心領域をタイル化します(図1)。 プローブカバレッジから反復配列を除外して、非特異的相互作用の濃縮を回避します。注:有益なライゲーションフラグメントの濃縮を最大化するために、ターゲット全体の各DpnII制限部位の上流および下流300 bpにまたがる領域が定義され(ChrX:102,475,000-105,475,000)、Sure Designプラットフォームを介してSureSelect DNAターゲット濃縮技術に従って28,913のビオチン化プローブを設計しました52.この戦略によれば、非特異的相互作用の濃縮を最小限に抑えるために、各オリゴヌクレオチドに最大40塩基の反復配列が許可されます。プローブアレイはアジレント社により合成した。ここで、DpnIIは、2つの理由で制限酵素として使用される:(1)それはいくつかの3Cベースの方法で日常的に使用される4カッターである53;(2)この研究で使用されたF1ハイブリッド株(C57BL / 6J x CASTEi / J)の インシリコ でテストされた他の制限酵素と比較して、切断部位の近くで有益な一塩基多型(SNP)をキャプチャする可能性を最大化します。 2. 実験手順 細胞調製1つまたは複数の細胞培養プレートに適切な数の細胞を播種し、固定当日に5 x 107 細胞≥の合計細胞数を達成します。注:この研究では、マウス胚性幹細胞(mESC)を使用しました。mESCは、2i + LIFおよびバッチ試験されたウシ胎児血清(DMEM、15S、0.1 mM β-メルカプトエタノール、1,000 U/mL-1白血病抑制因子(LIF)、CHIR99021(3 μM)、およびPD0325901(1 μM)を含むmESC培地のゼラチン化(37°C、5%CO2インキュベーターで1x PBS – o/n中の0.1%ゼラチン)細胞培養プレートにプレーティングされます。この細胞型の場合、1つの80%コンフルエントな10 cmプレートには、約2 x 107 細胞が含まれています。 細胞カウント用に追加の細胞培養プレートを1枚準備します。注:より小さな細胞培養プレートを使用して、培地の使用量を減らすことができます。この場合、小さい方のプレートに播種する細胞の数は、それに応じて調整する必要があります(例えば、15cmのプレートと比較して、10cmのプレート上の細胞数が3倍少なくなります)。 ホルムアルデヒド固定架橋する細胞の総数を推定します。架橋反応を開始する前に、製造元の指示に従って、自動セルカウンターを使用して、細胞カウント用に特別に調製されたコントロールプレートから細胞をトリプシン処理してカウントします。 生存率染色(例えば、トリパンブルー)を含めて、生存細胞54の割合を決定する。この細胞数から、架橋用に調製したプレート内の細胞の総数を推定します。 架橋用に調製したプレートから培養液を取り出し、適量の固定液(細胞培養液中の2%ホルムアルデヒド)と交換します。10 cmプレートで10 mLを使用します(例:15 cmプレートの場合は~20 mL)。.注意: 固定液の正確な量を追加します。接着細胞を固定することが不可能な場合、このステップはトリプシン処理された細胞に適合させ、50mLのコニカル遠沈管中の30mLの固定溶液中で行うことができる。ホルムアルデヒドは1歳以上であってはなりません。使い捨てバイアルを使用することが好ましい。固定液は使用前に室温(RT)にする必要があります。注意: ホルムアルデヒドは危険であり、適切な健康と安全の規制に従って取り扱う必要があります。 シェーカーで穏やかに混合しながらRTで10分間固定します。 2.5 M グリシン-1x PBSを最終濃度0.125 Mまで添加して固定反応をクエンチし、530 μLの2.5 Mグリシン-1x PBSを10 cmプレートで10 mLに加えます(例:15 cmプレートで1060 μLから20 mL)。注:細胞を溶液中で固定した場合は、1590 μLの2.5 Mグリシン-1x PBSで固定反応をクエンチします。 RTで5分間インキュベートし、シェーカーで穏やかに混合します。 プレートを氷に移し、シェーカーで穏やかに混合しながら、氷上でさらに15分間インキュベートします。注:今後は、細胞を氷上に保持し、さらなる架橋を避けるためにバッファーを事前に冷却する必要があります。多くのプレートを処理する必要がある場合は、冷蔵室に移動します。 固定溶液をビーカーに注いで細胞から取り除き、迅速な取り扱いを確保します。注意: ホルムアルデヒド含有液体廃棄物は、適切な健康と安全の規制に従って廃棄してください。 10 cmプレートを5 mLの冷たい0.125 Mグリシン-1x PBS(15 cmプレートの場合は8 mL)で2回すばやくすすぎ、破片と死んだ細胞を洗い流します。液体をビーカーに注ぎ、プレートから液体を取り除き、迅速な取り扱いを確保します。 5 mLの冷たい0.125 Mグリシン-1x PBSを10 cmプレート(15 cmプレートの場合は10 mL)に加え、プラスチックセルスクレーパーを使用してプレートから細胞をすばやくこすり落とします。 血清学的ピペットを使用して、細胞懸濁液を予冷された50 mLコニカル遠心チューブに移します。 プレートを5 mLの冷たい0.125 Mグリシン-1x PBSで2回すすぎ、細胞懸濁液を円錐形遠心チューブに加えます。 480 x g で4°Cで10分間スピンダウンします。注:細胞を溶液に固定した場合は、細胞を事前に冷却した円錐形の遠沈管に移し、480 x g で4°Cで10分間スピンダウンします。 固定液をビーカーに注ぎ、10 mLの冷たい0.125 Mグリシン-1x PBSで3回洗浄します。各洗浄ステップで細胞を再懸濁してください。 ベンチトップ吸引システムで吸引して上清を除去します。P1000ピペットで慎重に上下にピペッティングすることにより、1 x 107 細胞あたり1x PBSの500 μLで細胞を再懸濁します。正確な体積の細胞を再懸濁するには、2.2.1で得られた総細胞数の推定値を参照してください。 500 μLの細胞懸濁液を、計算された数の1.5 mLマイクロ遠心チューブ(1 x 107 セル/チューブ)に分注します。 480 x g で4°Cで10分間スピンダウンします。 ベンチトップ吸引システムで上清を除去し、細胞ペレットを液体窒素で急速凍結します。乾燥菌体ペレットを-80°Cで保存する。注:サンプルは少なくとも1年間保管できます。 細胞溶解凍結したペレットを氷上で解凍します。 サンプルあたり H 2 0 中の 1.5 mL 溶解バッファーを調製します:10 mM トリス塩酸塩、pH 8.0、10 mM NaCl、および0.2% NP40 を追加します。 600 μLの低温溶解バッファーを加え、氷上でよく再懸濁します。 氷上で15分間インキュベートして、細胞を膨潤させます。 2655 x g で4°Cで5分間スピンダウンし、ベンチトップ吸引システムを使用して上清を除去します。 破片を除去するには、ペレットを1 mLのコールドリシスバッファーに再懸濁し、2655 x g で4°Cで5分間スピンダウンし、上清を除去します。 2655 x g および4°Cで再びスピンし、P200チップを備えたベンチトップ吸引システムを使用して、残りの上清をできるだけ多く除去します。 0.5%(容量/容量)SDSの100 μLに再懸濁します。 62°Cのサーモミキサーで、1400rpmで10分間旋回しながらインキュベートします。 290 μLのH2O + 50 μLの10%TritonX-100を加え、気泡を避けてよく混合します。 37°Cのサーモミキサーで、1400rpmで15分間旋回させてインキュベートします。 50 μLの10x Dpnllバッファーを加え、チューブを反転させて混合します。 品質管理のために50 μLの未消化DNAを別のチューブに入れます。未消化の対照サンプルを採取することを忘れないでください。 DpnII消化高濃度のDpnll(合計500 U)を10 μL加え、反転させて混合します。 サンプルと未消化コントロールを37°Cのサーモミキサーでインキュベートし、1400 rpmで>4時間旋回させます。 一日の終わりに10 μLのDpnll高濃度(合計500 U)を追加します。 サンプルと未消化コントロールを37°Cでインキュベートし、1400rpmで一晩旋回させます。 翌日初めに高濃度Dpnll(合計500U)を10μLサンプルに加えます。 サンプルと未消化コントロールを37°Cのサーモミキサーでインキュベートし、1400 rpmで4時間旋回させます。 架橋のライゲーションと反転チューブを65°Cで1400rpmで20分間インキュベートします。注: この時点では SDS を追加しないでください。アイデアは核の完全性を維持することであるため、ライゲーションは核内で行われ、極端な希釈の必要性を回避します。 サンプルを氷上で最大5〜10分間冷却します。SDSの沈殿を避けるために、サンプルをこれより長く氷上に放置しないでください。 ライゲーションされていない消化DNA50 μLを品質管理のために別のチューブに入れます。未消化および結紮されていないコントロールを-20°Cで保存します。注:結紮されていない対照サンプルを採取することを忘れないでください。 800 μLのライゲーションカクテルを加えます:122 μLの10xリガーゼバッファー、8 μLのT4リガーゼ(30 U / μL)、および670 μLのH20。 16°Cでインキュベートし、1000rpmで一晩旋回させます。 7.5 μLのプロテイナーゼK(20 mg/mL)をサンプルに、2 μLをコントロールに加えます。 65°Cで1000rpmで4時間インキュベートします。 DNA精製氷上でサンプルを予冷した15 mLコニカル遠心チューブに移し、2 mLの水、10.5 mLの氷冷EtOH、および583 μLの3 M NaACを加えます。注:追加の水は、ペレットへのDTTのキャリーオーバーを防ぐことを目的としています。 200 μLの氷冷EtOH、10.8 μLのNaAC、および1 μLの共集塵剤を未消化および結紮されていない品質管理に加えます。 -80°Cで少なくとも4時間、一晩インキュベートします。 15 mLチューブを2200 x g で4°Cで45分間回転させます。 1.5 mL コントロールチューブを 20,500 x g で 4 °C で 30 分間回転させます。 3 mL(サンプル)と1 mL(コントロール)の氷冷70%EtOHで1回洗浄します。 2200 x g (サンプル) または 20,500 x g (コントロール) で 4 °C で 10 分間スピンします。 EtOHを慎重に取り外し、RTで10〜15分間風乾します。過度に乾燥させないでください。 サンプルとコントロールをそれぞれ100 μLと20 μLのH20に再懸濁します。 1 μLのRNAseAを添加し、37°Cでインキュベートし、1400 rpmで30分間旋回させます。 3Cテンプレート調製の品質管理高感度DNA濃度測定用の蛍光光度計キットを使用して、各サンプルとコントロールを定量します。 各サンプルと各コントロールの100〜200 ngを1%アガロース/ 1x TBEゲルにロードします。 図2Aに示すように、コントロールと3CテンプレートのDNAフラグメントサイズの違いを比較することにより、ゲル画像が期待される結果を示していることを確認します。 サンプルとコントロールは-20°Cで保存してください。 マルチプレックスシーケンシングのためのハイブリダイゼーション、キャプチャー、サンプル処理ビオチン化RNAプローブのアレイを3Cテンプレートにハイブリダイズするには、標的ライゲーションフラグメントを捕捉し、ペアエンドマルチプレックスシーケンシングのためにこの研究で使用されたターゲットエンリッチメントシステムに従ってマルチプレックスシーケンシング用のサンプルを調製します(参照 材料表).製造元の指示に従ってプロトコルに従い、次の小さな変更を導入します。メーカーのプロトコルのセクション2:サンプル調製3 μgのgDNAインプットから始まるターゲット濃縮の指示に従ってください。 次の仕様を使用して超音波処理器でDNAを剪断します:10%デューティサイクル、4強度、200 cyc /バースト、および130秒。捕捉反応ごとに4 μgの3Cテンプレートを130 μLの水に再懸濁して、3 μgの剪断DNAでサンプル調製を継続するのに十分な材料を確保します。 せん断されたDNAの品質を評価します。せん断したDNAを1 μL、高感度プロトコルに従ってDNAバイオアナライザーで実行します。フラグメントサイズの分布は150〜700 bpであると予想してください(図2)。 固相可逆固定化(SPRI)ビーズを使用してサンプルを精製します。124 μLの DNA サンプルに 124 μL の SPRI ビーズを加え、製造元の指示に従って 1:1 の左側サイズ選択を行い、25 μL のヌクレアーゼフリー水で溶出します。この精製ステップでは、短いフラグメントを除去して、約300 bpのフラグメントを濃縮します(図2)。注:このステップで使用されるサンプルとSPRIビーズの量は、サンプルを新しいチューブに移し、バイオアナライザーで品質管理を実行している間に発生した体積損失を考慮に入れています。後続のすべてのサイズ選択ステップは、メーカーのプロトコルで推奨されている比率に従って実行されます。SPRIビーズからのDNA溶出は、プロトコル全体を通してRTで行われます。 サイズ選択せん断DNAの品質を評価します。せん断されたDNAの1 μLを、高感度(HS)プロトコルに従ってDNAバイオアナライザーに流します。300 bpで最も高い濃縮度を持つフラグメントサイズの分布を期待してください(図2)。せん断が成功した場合は、せん断されたDNAの定量に進みます。 HS DNA濃度測定用の蛍光光度計キットを使用して、せん断されたDNAを定量します。注:DNAせん断の結果、DNA収量が<3 μgの場合は、さらに4 μgのDNAで2回目のDNAせん断を実行し、最初のSPRIビーズ精製ステップの後にせん断されたDNAサンプルを組み合わせて、合計3 μgのせん断DNAを達成します。 サイズ選択した洗浄済みDNAサンプル(合計3 μg)にヌクレアーゼフリーの水を加えて最終容量48 μLにし、メーカーのプロトコルに従って最終修復反応を進めます。 ペアエンドアダプターのライゲーション後、製造元の指示に従って5サイクルのプレキャプチャーPCRを実行してライブラリを増幅します(PCRの条件とプライマーはキットに記載されています)。 メーカーのプロトコルのセクション4:ハイブリダイゼーションとキャプチャ調製したDNAサンプルをターゲット特異的RNAプローブにハイブリダイズするには、750 ngのDNAサンプルを最終容量3.4 μLで希釈し、初期濃度を221 ng/μLにします。より大きな容量に希釈されたDNAサンプルの場合は、スピード真空濃縮器を使用して最終容量まで減らします。通常、10 μLに再懸濁したサンプルには、15〜20分間の速度真空濃縮(250 x g; ≤45°C)で十分です。 速度真空濃縮器を始動する前に、各サンプルの入力量が同じであることを確認してください。 ハイブリダイゼーション混合物を、製造元の指示に従って、105°Cで加熱した蓋をして、65°Cで16〜18時間インキュベートします。 メーカーのプロトコルのセクション5:マルチプレックスシーケンシングのためのインデックス作成とサンプル処理キャプチャしたライブラリをインデックスプライマーで増幅するには、製造元の指示に従って12サイクルのポストキャプチャーPCRを実行します(PCRの条件とプライマーはキットに記載されています)。 次世代シーケンシング同じフローセル上で複数のキャプチャHi-Cライブラリを実行するには、キャプチャライブラリの等モル混合物を調製し、ライブラリごとに100〜120 Mの読み取りをシーケンスします。 対立遺伝子特異的分析が必要な場合は、十分なSNPカバレッジを確保するために、150 bpペアエンドを配列します。 3.データ分析 HiC-Proパイプラインを適用して、キャプチャHi-Cデータ分析55を実行します。HiC-Proは、処理の各ステップで次のような品質管理を提供します(図3)。(i)ライゲーション部位にまたがるリードの割合、およびペアとシングルトンの数を指定する参照ゲノム上のアラインメント率。(2)有効なライゲーション製品と非有益なリードペア(ダングリングエンド、セルフライゲーションなど)の割合。(ウ)短距離/長距離および染色体内/染色体間接触の割合。(4)キャプチャHi-Cのオンターゲットコンタクトの割合。(5)対立遺伝子特異的リードの割合(指定されている場合)。注意: HiC-Proは、in situHi-CやキャプチャHi-Cを含む幅広いプロトコルをサポートしています。後者の場合、ユーザーは構成ファイルでターゲット領域 (BED 形式) を指定するだけで済みます。データが処理されると、HiC−Pro出力は、ダウンストリーム分析のためにより低温の物体に容易に変換することができる56。このステップでは、さまざまな解像度のコンタクトマップが、Imakaevらによって以前に記述されたICE法を使用して正規化されます57。その後、染色体コンパートメント、TAD、またはクロマチンループを呼び出すためにいくつかの分析を実行できます(レビュー58の場合)。プロトコルのワークフローを図 4 に示します。ここでは、「cooltools」スイートを適用して、図5および図6に示すように、絶縁スコアとTADの境界を計算します59。