جمع بيانات Cryo-EM أحادية الجسيمات مع إمالة المرحلة باستخدام Leginon

أدى ظهور كاشفات الإلكترون المباشرة على مدار العقد الماضي¹،²،³ إلى زيادة هائلة في عدد الهياكل عالية الدقة للجزيئات الكبيرة والتجمعات الجزيئية الكبيرة التي تم حلها باستخدام cryo-EM أحادي الجسيم⁴،^5،6. من المتوقع أن تكون جميع الأنواع الجزيئية المنقاة تقريبا قابلة لتحديد الهيكل باستخدام cryo-EM ، باستثناء أصغر البروتينات ~ 10 كيلو دالتون في الحجم أو أقل من⁷. كمية المواد الأولية اللازمة لإعداد الشبكة وتحديد الهيكل هي على الأقل ترتيب من حيث الحجم أقل من تقنيات تحديد البنية الأخرى ، مثل التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات بالأشعة السينية^4،5،6.

ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي لتحديد الهيكل بواسطة cryo-EM ينطوي على إعداد شبكة مناسبة للتصوير. اقترحت دراسة مستفيضة لتقييم عينات متنوعة باستخدام استراتيجيات وشبكات تزجيج مختلفة أن معظم طرق تزجيج العينات على شبكات cryo-EM تؤدي إلى الالتزام التفضيلي للجزيئات الكبيرة بواجهة الهواء والماء⁸. ويمكن أن يتسبب هذا الالتزام في أربع نتائج دون المستوى الأمثل: (1) أن العينة الجزيئية الكبيرة تتشوه تماما، وفي هذه الحالة لا يمكن جمع البيانات ومعالجتها بنجاح؛ و (2) أن العينة الجزيئية الكبيرة تتشوه تماما، وفي هذه الحالة لا يمكن جمع البيانات ومعالجتها بنجاح؛ و (2) لا يمكن جمع البيانات ومعالجتها بنجاح. (2) تتشوه العينة جزئيا ، وفي هذه الحالة قد يكون من الممكن الحصول على رؤى هيكلية من مناطق الجزيء الكبيرة غير التالفة ؛ (3) تحتفظ العينة بالبنية الأصلية ، ولكن يتم تمثيل مجموعة واحدة فقط من اتجاهات الجسيمات بالنسبة لاتجاه حزمة الإلكترون في الصور ؛ (4) تحتفظ العينة بالبنية الأصلية ، ويتم تمثيل بعض وليس كل اتجاهات الجسيمات الممكنة بالنسبة لاتجاه حزمة الإلكترون في الصور. بالنسبة للحالتين (3) و (4) ، سيساعد جمع البيانات المائل في تقليل تباين الخواص في دقة الاتجاه الذي يؤثر على خريطة cryo-EM المعاد بناؤها ويوفر حلا قابلا للتعميم لمجموعة متنوعة من العينات⁹. من الناحية الفنية ، يمكن أن يفيد الإمالة أيضا الحالة (2) ، حيث يفترض أن يحدث التمسخ عند السطح البيني بين الهواء والماء ويحد بالمثل من عدد الاتجاهات المميزة الممثلة في البيانات. يمكن تغيير مدى تحيز التوجه في مجموعة البيانات من خلال تجربة إضافات الحلول ، لكن الافتقار إلى قابلية التطبيق الواسعة يعيق مناهج التجربة والخطأ هذه. يكفي إمالة مرحلة العينة بزاوية إمالة محسنة واحدة لتحسين توزيع الاتجاهات بحكم تغيير هندسة تجربة التصوير⁹ (الشكل 1). نظرا للتكوين الهندسي للعينة ذات التوجه التفضيلي فيما يتعلق بحزمة الإلكترون ، لكل مجموعة من الاتجاهات التفضيلية ، فإن إمالة الشبكة تولد مخروطا من زوايا الإضاءة فيما يتعلق بالسنترويد العنقودي. ومن ثم ، فإن هذا ينشر وجهات النظر وبالتالي يحسن أخذ عينات فضاء فورييه والخواص الخواص في دقة الاتجاه.

هناك ، في الممارسة العملية ، بعض الأضرار لإمالة المسرح. يؤدي إمالة مرحلة العينة إلى إدخال تدرج تركيز عبر مجال الرؤية ، مما قد يؤثر على دقة تقديرات وظيفة نقل التباين (CTF). قد يؤدي جمع البيانات المائل أيضا إلى زيادة حركة الجسيمات التي يسببها الحزمة بسبب زيادة تأثيرات الشحن عند تصوير العينات المائلة. يؤدي إمالة الشبكة أيضا إلى زيادة سمك الجليد الظاهري ، مما يؤدي بدوره إلى صور مجهرية أكثر ضوضاء وقد يؤثر في النهاية على دقة عمليات إعادة البناء⁵،^9،10. وقد يكون من الممكن التغلب على هذه المسائل بتطبيق مخططات متقدمة لمعالجة البيانات الحاسوبية يرد وصفها بإيجاز في قسمي البروتوكول والمناقشة. أخيرا ، يمكن أن يؤدي الإمالة إلى زيادة تداخل الجسيمات ، مما يعيق خط أنابيب معالجة الصور اللاحق. على الرغم من أنه يمكن التخفيف من ذلك إلى حد ما عن طريق تحسين تركيز الجسيمات على الشبكة ، إلا أنه مع ذلك اعتبار مهم. هنا ، يتم وصف بروتوكول سهل التنفيذ لجمع البيانات المائلة باستخدام مجموعة برامج Leginon (برنامج آلي للحصول على الصور) ، متاح للوصول المفتوح ومتوافق مع مجموعة واسعة من المجاهر¹¹،¹²،^13،14. تتطلب الطريقة الإصدار 3.0 على الأقل أو أعلى ، مع الإصدارات 3.3 وما بعده التي تحتوي على تحسينات مخصصة لتمكين جمع البيانات المائلة. لا توجد برامج أو معدات إضافية ضرورية لهذا البروتوكول. يتم توفير تعليمات شاملة حول البنية التحتية الحاسوبية وأدلة التثبيت في مكان آخر¹⁵.