Obtención de imágenes de células B CD19⁺ en un modelo experimental de ratón con encefalomielitis autoinmune mediante tomografía por emisión de positrones

Figura 1: Diseño del estudio. En este artículo se ofrece una descripción general de las técnicas clave. (A) Colocar a los ratones en la cama de escaneo boca arriba reduce el movimiento de la columna vertebral. (B) Imágenes PET/CT de los ratones. (C) Haga una incisión en el lado dorsal del animal para exponer la columna vertebral. (D) Dividir la columna vertebral en porciones cervicales/torácicas y lumbares y eliminar las secciones siguiendo los cinco cortes indicados. (E) Use una jeringa para extraer la médula espinal de la columna vertebral haciendo un sello con la jeringa y la columna vertebral y enjuagando los extremos craneal y caudal de la columna vertebral como se muestra. (F) Segmentos aislados de la médula espinal cervical/torácica y lumbar. Abreviatura: PET/CT = Tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Todos los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Panel Administrativo sobre el Cuidado de Animales de Laboratorio (APLAC) de la Universidad de Stanford, un programa acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC International). Los ratones se aclimataron al vivero durante al menos 7 días antes del inicio del estudio para minimizar el estrés en los ratones, ya que el estrés puede afectar a la inducción de EAE. 1. Inducción de EAE en ratones hembra humanizados CD19 Inducir ratones hembra CD19 C57BL/6J humanizados de 9 a 13 semanas de edad con EAE como se ha descritoanteriormente 5 utilizando MOG1-125. 2. Cuidado y puntuación de los animales en el modelo de ratón de EAE Puntúe la progresión de la enfermedad y el cuidado de los ratones como se describió anteriormente5. En resumen, puntúe este modelo en una escala del 1 al 5 de la siguiente manera: 1 es debilidad/flacidez de la cola, 2 es debilitamiento de las extremidades posteriores, 3 es parálisis de las extremidades posteriores, 4 es parálisis de las extremidades posteriores con debilidad de las extremidades anteriores, 5 es moribundo. 3. Conjugación, radiomarcaje y caracterización de anticuerpos monoclonales Conjugar el éster bifuncional quelante 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético éster mono-N-hidroxisuccinimida (DOTA-NHS-éster) a hCD19-mAb para radiomarcarlo con 64Cu.Utilizando una columna de desalinización, cambie el tampón de almacenamiento de hCD19-mAb por el tampón HEPES (pH 8,5-9): acondicione la(s) columna(s) de desalinización con HEPES. Calcule el número de columnas necesarias en función de la capacidad del volumen de muestra de la columna de desalinización y el volumen de mAb requerido: tubos de 0,5 ml: 30-130 μl de volumen de muestra, 300 μl de lavado; Tubos de 2 ml: volumen de muestra de 200-700 μl, lavado de 1 ml. Enfríe la centrífuga a 4 °C para el intercambio de tampón a través de la columna de desalinización. Recupere la columna de desalinización de la nevera. Retire la parte inferior de la columna de desalinización, afloje la tapa y coloque la columna en un tubo de recolección. Centrifugar a 1.500 × g durante 2 min para eliminar la solución de almacenamiento; Deseche el flujo continuo que contiene la solución de almacenamiento y reutilice el tubo de recolección. Marque una línea en la columna donde el punto más alto de la resina compactada desalinizada esté inclinado hacia arriba. Agregue el búfer HEPES a la parte inferior de la columna de desalinización. Coloque la columna de desalinización en la centrífuga con la línea hacia afuera; Centrifugar a 1.500 × g durante 2 min. Deseche el flujo y reutilice el tubo de recolección. Repita los pasos 3.1.4 y 3.1.5 2 veces usando el mismo tubo de recolección y descartando el flujo entre pasos. Coloque la columna de desalinización acondicionada en un nuevo tubo de recolección y etiquete; este tubo contendrá el hCD19-mAb. Agregue hCD19-mAb en la parte superior de la(s) columna(s) de desalinización acondicionada y use tampón HEPES para enjuagar el vial de mAb vacío; Agregue esto a la parte superior de la columna de desalinización (volumen total según la recomendación del fabricante). Centrifugar a 1.500 × g durante 2 min para eluir el hCD19-mAb. Mantenga el flujo que contiene el hCD19-mAb. Mida la concentración de hCD19-mAb con un espectrofotómetro UV/Vis y ajústela a 0,5 μg/μL con tampón HEPES si es necesario. A la solución de hCD19-mAb, añadir 1/50del volumen de la solución de mAb de 0,5 M de EDTA para que la concentración final de EDTA sea de 0,01 M en la solución de hCD19-mAb. Deje reposar la solución de hCD19-mAb-EDTA a temperatura ambiente durante 15 min. Retire el éster DOTA-NHS del congelador y deje que alcance la temperatura ambiente (10-15 min). Calcule el volumen de DMSO que se agregará al éster de DOTA-NHS para obtener una concentración de DOTA que permita la adición de la relación molar DOTA/mAb deseada (que suele ser del orden de 1-2 DOTA/mAb).NOTA: El volumen de éster DMSO-DOTA-NHS añadido a los anticuerpos monoclonales de hCD19 no debe exceder el 10% del volumen de anticuerpos monoclonales. Esto debe hacerse usando una hoja de cálculo para que se pueda hacer de manera rápida y repetida. Con base en la proporción deseada de DOTA a hCD19-mAb, calcule la cantidad de DOTA-NHS-éster para agregar a hCD19-mAb.nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg de DOTA → mg/mL DOTA/DMSO → mL de DMSO → factor de dilución de la solución de DOTA/DMSO Pesar 1-2 mg del éster DOTA-NHS, y añadir con cuidado el volumen correcto (calculado en el paso 3.1.11) de DMSO al éster DOTA-NHS; Mezclar y girar. Pipetear el volumen calculado de la solución DOTA-NHS-éster (paso 3.1.12) en la solución de hCD19-mAb; limpie el exterior de la punta de la pipeta antes de agregarla para asegurarse de que no se agregue DOTA-NHS-ester adicional (sin cambiar la cantidad en la pipeta). Mezcle suavemente y gire. Introducir en la nevera (4 °C) para que reaccione durante la noche (12-16 h). Purificación y concentraciónEnfríe la centrífuga a 4 °C para los pasos de intercambio de tampón del concentrador centrífugo; coloque un bloque de tubo de PCR de metal sobre hielo seco para congelar rápidamente el conjugado. Retire la reacción DOTA-hCD19-mAb del refrigerador y enfríe agregando tampón TRIS de grado biológico: 10% del volumen total de la reacción. Extraer 10-20 μg de la muestra para el análisis por espectrometría de masas. Acondicione la(s) columna(s) de desalinización como se ha descrito anteriormente (pasos 3.1.1-3.1.5), utilizando tampón de acetato de amonio 0,1 M, pH 5,5. Intercambio tampón de la solución de DOTA-hCD19-mAb por acetato de amonio (pasos 3.1.1-3.1.8). Concentrar la solución DOTA-hCD19-mAb: añadir la solución a un concentrador centrífugo de corte de peso molecular de 50 kDa siguiendo las recomendaciones del fabricante sobre el volumen. Centrifugar a 4.000 × g durante 10 min (o hasta que el volumen se reduzca en un 80%-90%); Deseche el flujo. Repita nueve veces más (10 en total): agregue suficiente acetato de amonio para devolver el volumen al volumen máximo recomendado.NOTA: El total debe ser lo que se agregó inicialmente, incluyendo lo que queda en la columna, generalmente 400-450 μL para un concentrador centrífugo de 500 μL de capacidad.Enjuague el vial de reacción con tampón de acetato de amonio para recuperar cualquier residuo de DOTA-hCD19-mAb; Agregue el lavado al concentrador centrífugo. Centrifugar a 4.000 × g durante 10 min.NOTA: El tiempo de centrifugado puede reducirse en giros posteriores si el volumen se reduce al 80%-90% en menos tiempo. Retire la solución proteica del concentrador centrífugo. Obsérvese el volumen total del DOTA-hCD19-mAb.En el concentrador centrífugo 2, añadir suficiente tampón de acetato de amonio para un volumen total de 100 μL y pipetear para mezclar. Tapar la columna concentradora centrífuga e invertirla. Girar a 4.000 × g durante 2 min para recoger la solución. Transfiera a un tubo nuevo. En el concentrador centrífugo 500, utilice una pipeta para recoger la solución de anticuerpos monoclonales del concentrador centrífugo; Añádelo a un tubo nuevo. Mida la concentración con un espectrofotómetro UV-Vis. Si la concentración es superior a 2 mg/ml, diluir con acetato de amonio hasta 2 mg/ml. Alícuota 100 μg por tubo de PCR (aproximadamente 50 μL); etiquete los tubos con DOTA-hCD19-mAb, fecha, masa y concentración. Gire hacia abajo los viales. Congele a presión el DOTA-hCD19-mAb en el bloque de PCR refrigerado en hielo seco (o congele en hielo seco). Una vez congeladas todas las muestras, colóquelas en un congelador a -80 °C. Mida el número de DOTA por hCD19-mAb mediante espectrometría de masas. Mantenga una muestra de anticuerpo no conjugado (puro) de cada conjugación para calcular la proporción. Utilice la ecuación (1) que se indica a continuación; el peso molecular se abrevia MW.(1) RadiomarcajeNOTA: Use el equipo de protección personal (EPP) adecuado para el manejo de la radiactividad, incluyendo una bata de laboratorio, guantes y un dosímetro corporal y de anillo personal, siguiendo las regulaciones institucionales. Inspeccione y cambie los guantes con regularidad para evitar la contaminación radiactiva. Use blindaje de plomo y aumente la distancia de la fuente radiactiva manipulándola con pinzas cuando sea posible.Transfiera la radiactividad del vial de envío a un vial nuevo con una pipeta. Mide la radiactividad. Retire una alícuota para la primera reacción de radiomarcado. Añadir 50 μL de acetato de amonio (pH 5,5) por 1 mCi de 64Cu-CuCl3. Mida el pH pipeteando 1 μL en una tira de pH con un rango que capture 5,5 con suficiente resolución para distinguir entre 5 y 6. Si el pH no es de 4-5,5, modifíquelo usando 1 M de NaOH o 0,1 M de HCl. Agregue pequeñas cantidades, 1-5 μL, de 1 M de NaOH si el pH es inferior a 4 o 0,1 M de HCl si el pH es superior a 5,5 hasta alcanzar el pH correcto. Con cada adición, mezcle bien, gire hacia abajo y mida el pH como se describió anteriormente. Anote cada adición y eliminación de cualquier solución (incluso para verificar el pH) para que se pueda calcular el volumen final. Una vez alcanzado el pH óptimo, añadir 10 μg de DOTA-hCD19-mAb por 1 mCi de 64Cu-CuCl3. Mezcle suavemente y gire hacia abajo brevemente. Coloque el vial de reacción en una batidora termomezcladora ajustada a 37 °C y 400 revoluciones por minuto (rpm). Después de 30 minutos, apague la reacción: divida el volumen total de reacción por 50 y agregue ese volumen de 0,5 M de EDTA a la mezcla de reacción. Determine la eficiencia del etiquetado mediante cromatografía instantánea en capa fina (ITLC) para medir el porcentaje de cobre unido y libre en la solución.Corta tiras de papel TLC de 1 cm de ancho. Marque a 1 cm de la parte superior e inferior de la tira y prepare un tubo (matraz cónico de 50 ml) con fase móvil inferior a 1 cm de ácido cítrico 0,1 M (el nivel de fase móvil debe estar por debajo de la marca de 1 cm en la tira cuando se coloca en el tubo). Pipetear 1 μL de la solución de reacción en la tira en la marca inferior de 1 cm (frente del disolvente) y colocar la tira en el tubo. Observe hasta que el frente del solvente alcance la marca superior de 1 cm, retire la tira y envuélvala en un trozo de envoltura de plástico. Coloque la tira en la plataforma y pásela por un escáner de imágenes de radio-TLC. Busque el mAb radiomarcado en el origen y el 64Cu libre que viaja con el frente de fase móvil (Figura 2). Si el porcentaje de cobre libre es inferior al 5% (95% de eficiencia de etiquetado), se procederá a la inyección en animales. Si el porcentaje de cobre libre es superior al 5%, proceda a la purificación.NOTA: El porcentaje de cobre libre generalmente depende de la proporción de DOTA-mAb a 64Cu, el tiempo de reacción, el pH y la temperatura. Las condiciones de reacción deben ser optimizadas por cada usuario para cada nuevo mAb para garantizar resultados consistentes. Purificación a través de una columna de gravedad desechable de grado de ADNAcondicione una columna de flujo por gravedad desechable de grado ADN (columna de desalinización/intercambio de tampón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Coloque la columna de gravedad desechable de grado de ADN en un soporte de anillo u otro instrumento detrás de un blindaje de plomo adecuado; Asegúrese de que el aparato sea estable y fácil de mover. Coloque el tubo debajo de la columna. Pipetear la mezcla cruda de reacción sobre la resina de la columna de flujo por gravedad. Espera hasta que todo el líquido haya fluido hacia la resina. Pipetear suficiente PBS para llevar todo el volumen (producto crudo más PBS) a 500 μL. Deseche el flujo. Coloque la columna sobre tubos de centrífuga de 1,5 ml etiquetados como 1-10. Agregue 1 ml de PBS a la columna. Recoja cinco gotas en cada tubo hasta que el flujo se haya detenido.NOTA: Es posible que se requieran menos de 10 tubos. Tapa la parte inferior de la columna y mide la radiactividad residual. Mida cada vial con flujo. Para cada vial con más de 50 μCi, prepare un ITLC según el paso 3.3.7 para medir el porcentaje de cobre unido en cada fracción.NOTA: La primera o dos fracciones contendrán solo la fase móvil; el AcM radiomarcado se eluirá primero (generalmente las fracciones 2 o 3 a 5 o 6) y el 64Cu libre se eluirá al final (algunos se pegarán a la columna). El porcentaje ligado a 64Cu puede variar entre fracciones. Combinar las fracciones con más del 95% de unión (menos del 5% de cobre libre); Utilice la solución inyectable. Si lo desea, realice una HPLC de exclusión por tamaño para confirmar el radiomarcaje5 y calcular la actividad molar. Guarde una alícuota para medir la concentración en un espectrofotómetro UV-Vis después de que haya decaído 10 vidas medias (127 h o 5,3 días). 4. Preparación de la dosis NOTA: Antes de manipular la dosis, use el EPP adecuado, incluida la bata de laboratorio, los dosímetros corporales y de dedos, y los guantes. Inyectar 64Cu-DOTA-hCD19-mAb 18-24 h antes de la tomografía por emisión de positrones, para permitir una circulación adecuada de la radiosonda en el organismo. Coloque inmediatamente el recipiente de plomo con el 64Cu-DOTA-hCD19-mAb detrás del blindaje de plomo. Encienda el contador Geiger para controlar la posible contaminación.NOTA: Cámbiese los guantes con frecuencia cuando manipule material radiactivo. Se recomienda el uso de doble guante durante la extracción de dosis para facilitar los cambios rápidos de guante. Siempre coloque los objetos punzocortantes y la basura contaminados en el área de basura protegida designada. Diluir el 64Cu-DOTA-hCD19-mAb a una concentración adecuada en un tubo de centrífuga de plástico de 1,5 ml de baja fijación.NOTA: El 64Cu-DOTA-hCD19-mAb se unirá al plástico si no es de baja adhesión; 64El Cu se unirá al vidrio.Diluya la radiosonda en solución salina para evitar la radiólisis y simplificar la extracción de dosis consistentes. Preparar dosis para administrar entre 75 y 150 μCi en 100 μL, si es posible. Asegúrese de que el volumen total máximo inyectado no supere el 10% del peso corporal del ratón. Use una jeringa de insulina de 500 μl (50 cc) para extraer la dosis del tubo de plástico de baja fijación. Asegúrese de que no haya burbujas en la jeringa, ya que se inyectará por vía intravenosa.Etiquete previamente las jeringas con los números de animales correspondientes. Registre la actividad y el tiempo de la dosis en un cuaderno de laboratorio para el análisis de datos. Tenga las dosis listas para la inyección tan pronto como los animales sean cateterizados para reducir el tiempo bajo anestesia. Una vez preparadas las dosis, prepare un patrón (maniquí) para escanear con el fin de generar un factor de calibración.Llene un tubo cónico de 15 ml con 50-75 μCi de actividad diluida en agua (o PBS).NOTA: Asegúrese de mezclar bien la solución. El estándar puede ser libre de 64Cu sobrantes del etiquetado.Mide la cantidad de actividad en el estándar y registra el tiempo. 5. Canulación e inyección NOTA: Véanse los métodos6 descritos anteriormente para la canulación intravenosa de ratones para la inyección de la radiosonda6. Pesar y puntuar a los ratones en función de la gravedad de la enfermedad, tal y como se describe en la sección 2.1, antes de anestesiar a los ratones en una caja desmontable llena de isoflurano al 1,5-3% en preparación para la administración de radiosondas.NOTA: Estos ratones se inyectarán en la mesa de trabajo, no en el escáner PET como se describió anteriormente. No es necesario pegar los catéteres en su lugar para la inyección, ya que los ratones no se moverán entre la canulación y la inyección. Una vez que se haya canulado un ratón, inserte la aguja en el extremo del catéter e inyecte lentamente. Después de la inyección, siga con un pequeño lavado de solución salina a través del catéter para asegurarse de que se inyecte toda la dosis.NOTA: El volumen debe ser aproximadamente igual al volumen muerto del catéter, que es de 50 μL para los catéteres utilizados por los autores.Inyecte sobre un pedazo de toallita de laboratorio para recoger cualquier gota de radiosonda; Inclúyalo cuando mida la dosis residual. Registre la hora de la inyección en un cuaderno de laboratorio. Retire la cánula inmediatamente después de la inyección. Mida la cánula, la jeringa de dosis y el tejido con un calibrador de dosis para determinar la dosis residual que no se inyectó en el ratón.Registre la actividad y el tiempo en un cuaderno de laboratorio. Después de inyectar a los ratones, etiquete sus jaulas con una tarjeta de jaula que indique que los ratones son radiactivos. Registrar y registrar las jaulas de acuerdo con los lineamientos institucionales. Luego, coloque a los ratones en un área de retención radiactiva designada. 6. Imágenes PET/CT Realizar la PET 18-24 h después de la inyección de 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. Pesa y puntúa a los ratones antes de escanearlos.NOTA: Las instrucciones de funcionamiento del escáner dependen del escáner que se esté utilizando.Asegúrese de que el componente de rayos X del escáner PET/CT esté calentado y listo para la adquisición. Abra el software de adquisición del escáner PET en la computadora. En el menú desplegable Inicio de sesión del investigador , haga clic en la información de laboratorio correspondiente. En la página Proyecto , cree un nuevo proyecto o seleccione un proyecto existente en el menú desplegable. Cuando el mensaje de inicialización aparezca automáticamente en la pantalla, haga clic en Home Bed y espere a que la cama llegue a casa. A continuación, haz clic en Warm up CT.Asegúrese de que la puerta de protección de la TC esté cerrada para permitir que la TC se caliente. Mientras el escáner se calienta, puntúa a los ratones EAE e inyéctalos por vía subcutánea con 0,2-0,4 ml de solución salina tibia en el flanco para que se hidraten. Después de calentar el escáner, regrese a la computadora para configurar las exploraciones PET para el estudio.NOTA: Estos se pueden configurar antes del día del escaneo.En el encabezado Estudios recientes , haga clic en Crear nuevo estudio. Complete el nombre del estudio, el protocolo, el compuesto y la información del tema.Si realiza una PET/CT, seleccione primero el protocolo PET y, a continuación, seleccione el protocolo CT.NOTA: Normalmente, una tomografía computarizada estándar es suficiente para escanear el modelo de ratón EAE. Una tomografía computarizada tiene una duración de 1 minuto y se adquiere con agrupamiento a 2 x 2 a una tensión de 80 kVp, una corriente de 150 μA y 720 proyecciones. Las imágenes de TC se reconstruyen utilizando un algoritmo de Feldkamp modificado. Para el protocolo PET, elija un escaneo estático de 64 cobres de 10 a 15 minutos. Si este análisis aún no está en la lista de protocolos disponibles, agréguelo haciendo clic en la pestaña Protocolos en el menú Estándar , Crear nuevo protocolo | Menú desplegable Isótopos . Si el isótopo deseado no aparece en la lista, haga clic en Más | Agregue desde la biblioteca y agregue el isótopo deseado. Defina la duración del escaneo, haga clic en el botón de opción para Escaneo estático, asigne un nombre al protocolo y haga clic en Guardar. Regrese a la pestaña Estudios y continúe nombrando y configurando todos los escaneos deseados para el día.NOTA: Se recomienda configurar también una “prueba de tomografía computarizada” utilizando solo una tomografía computarizada estándar para verificar la posición de la cama de la primera exploración para garantizar una colocación óptima. Esta debería ser la primera exploración que se realice para el estudio. Una vez que el escáner esté listo, anestesia a los ratones en una caja desmontable para prepararlos para el escaneo.NOTA: En esta etapa, es probable que los ratones estén muy enfermos; Es una buena práctica minimizar el tiempo bajo anestesia.Aplícate gel para los ojos. Asegúrese de que la cama de escaneo para cuatro ratones esté equipada con elementos calefactores, como almohadillas térmicas o aire caliente, con el isoflurano ajustado al 1,5 %-2 % y la almohadilla térmica encendida (Figura 3). Coloque a los ratones en posición supina sobre la cama de exploración.A medida que avanza la enfermedad EAE, la columna vertebral del ratón se curva severamente. Escanee a los ratones mientras están boca arriba para enderezar la columna vertebral tanto como sea posible, mejorando el análisis posterior. Tire suavemente de la cola del ratón para ayudar a enderezar la columna vertebral. Una vez en posición supina, pegue firmemente cada ratón en su lugar con cinta adhesiva suave para microscopio. Use una tira de cinta adhesiva sobre la cabeza y otra suavemente sobre el abdomen para minimizar el movimiento debido a la respiración.Registre en un cuaderno de laboratorio qué mouse está en qué posición de escaneo. Una vez que los ratones estén asegurados, regrese a la computadora de escaneo para operar el escáner. Abra el menú Controlador de movimiento . Haga clic en PET Center FOV para mover los ratones en la cama de escaneo al anillo PET. Para el primer escaneo del día, haga clic en CT Center FOV. Una vez en posición, ejecute la prueba de tomografía computarizada para asegurarse de que la posición sea correcta; Repita hasta que la posición de la cama sea satisfactoria.Coloque un pequeño trozo de cinta blanca en la cama de escaneo para marcar la ubicación correcta de la cama para el resto del estudio. Una vez que la cama esté en su lugar para la exploración PET, inicie la secuencia de escaneo haciendo clic en Ejecutar.Espere a que el escáner se mueva automáticamente del anillo PET al CT. Compruebe siempre visualmente si los animales se han colocado en la posición adecuada tanto para la PET como para la TC. Registre la hora de inicio de la exploración en un cuaderno de laboratorio para la corrección de la caries de la dosis inyectada durante el análisis de datos. Una vez finalizado el escaneo, permita que la imagen se reconstruya. Compruebe los datos antes de retirar a los animales.NOTA: La reconstrucción de la maximización de expectativas (OSEM) de subconjuntos ordenados en 3D tardará aproximadamente 5 minutos en realizarse un escaneo estático. Comprobar y aprobar visualmente los datos, utilizando el bazo como control positivo, ya que este tejido contiene un gran número de células B. Retire a los animales de la cama de exploración y colóquelos en una caja de desmontaje llena de isoflurano en preparación para la perfusión y la disección posterior. Repita los pasos 6.5-6.12 para los ratones restantes del estudio. Cuando se escanean todos los ratones o cuando se escanea un grupo que tiene un lugar libre en la cama de exploración, escanee el estándar preparado en el paso 4.6. 7. Disección para recuento gamma ex vivo y autorradiografía Antes de diseccionar, asegúrese de que todos los tubos de recuento gamma y centrífugo se hayan pesado previamente. Realizar la eutanasia por perfusión, como se ha descritoanteriormente 6, con PBS y toracotomía mientras los ratones están profundamente anestesiados (inhalación continua de isoflurano al 4%, 2 L/min 100%O2). Para extirpar la médula ósea, corte ambos fémures a la altura de la rodilla y la pelvis. Asegúrese de que ambas cabezas estén separadas del fémur.Coloque ambos fémures en un tubo de centrífuga de 0,5 ml que tenga un orificio en la parte inferior (con una aguja de 20 G) y que tenga la tapa cortada. Coloque el tubo de 0,5 ml que contiene los fémures dentro de un tubo de centrífuga de 1,5 ml con la tapa cortada. Coloque toda la configuración del tubo en una mini centrífuga. Centrifugar durante 4 min a 4.500 × g.NOTA: La médula ósea debe desprenderse a través del orificio del tubo de centrífuga de 0,5 ml y depositarse en el fondo del tubo de centrífuga de 1,5 ml.Separa los tubos. Pesar los fémures vacíos en el tubo de centrífuga de 0,5 ml. Pesar la médula ósea en el tubo de centrífuga de 1,5 ml. Coloque cada tubo de centrífuga en tubos de conteo gamma. Extirpe el cerebro con fórceps y tijeras, teniendo cuidado de mantener intacto el tronco encefálico. Coloque el cerebro en un tubo de conteo gamma. Registre el peso seco, enjuague con PBS y manténgalo en hielo hasta que esté listo para contar. Para extirpar la médula espinal, realice los siguientes pasos.Retire la piel y el pelaje haciendo una incisión en el lado dorsal del animal para exponer la columna vertebral (Figura 1). Separe las regiones lumbar (L) de las cervicales (C) y torácicas cortando a lo largo de tres planos transversales alrededor y a través de la columna vertebral: en la base del cuello (vértebra C1) (Figura 1D, Número 1); en la base de la caja torácica (vértebra L1) (Figura 1D, Número 2); en la base de la pelvis (vértebra L5) (Figura 1D, Número 3). Corte debajo de la caja torácica (Figura 1D, Número 2). Corta directamente por encima del sacro para separar la región espinal lumbar. Recorte con cuidado la columna vertebral desde el extremo pélvico hasta que la médula espinal lumbar sea visible (Figura 1D, Número 3). Recortar los tejidos circundantes para aislar las regiones lumbar y cervical/torácica de la columna vertebral (Figura 1D, números 4 y 5). Para expulsar la médula espinal, use una jeringa de punta deslizante (3-10 ml) llena de PBS. Crea un sello entre la jeringa y la columna vertebral con el pulgar y el índice.Empuje suavemente el PBS a través de la jeringa para expulsar la médula espinal sobre una almohadilla absorbente (Figura 1E); Repita para ambas regiones de la columna vertebral. Coloque los tejidos de la médula espinal en un tubo de conteo gamma. Registre el peso seco y agregue PBS para asegurarse de que el tejido esté en la parte inferior del tubo para evitar que se seque. Coloque el tubo sobre hielo hasta que esté listo para contar. Expulsar la médula espinal cervical/torácica del extremo craneal y la médula espinal lumbar del extremo caudal de la columna vertebral (Figura 1E). 8. Recuento gamma ex vivo Abra el software del contador gamma. Navegue a la lista de trabajo y seleccione el protocolo deseado, como un protocolo de conteo de 30 s para 64Cu. Prepare al menos tres patrones en tubos separados. Ejecútelos ahora para utilizarlos en el análisis (paso 10.2). Trate de hacer tres volúmenes y cantidades de actividad replicados en tres tubos separados.NOTA: Un volumen de 500 μL da buenos resultados. Si bien la actividad estará determinada por la máquina utilizada, 10 μCi generalmente funciona bien. Coloque los estándares en un bastidor etiquetado con el código de barras correspondiente al protocolo deseado que se va a ejecutar. Coloque la rejilla en el mostrador gamma. Después de registrar los pesos de los órganos, coloque los tubos que contienen los órganos en la rejilla de conteo gamma después de los tubos que contienen los estándares.NOTA: Los órganos de interés para este modelo pueden incluir ganglios linfáticos axiales, sangre, médula ósea, cerebro, ganglios linfáticos cervicales, fémur, corazón, hígado, médula espinal lumbar, músculo, bazo, cola y médula espinal cervical/torácica. Coloque un estante con un código de barras de parada en la parte posterior del contador gamma. Presione el botón Reproducir en la computadora. Si es posible, no presione Reproducir hasta que haya varios racks u órganos para ejecutar para permitir que todos los tubos se cuenten continuamente en un archivo. Asegúrese de que haya un bastidor con un código de barras de parada en la parte posterior del contador gamma para cada ejecución. Ejecute hasta que se hayan contado todas las muestras. Guarde y exporte el archivo. 9. Autorradiografía ex vivo (ARG) del tejido del SNC Siga los pasos publicados anteriormente para la ARG cerebral y de la médula espinal (excluyendo los pasos 2-6 descritos por Chaney et al., ya que los ratones ya están inyectados con radiotrazador de la tomografía por emisión de positrones)6.NOTA: Las instrucciones específicas para preparar el casete ARG de la médula espinal se enumeran aquí6. Una vez que se haya completado el recuento gamma de la médula espinal lumbar y cervical/torácica, coloque rápidamente los tubos en hielo hasta que se hayan contado todos los tejidos del SNC.NOTA: Refiérase al método publicado anteriormente para ARG del cerebro6. Incline suavemente los tubos para permitir que la médula espinal caiga sobre una almohadilla absorbente. Si la médula espinal se pega al costado de la sonda, enjuague suavemente con PBS frío y vuelva a inclinar la sonda. Seque cuidadosamente cada médula espinal secándola suavemente con un pañuelo de laboratorio. Coloque la médula espinal seca de manera organizada en una hoja de papel negro grueso.Etiquete junto a la médula espinal con un bolígrafo blanco para facilitar su identificación. Deje espacio en las esquinas y en el centro del papel negro para colocar pilas de tres portaobjetos de microscopio que actúen como espaciadores para evitar la compresión de la médula espinal cuando el casete ARG está cerrado. Usa de 5 a 7 acumulaciones. Una vez que todas las médulas espinales lumbares y cervicales/torácicas estén colocadas en el papel negro y etiquetadas, coloque con cuidado la hoja de papel en el casete ARG. Coloque el casete abierto en una bandeja de hielo seco para congelar la médula espinal. Una vez congeladas, coloque suavemente una envoltura de plástico entre la pantalla de almacenamiento de fósforo digital y la médula espinal y coloque la pantalla encima de las muestras. Cierre inmediatamente el casete y colóquelo en el congelador a -20 °C durante aproximadamente 10 semividas (~127 h). Cuando se complete el tiempo de exposición, escanee la película con un generador de imágenes de fósforo. Analice la imagen digital resultante (consulte la sección 12 para obtener instrucciones). 10. Análisis de los datos de biodistribución Configure una hoja de cálculo de “Corrección de dosis” para determinar matemáticamente la corrección temporal de la desintegración radiactiva, normalizando así las dosis de radiación y permitiendo comparaciones entre sujetos.Corrija todas las dosis hasta el momento de la inyección, teniendo en cuenta la actividad residual que queda en la jeringa y el catéter después de la inyección. Utilizando los estándares preparados en el paso 8.2, promedie la cantidad de actividad (μCi) y los recuentos normalizados por minuto (CPM). Divida el CPM promedio por la cantidad promedio de actividad estándar para obtener CPM/μCi.NOTA: Asegúrese de que la cantidad de actividad para cada patrón esté corregida por decaimiento hasta el momento en que el contador gamma cuenta el CPM de los estándares. El contador gamma debe normalizar todos los valores de CPM a la hora de inicio del protocolo. Configure la hoja de cálculo “Resultados” para calcular el porcentaje final de dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g) para cada muestra.Corrija la disminución del CPM normalizado desde el contador gamma para cada muestra contada hasta el momento de la inyección del animal.NOTA: La corrección de decaimiento puede ser en cualquier punto de tiempo; asegúrese de que todas las dosis y los valores de CPM se corrijan en función de la disminución en el mismo punto de tiempo. Normalice el CPM corregido por decaimiento a la masa de cada muestra para determinar el CPM por muestra. Calcule el CPM total inyectado restando el CPM en la cola del CPM inyectado calculado.NOTA: No es necesario corregir la masa de la cola, ya que este valor de CPM simplemente se restará del CPM total inyectado para tener en cuenta cualquier marcador extravenoso de la inyección. Divida el CPM por masa por el CPM total inyectado para calcular %ID/g. Configure una hoja de cálculo de “Resumen” para mostrar los resultados finales para ingresarlos en un software de gráficos y la posterior visualización de datos y análisis estadístico. 11. Análisis de imágenes PET Abra el software de análisis PET. lick on File |Datos Locales Abiertos | DICOM. Localice el archivo deseado (formato DICOM). Abra tanto la PET como la TC. En el Administrador de datos, ajuste el contraste de PET y CT a los niveles deseados. Registre y recorte ratones individuales.En el menú de navegación , seleccione la pestaña Reorientación/Registro . Ve al menú Rígido dentro de esta pestaña. Designe la tomografía computarizada (0 ) como la exploración fija y la exploración PET (1) como la exploración en movimiento . Seleccione Transformación rígida y calidad rápida . Haga clic en Registrarse. Una vez completado el registro (5-10 min), haga clic en la marca de verificación para guardar el registro. Inspeccione visualmente los datos para asegurarse de que el registro se haya realizado correctamente. Exporte la sesión haciendo clic en Archivo | Sesión | Exportación. A continuación, recorta cada ratón en un recorte de cuerpo completo: ve al menú de navegación y haz clic en Recortar. Arrastre los lados de cada sección transversal desde el borde exterior hacia adentro. Una vez que el mouse deseado esté bien recortado, haga clic en la marca de verificación y exporte la sesión para guardarla. A continuación, recorte y enderece las cabezas de cada ratón para el análisis del cerebro utilizando el manual Traducción, Rotaciones y Volteos en el menú Registro/Reorientación . Exporte para guardar. Analiza la médula espinal.Para comenzar el análisis de las regiones de interés (ROI) en la médula espinal, abra la herramienta ROI 3D desde el menú de navegación . Debajo del encabezado ROIs, use el signo más en la parte inferior del menú para crear seis ROIs: ROI lumbar, ROI cervical/torácico, Esqueleto lumbar, Esqueleto torácico, Médula espinal lumbar, Médula espinal torácica.NOTA: Las ROI lumbares y cervicales/torácicas son ROI grandes generalizadas que se utilizarán para crear las ROI del esqueleto (Figura 4). Para evitar la interferencia visual de la señal PET con este paso, haga clic en F3 para apagar el PET. Vaya a la parte superior del operador de herramientas de ROI 3D. Haga clic en el punto sólido a la derecha del símbolo del cursor para abrir el menú Modo de pintura 3D y Erosionar/Dilatar . Seleccione Esfera y cambie el tamaño a 20 píxeles. Establece Dilatar en +5.Antes de continuar, vaya a la parte inferior del menú. Asegúrese de que el ROI lumbar esté seleccionado, ya que este es el primer ROI que se extrae. En la tomografía computarizada, busque la vértebra L6 de la columna vertebral (donde la columna vertebral se une con las caderas). Comenzando una vértebra por encima de L6, dibuja un ROI lumbar aproximado sobre las cinco vértebras por encima de las caderas (vértebras L1-L5). A continuación, cambie a ROI cervical/torácico y trace el resto de la columna vertebral hasta la base del cráneo.NOTA: Esto no tiene que ser preciso, ya que se utiliza para indicar dónde debe ocurrir el umbral Otsu en el paso 11.4.8. Después de dibujar los ROI generalizados, vaya a la parte superior del operador. Seleccione el menú Algoritmos de segmentación . En el menú desplegable, seleccione Umbral de Otsu. Para la entrada, seleccione ROI lumbar. En la parte inferior del menú, asegúrese de que Esqueleto lumbar esté seleccionado. En el menú desplegable junto a Imagen, asegúrese de que la tomografía computarizada esté seleccionada y haga clic en Aplicar. Repita el procedimiento para el ROI cervical/torácico y el esqueleto torácico.Si el umbral de Otsu no resalta lo suficiente la columna vertebral, utilice el umbral global y cambie el valor mínimo a 350 y el máximo a 3.500 para el umbral manual y ajústelo según sea necesario para aislar las vértebras. Después de usar Otsu Thresholding para crear los ROI de esqueleto, regrese al menú de navegación (icono de cursor). Elimine o marque la columna H (ocultar) para los ROI lumbar y cervical/torácico aproximados para ocultarlos. Marque la columna I (inmutable) para ambos ROI de esqueleto para que no se puedan editar. Por último, vuelve a la parte superior del Operador de la herramienta ROI 3D y ve al menú Pintura 3D para dibujar los ROI de la médula espinal.Vuelva a seleccionar la herramienta Esfera y trace la médula espinal dentro del esqueleto tanto para lumbar como para torácico, asegurándose de seleccionar el ROI correcto en la parte inferior del menú. Para borrar cualquier ROI, haga clic en Comando/Control y dibuje sobre la parte que se va a borrar. Verifique el ROI de la médula espinal desde los tres planos para asegurarse de que no haya ROI extraído fuera de la columna vertebral. Exporte los resultados del análisis de la médula espinal.Si la señal PET se desactivó en el paso 11.4.3, presione F3 después de que se dibujen los ROI de la médula espinal para volver a encender el PET, o seleccione el controlador visual (VC) y haga clic en la barra PET. Vuelva al menú de navegación (icono del cursor). Haga clic en el icono de la cuadrícula para mostrar la tabla. Copie la tabla en un software de hoja de cálculo y guárdela. Por último, exporte el archivo en el software de análisis PET, como se describió anteriormente, para guardar los ROI dibujados. Analice el cerebro utilizando un atlas 3D semiautomatizado.Abra el archivo de recorte de cabeza. Importe el atlas del cerebro del ratón yendo al menú Módulos avanzados y seleccionando la herramienta Atlas del cerebro 3D. Asegúrese de que la referencia esté establecida en CT y que la opción de recorte esté desactivada. Establezca una ruta para el directorio de salida. En Configuración avanzada, cambie Transformar a Versor-Affine. Mantenga todas las demás configuraciones predeterminadas. Haga clic en Ejecutar. Ajuste manualmente el atlas en el menú Reorientación/Registro y utilice la TC del cráneo como guía para ajustar el atlas.Tenga mucho cuidado si es necesario desescalar, ya que esto puede afectar en gran medida los volúmenes de la estructura cerebral. Haga clic en la marca de verificación cuando se complete el ajuste. Vuelva a ejecutar el atlas con la opción Importar ROI 3D seleccionada. Exporte el archivo para guardar el atlas instalado en el cabezal recortado. Después de dibujar y exportar todas las ROI de los órganos deseados, calcule un valor de corrección de encuadernación estándar. Corrija todos los datos y conviértalos a %ID/g como se describió anteriormente6. Normalizar al órgano que se adapte al modelo animal, como el corazón para normalizar a la radiosonda presente en el charco sanguíneo. 12. Análisis de autorradiografía ex vivo Abra el archivo de imagen digital (.gel) con el software de análisis de imágenes. Ajuste el brillo y el contraste al umbral deseado. Aplique una tabla de búsqueda de color adecuada si lo desea.NOTA: Se recomienda Royal o Grays para facilitar la visualización.