レギノンを用いたステージチルトを用いた単粒子クライオ電子顕微鏡データ収集

過去10年間の直接電子検出器^の出現1,2,3は、単一粒子クライオEM4,5,6を使用して解決された高分子および高分子集合体の高分解能構造の数が指数関数的に増加しました。ほとんどすべての精製高分子種は、サイズが~10 kDa^{以下の最小}のタンパク質を除いて、クライオEMを使用した構造決定に適していると予想されます。グリッド調製および構造決定に必要な出発物質の量は、核磁気共鳴分光法およびX線結晶構造解析などの他の構造決定技術よりも少なくとも桁違いに少ない^4,5,6。

しかし、クライオEMによる構造決定の主な課題は、イメージングに適したグリッド調製です。さまざまなガラス化戦略とグリッドを使用して多様なサンプルを評価する広範な研究では、クライオEMグリッド上のサンプルをガラス化するためのほとんどのアプローチが、空気-水界面への高分子の優先接着につながることが示唆されました⁸。このような遵守は、潜在的に4つの最適ではない結果を引き起こす可能性があります:(1)高分子サンプルは完全に変性し、その場合、データ収集と処理を成功させることはできません。(2)サンプルが部分的に変性し、その場合、損傷を受けていない高分子の領域から構造的洞察を得ることができる可能性があります。(3)サンプルはネイティブ構造を保持していますが、電子ビームの方向に対する粒子の向きは1セットのみで画像に表されています。(4)サンプルはネイティブ構造を保持しており、電子ビームの方向に対する可能な粒子の向きがすべてではないが一部が画像に表されています。ケース(3)および(4)の場合、傾斜データ収集は、再構築されたクライオEMマップに影響を与える方向分解能異方性を最小限に抑えるのに役立ち、さまざまなサンプルに対して一般化可能なソリューションを提供します⁹。技術的には、変性はおそらく空気と水の界面で発生し、同様にデータ内で表される異なる方向の数を制限するため、傾斜はケース(2)にも利益をもたらす可能性があります。データセットの配向バイアスの程度は、溶液添加剤を試すことで変更できる可能性がありますが、幅広い適用性の欠如は、これらの試行錯誤のアプローチを妨げます。単一の最適化された傾斜角度で試料ステージを傾けることは、イメージング実験⁹ の形状を変更することにより、向きの分布を改善するのに十分である(図1)。電子線に対する優先配向試料の幾何学的構成に起因して、優先配向の各クラスターについて、グリッドを傾けると、クラスター重心に対する照明角度の円錐を生成する。したがって、これによりビューが広がり、その結果、フーリエ空間サンプリングと方向分解能の等方性が向上します。

実際には、ステージを傾けることにはいくつかの欠点があります。試料ステージを傾けると、視野全体に焦点勾配が導入され、コントラスト伝達関数(CTF)推定の精度に影響を与える可能性があります。傾斜したデータ収集は、傾斜した試料をイメージングする際の帯電効果の増加によって引き起こされるビーム誘起粒子の動きの増加にもつながる可能性があります。グリッドの傾きはまた、見かけの氷の厚さの増加につながり、それが今度はよりノイズの多い顕微鏡写真につながり、最終的には再構成の解像度に影響を与える可能性があります^5、9、10。プロトコルとディスカッションのセクションで簡単に説明されている高度な計算データ処理スキームを適用することで、これらの問題を克服できる場合があります。最後に、傾けると粒子のオーバーラップが増加し、その後の画像処理パイプラインが妨げられる可能性があります。これは、グリッド上の粒子濃度を最適化することである程度軽減できますが、それでも重要な考慮事項です。ここでは、Leginonソフトウェアスイート(自動画像取得ソフトウェア)を使用した傾斜データ収集のための実装が簡単なプロトコルが説明され、オープンアクセスが利用可能で、広範囲の顕微鏡と互換性がある¹¹、^12、13、14。この方法には少なくともバージョン3.0以降が必要であり、バージョン3.3以降には、傾斜したデータ収集を可能にするための専用の改善が含まれています。このプロトコルには、追加のソフトウェアや機器は必要ありません。計算インフラストラクチャとインストールガイドに関する広範な手順は、他の場所で提供されています¹⁵。