Collecte de données cryo-EM à particule unique avec inclinaison de scène à l’aide de Leginon

L’avènement des détecteurs d’électrons directs au cours de la dernière décennie ^1,2,3 a entraîné une augmentation exponentielle du nombre de structures à haute résolution de macromolécules et d’assemblages macromoléculaires résolus à l’aide de cryo-EM 4,5,6 à particule unique. Presque toutes les espèces macromoléculaires purifiées devraient pouvoir être déterminées par cryo-EM, à l’exception des plus petites protéines ~10 kDa de taille ou inférieure à⁷. La quantité de matière de départ nécessaire pour la préparation de la grille et la détermination de la structure est inférieure d’au moins un ordre de grandeur à celle d’autres techniques de détermination de structure, telles que la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire et la cristallographie aux rayons X ^4,5,6.

Cependant, l’un des principaux défis pour la détermination de la structure par cryo-EM implique une préparation de grille appropriée pour l’imagerie. Une étude approfondie évaluant divers échantillons à l’aide de différentes stratégies et grilles de vitrification a suggéré que la plupart des approches de vitrification d’échantillons sur des grilles cryo-EM conduisent à une adhésion préférentielle des macromolécules à l’interface air-eau⁸. Une telle observance peut potentiellement entraîner quatre résultats sous-optimaux : (1) l’échantillon macromoléculaire se dénature complètement, auquel cas aucune collecte et traitement de données réussis n’est possible ; (2) l’échantillon se dénature partiellement, auquel cas il peut être possible d’obtenir des informations structurelles à partir de régions de la macromolécule qui ne sont pas endommagées; (3) l’échantillon conserve sa structure native, mais un seul ensemble d’orientations de particules par rapport à la direction du faisceau d’électrons est représenté dans les images; (4) L’échantillon conserve sa structure native, et certaines orientations possibles des particules par rapport à la direction du faisceau d’électrons sont représentées dans les images. Pour les cas (3) et (4), la collecte de données inclinée aidera à minimiser l’anisotropie de résolution directionnelle affectant la carte cryo-EM reconstruite et fournira une solution généralisable pour une grande variété d’échantillons⁹. Techniquement, l’inclinaison peut également bénéficier au cas (2), puisque la dénaturation se produit vraisemblablement à l’interface air-eau et limite de la même manière le nombre d’orientations distinctes représentées dans les données. L’étendue du biais d’orientation dans l’ensemble de données peut potentiellement être modifiée en expérimentant avec des additifs de solution, mais un manque d’applicabilité générale entrave ces approches par essais et erreurs. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon à un seul angle d’inclinaison optimisé est suffisant pour améliorer la distribution des orientations en modifiant la géométrie de l’expérience d’imagerie⁹ (Figure 1). En raison de la configuration géométrique de l’échantillon préférentiellement orienté par rapport au faisceau d’électrons, pour chaque groupe d’orientations préférentielles, l’inclinaison de la grille génère un cône d’angles d’éclairage par rapport au centroïde de l’amas. Par conséquent, cela répartit les vues et améliore par conséquent l’échantillonnage de l’espace de Fourier et l’isotropie de la résolution directionnelle.

Il y a, dans la pratique, certains inconvénients à incliner la scène. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon introduit un dégradé de mise au point dans le champ de vision, ce qui peut affecter la précision des estimations de la fonction de transfert de contraste (CTF). La collecte de données inclinée peut également entraîner une augmentation du mouvement des particules induit par le faisceau causée par des effets de charge accrus lors de l’imagerie d’échantillons inclinés. L’inclinaison de la grille entraîne également une augmentation de l’épaisseur apparente de la glace, ce qui entraîne des micrographies plus bruyantes et peut finalement avoir un impact sur la résolution des reconstructions 5,9,10. Il peut être possible de surmonter ces problèmes en appliquant des schémas de traitement informatique avancés qui sont brièvement décrits dans les sections protocole et discussion. Enfin, l’inclinaison peut entraîner une augmentation du chevauchement des particules, ce qui entrave le pipeline de traitement d’image ultérieur. Bien que cela puisse être atténué dans une certaine mesure en optimisant la concentration de particules sur le réseau, il s’agit néanmoins d’une considération importante. Ici, un protocole simple à mettre en œuvre est décrit pour la collecte de données inclinées à l’aide de la suite logicielle Leginon (un logiciel d’acquisition d’images automatisé), disponible en libre accès et compatible avec une large gamme de microscopes^11,12,13,14. La méthode nécessite au moins la version 3.0 ou supérieure, avec les versions 3.3 et ultérieures contenant des améliorations dédiées pour permettre la collecte de données inclinée. Aucun logiciel ou équipement supplémentaire n’est nécessaire pour ce protocole. Des instructions détaillées sur l’infrastructure informatique et des guides d’installation sont fournis ailleurs¹⁵.