Recopilación de datos crio-EM de una sola partícula con inclinación de la etapa utilizando Leginon

El advenimiento de los detectores directos de electrones en la última década ^1,2,3 ha estimulado un aumento exponencial en el número de estructuras de alta resolución de macromoléculas y ensamblajes macromoleculares resueltos utilizando crio-EM 4,5,6 de una sola partícula. Se espera que casi todas las especies macromoleculares purificadas sean susceptibles de determinación de la estructura mediante crio-EM, excepto las proteínas más pequeñas ~ 10 kDa de tamaño o por debajo de⁷. La cantidad de material de partida necesario para la preparación de la rejilla y la determinación de la estructura es al menos un orden de magnitud menor que otras técnicas de determinación de la estructura, como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear y la cristalografía de rayos X ^4,5,6.

Sin embargo, un desafío principal para la determinación de la estructura mediante crio-EM implica una preparación adecuada de la rejilla para la obtención de imágenes. Un extenso estudio que evaluó diversas muestras utilizando diferentes estrategias y rejillas de vitrificación sugirió que la mayoría de los enfoques para vitrificar muestras en rejillas crio-EM conducen a la adhesión preferencial de macromoléculas a la interfaz aire-agua⁸. Tal adherencia puede causar potencialmente cuatro resultados subóptimos: (1) la muestra macromolecular se desnaturaliza por completo, en cuyo caso no es posible una recopilación y procesamiento de datos exitosos; (2) la muestra se desnaturaliza parcialmente, en cuyo caso puede ser posible obtener información estructural de regiones de la macromolécula que no están dañadas; (3) la muestra conserva la estructura nativa, pero solo un conjunto de orientaciones de partículas en relación con la dirección del haz de electrones está representado en las imágenes; (4) La muestra conserva la estructura nativa, y algunas, pero no todas, las posibles orientaciones de partículas en relación con la dirección del haz de electrones están representadas en las imágenes. Para los casos (3) y (4), la recolección de datos inclinados ayudará a minimizar la anisotropía de resolución direccional que afecta al mapa crio-EM reconstruido y proporciona una solución generalizable para una amplia variedad de muestras⁹. Técnicamente, la inclinación también puede beneficiar el caso (2), ya que la desnaturalización presumiblemente ocurre en la interfaz aire-agua y limita de manera similar el número de orientaciones distintas representadas dentro de los datos. El grado de sesgo de orientación en el conjunto de datos puede alterarse potencialmente experimentando con aditivos de solución, pero la falta de aplicabilidad amplia dificulta estos enfoques de prueba y error. Inclinar la etapa de la muestra en un solo ángulo de inclinación optimizado es suficiente para mejorar la distribución de las orientaciones en virtud de la alteración de la geometría del experimento de imagen⁹ (Figura 1). Debido a la configuración geométrica de la muestra orientada preferentemente con respecto al haz de electrones, para cada grupo de orientaciones preferenciales, inclinar la rejilla genera un cono de ángulos de iluminación con respecto al centroide del cúmulo. Por lo tanto, esto extiende las vistas y, en consecuencia, mejora el muestreo del espacio de Fourier y la isotropía de la resolución direccional.

Hay, en la práctica, algunos inconvenientes para inclinar el escenario. La inclinación de la etapa de la muestra introduce un gradiente de enfoque en todo el campo de visión, lo que puede afectar a la precisión de las estimaciones de la función de transferencia de contraste (CTF). La recopilación de datos inclinados también puede conducir a un aumento del movimiento de partículas inducido por el haz causado por el aumento de los efectos de carga al obtener imágenes de muestras inclinadas. La inclinación de la rejilla también conduce a un aumento en el espesor aparente del hielo, lo que a su vez conduce a micrografías más ruidosas y, en última instancia, puede afectar la resolución de las reconstrucciones 5,9,10. Puede ser posible superar estos problemas aplicando esquemas avanzados de procesamiento computacional de datos que se describen brevemente en las secciones de protocolo y discusión. Por último, la inclinación puede conducir a una mayor superposición de partículas, lo que dificulta la posterior canalización de procesamiento de imágenes. Aunque esto puede mitigarse hasta cierto punto optimizando la concentración de partículas en la red, no obstante es una consideración importante. Aquí, se describe un protocolo fácil de implementar para la recopilación de datos inclinados utilizando el paquete de software Leginon (un software automatizado de adquisición de imágenes), disponible en acceso abierto y compatible con una amplia gama de microscopios^11,12,13,14. El método requiere al menos la versión 3.0 o superior, con las versiones 3.3 en adelante que contienen mejoras dedicadas para permitir la recopilación de datos inclinados. No se necesita software o equipo adicional para este protocolo. En otra parte se proporcionan instrucciones extensas sobre infraestructura computacional y guías de instalación¹⁵.