Coleta de dados crio-EM de partícula única com inclinação do estágio usando Leginon

O advento dos detectores diretos de elétrons na última década ^1,2,3 estimulou um aumento exponencial no número de estruturas de alta resolução de macromoléculas e montagens macromoleculares resolvidas usando crio-EM de partícula única 4,5,6. Espera-se que quase todas as espécies macromoleculares purificadas sejam passíveis de determinação de estrutura usando crio-EM, exceto para as menores proteínas ~10 kDa em tamanho ou abaixo de⁷. A quantidade de material de partida necessária para a preparação da grade e determinação da estrutura é pelo menos uma ordem de grandeza menor do que outras técnicas de determinação de estrutura, como espectroscopia de ressonância magnética nuclear e cristalografia de raios X ^4,5,6.

No entanto, um dos principais desafios para a determinação de estruturas por crio-EM envolve a preparação adequada da grade para obtenção de imagens. Um extenso estudo avaliando diversas amostras usando diferentes estratégias e grades de vitrificação sugeriu que a maioria das abordagens para vitrificação de amostras em grades crio-EM leva à aderência preferencial de macromoléculas à interface ar-água⁸. Essa adesão pode potencialmente causar quatro desfechos subótimos: (1) a amostra macromolecular desnatura completamente, caso em que nenhuma coleta e processamento de dados bem-sucedidos é possível; (2) a amostra desnatura parcialmente, caso em que pode ser possível obter insights estruturais de regiões da macromolécula que não estão danificadas; (3) a amostra mantém a estrutura nativa, mas apenas um conjunto de orientações de partículas relativas à direção do feixe de elétrons é representado nas imagens; (4) a amostra mantém a estrutura nativa, e algumas, mas não todas as possíveis orientações de partículas relativas à direção do feixe de elétrons são representadas nas imagens. Para os casos (3) e (4), a coleta de dados inclinada ajudará a minimizar a anisotropia de resolução direcional que afeta o mapa crio-EM reconstruído e fornecerá uma solução generalizável para uma ampla variedade de amostras⁹. Tecnicamente, a inclinação também pode beneficiar o caso (2), uma vez que a desnaturação presumivelmente ocorre na interface ar-água e da mesma forma limita o número de orientações distintas representadas nos dados. A extensão do viés de orientação no conjunto de dados pode ser potencialmente alterada pela experimentação de aditivos de solução, mas a falta de ampla aplicabilidade dificulta essas abordagens de tentativa e erro. A inclinação do estágio do espécime em um único ângulo de inclinação otimizado é suficiente para melhorar a distribuição das orientações em virtude da alteração da geometria do experimento de imagem⁹ (Figura 1). Devido à configuração geométrica da amostra preferencialmente orientada em relação ao feixe de elétrons, para cada aglomerado de orientações preferenciais, a inclinação da grade gera um cone de ângulos de iluminação em relação ao centroide do aglomerado. Assim, isso espalha as vistas e, consequentemente, melhora a amostragem do espaço de Fourier e a isotropia da resolução direcional.

Há, na prática, alguns prejuízos para inclinar o palco. A inclinação do estágio da amostra introduz um gradiente de foco em todo o campo de visão, o que pode afetar a precisão das estimativas da função de transferência de contraste (CTF). A coleta de dados inclinada também pode levar ao aumento do movimento de partículas induzido pelo feixe causado pelo aumento dos efeitos de carga ao obter imagens de amostras inclinadas. A inclinação da grade também leva a um aumento na espessura aparente do gelo, o que, por sua vez, leva a micrografias mais ruidosas e pode, em última instância, afetar a resolução das reconstruções 5,9,10. Talvez seja possível superar essas questões aplicando esquemas computacionais avançados de processamento de dados que são brevemente descritos nas seções de protocolo e discussão. Por fim, a inclinação pode levar ao aumento da sobreposição de partículas, dificultando o pipeline de processamento de imagens subsequente. Embora isso possa ser mitigado até certo ponto otimizando a concentração de partículas na rede, não deixa de ser uma consideração importante. Descreve-se aqui um protocolo de simples implementação para coleta de dados inclinados utilizando a suíte de software Leginon (software de aquisição automatizada de imagens), disponível em acesso aberto e compatível com uma ampla gama de microscópios^11,12,13,14. O método requer pelo menos a versão 3.0 ou superior, com as versões 3.3 em diante contendo melhorias dedicadas para permitir a coleta de dados inclinados. Nenhum software ou equipamento adicional é necessário para este protocolo. Instruções extensas sobre infraestrutura computacional e guias de instalação são fornecidas em outro lugar¹⁵.