Сбор данных о крио-ЭМ с одной частицей с наклоном ступени с помощью Leginon

Появление детекторов прямых электронов за последнее десятилетие ^1,2,3 стимулировало экспоненциальный рост числа структур высокого разрешения макромолекул и макромолекулярных сборок, решаемых с помощью одночастичных крио-ЭМ ^4,5,6. Ожидается, что почти все очищенные макромолекулярные частицы будут поддаваться определению структуры с помощью крио-ЭМ, за исключением мельчайших белков размером ~ 10 кДа или менее⁷. Количество исходного материала, необходимого для подготовки сетки и определения структуры, по крайней мере, на порядок меньше, чем у других методов определения структуры, таких как спектроскопия ядерного магнитного резонанса и рентгеновская кристаллография ^4,5,6.

Тем не менее, основная проблема для определения структуры с помощью крио-ЭМ связана с подходящей подготовкой сетки для визуализации. Обширное исследование, оценивающее различные образцы с использованием различных стратегий и сеток витрификации, показало, что большинство подходов к витрификации образцов на крио-электромагнитных сетках приводят к преимущественному присоединению макромолекул к границе раздела^{воздух-вода 8}. Такая приверженность потенциально может привести к четырем неоптимальным результатам: (1) макромолекулярный образец полностью денатурирует, и в этом случае успешный сбор и обработка данных невозможны; (2) образец частично денатурируется, и в этом случае можно получить структурную информацию из областей макромолекулы, которые не повреждены; (3) образец сохраняет нативную структуру, но на изображениях представлен только один набор ориентаций частиц относительно направления электронного пучка; (4) образец сохраняет нативную структуру, и некоторые, но не все возможные ориентации частиц относительно направления электронного пучка представлены на изображениях. Для случаев (3) и (4) наклонный сбор данных поможет свести к минимуму анизотропию направленного разрешения, влияющую на реконструированную крио-ЭМ-карту, и обеспечит обобщаемое решение для широкого спектра образцов⁹. С технической точки зрения, наклон также может принести пользу в случае (2), поскольку денатурация, по-видимому, происходит на границе раздела воздух-вода и аналогичным образом ограничивает количество различных ориентаций, представленных в данных. Степень смещения ориентации в наборе данных потенциально может быть изменена путем экспериментов с добавками раствора, но отсутствие широкой применимости препятствует этим подходам методом проб и ошибок. Наклон столика образца на один оптимизированный угол наклона достаточен для улучшения распределения ориентаций за счет изменения геометрии эксперимента⁹ (рис. 1). Из-за геометрической конфигурации предпочтительно ориентированного образца по отношению к электронному пучку для каждого кластера преимущественных ориентаций наклон сетки создает конус углов освещения по отношению к центроиду кластера. Следовательно, это расширяет представления и, следовательно, улучшает дискретизацию пространства Фурье и изотропию направленного разрешения.

На практике есть некоторые недостатки в наклоне сцены. Наклон предметного столика образца приводит к градиенту фокусировки по всему полю зрения, что может повлиять на точность оценки функции переноса контраста (CTF). Сбор данных под наклоном также может привести к увеличению движения частиц, вызванного пучком, вызванным усилением эффектов зарядки при визуализации наклонных образцов. Наклон сетки также приводит к увеличению кажущейся толщины льда, что, в свою очередь, приводит к более шумным микрофотографиям и может в конечном итоге повлиять на разрешение реконструкций 5,9,10. Эти проблемы можно преодолеть, применяя передовые схемы обработки вычислительных данных, которые кратко описаны в разделах, посвященных протоколу и обсуждению. Наконец, наклон может привести к увеличению перекрытия частиц, что затруднит последующую обработку изображений. Хотя это можно в некоторой степени смягчить, оптимизировав концентрацию частиц на сетке, это, тем не менее, важное соображение. Здесь описан простой в реализации протокол для наклонного сбора данных с использованием программного пакета Leginon (программное обеспечение для автоматического получения изображений), доступного в открытом доступе и совместимого с широким спектром микроскопов^11,12,13,14. Для этого метода требуется как минимум версия 3.0 или выше, а версии 3.3 и более поздние версии содержат специальные улучшения для включения наклонного сбора данных. Для этого протокола не требуется никакого дополнительного программного обеспечения или оборудования. Подробные инструкции по вычислительной инфраструктуре и руководства по установке приведены в других разделах¹⁵.