Imaging delle cellule B CD19⁺ in un modello murino sperimentale di encefalomielite autoimmune utilizzando la tomografia a emissione di positroni

Figura 1: Disegno dello studio. Una panoramica delle tecniche chiave in questo articolo. (A) Posizionare i topi sul letto di scansione sulla schiena riduce il movimento della colonna vertebrale. (B) Imaging PET/TC dei topi. (C) Praticare un’incisione lungo il lato dorsale dell’animale per esporre la colonna vertebrale. (D) Dividere in due la colonna vertebrale in porzioni cervicale/toracica e lombare e rimuovere le sezioni seguendo i cinque tagli indicati. (E) Utilizzare una siringa per rimuovere il midollo spinale dalla colonna vertebrale sigillando con la siringa e la colonna vertebrale e lavando le estremità craniche e caudali della colonna vertebrale come mostrato. (F) Segmenti isolati del midollo spinale cervicale/toracico e lombare. Abbreviazione: PET/CT = Tomografia ad emissione di positroni/tomografia computerizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con l’Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) della Stanford University, un programma accreditato dall’Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International). I topi sono stati acclimatati al vivaio per almeno 7 giorni prima dell’inizio dello studio per ridurre al minimo lo stress sui topi, poiché lo stress può influenzare l’induzione dell’EAE. 1. Induzione EAE in topi CD19 umanizzati femmine Indurre topi femmina CD19 C57BL/6J umanizzati di età compresa tra 9 e 13 settimane con EAE come descrittoin precedenza 5 utilizzando MOG1-125. 2. Cura degli animali e punteggio nel modello murino EAE Valutare la progressione della malattia e la cura dei topi come descritto in precedenza5. In breve, assegna un punteggio a questo modello su una scala da 1 a 5 come segue: 1 è debolezza/zoppia della coda, 2 è arti posteriori indeboliti, 3 è paralisi degli arti posteriori, 4 è paralisi degli arti posteriori con debolezza degli arti anteriori, 5 è moribondo. 3. Coniugazione, radiomarcatura e caratterizzazione degli anticorpi monoclonali Coniugare il chelante bifunzionale 1,4,7,10-tetraazciclododecano-1,4,7,10-estere mono-N-idrossisuccinimide dell’acido tetraacetico (DOTA-NHS-estere) a hCD19-mAb per radiomarcare con 64Cu.Utilizzando una colonna di desalinizzazione, sostituire il tampone di conservazione hCD19-mAb con il tampone HEPES (pH 8,5-9): condizionare la/e colonna/e di desalinizzazione con HEPES. Calcolare il numero di colonne necessarie in base alla colonna di desalinizzazione, alla capacità del volume del campione e al volume di anticorpi monoclonali richiesti: provette da 0,5 mL: 30-130 μL di volume del campione, 300 μL di lavaggio; Provette da 2 mL: 200-700 μL di volume di campione, 1 mL di lavaggio. Raffreddare la centrifuga a 4 °C per lo scambio di tamponi attraverso la colonna di desalinizzazione. Recuperare la colonna di dissalazione dal frigorifero. Rimuovere la parte inferiore della colonna di dissalazione, allentare il tappo e posizionare la colonna in una provetta di raccolta. Centrifugare a 1.500 × g per 2 minuti per rimuovere la soluzione di conservazione; Scartare il flusso contenente la soluzione di conservazione e riutilizzare la provetta di raccolta. Segnare una linea sulla colonna nel punto in cui il punto più alto della resina compattata di desalinizzazione è inclinato verso l’alto. Aggiungere il buffer HEPES sul lato inferiore della colonna di desalinizzazione. Posizionare la colonna di dissalazione nella centrifuga con la linea rivolta verso l’esterno; Centrifugare a 1.500 × g per 2 min. Scartare il flusso e riutilizzare la provetta di raccolta. Ripetere i passaggi 3.1.4 e 3.1.5 2 volte utilizzando la stessa provetta di raccolta e scartando il flusso tra le fasi. Posizionare la colonna di desalinizzazione condizionata in una nuova provetta di raccolta e in una nuova etichetta; questa provetta conterrà l’hCD19-mAb. Aggiungere hCD19-mAb nella parte superiore della/e colonna/e di desalinizzazione condizionata e utilizzare il tampone HEPES per risciacquare il flaconcino di anticorpi monoclonali vuoto; Aggiungilo nella parte superiore della colonna di dissalazione (volume totale secondo la raccomandazione del produttore). Centrifugare a 1.500 × g per 2 minuti per eluire l’hCD19-mAb. Mantenere il flusso contenente l’hCD19-mAb. Misurare la concentrazione di hCD19-mAb utilizzando uno spettrofotometro UV/Vis e regolare a 0,5 μg/μL con tampone HEPES, se necessario. Alla soluzione di anticorpi monoclonali hCD19, aggiungere 1/50del volume della soluzione di anticorpi monoclonali di EDTA 0,5 M per rendere la concentrazione finale di EDTA di 0,01 M nella soluzione di anticorpi monoclonali di hCD19. Lasciare riposare la soluzione hCD19-mAb-EDTA a temperatura ambiente per 15 minuti. Rimuovere l’estere DOTA-NHS dal congelatore e lasciarlo a temperatura ambiente (10-15 min). Calcolare il volume di DMSO da aggiungere all’estere DOTA-NHS per ottenere una concentrazione di DOTA che consenta l’aggiunta del rapporto molare DOTA/mAb desiderato (che è tipicamente dell’ordine di 1-2 DOTA/mAb).NOTA: Il volume di DMSO-DOTA-NHS-estere aggiunto a hCD19-mAb non deve superare il 10% del volume di mAb. Questo dovrebbe essere fatto utilizzando un foglio di calcolo in modo che possa essere fatto rapidamente e ripetutamente. In base al rapporto desiderato tra DOTA e hCD19-mAb, calcolare la quantità di DOTA-NHS-estere da aggiungere a hCD19-mAb.nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg di DOTA → mg/mL DOTA/DMSO → mL di DMSO → fattore di diluizione della soluzione DOTA/DMSO Pesare 1-2 mg dell’estere DOTA-NHS e aggiungere con attenzione il volume corretto (calcolato al punto 3.1.11) di DMSO all’estere DOTA-NHS; Mescolare e centrifugare. Pipettare il volume calcolato della soluzione DOTA-NHS-estere (fase 3.1.12) nella soluzione di hCD19-mAb; pulire l’esterno del puntale della pipetta prima dell’aggiunta per assicurarsi che non venga aggiunto ulteriore DOTA-NHS-estere (senza modificare la quantità nella pipetta). Mescolare delicatamente e centrifugare. Mettere in frigo (4 °C) per reagire per una notte (12-16 h). Purificazione e concentrazioneRaffreddare la centrifuga a 4 °C per le fasi di sostituzione del tampone del concentratore centrifugo; posizionare un blocco di provette PCR metalliche su ghiaccio secco per congelare a scatto il coniugato. Rimuovere la reazione DOTA-hCD19-mAb dal frigorifero ed estinguere aggiungendo un tampone TRIS di grado biologico: 10% del volume totale della reazione. Rimuovere 10-20 μg del campione per l’analisi di spettrometria di massa. Condizionare la/e colonna/e di desalinizzazione come descritto sopra (passaggi 3.1.1-3.1.5), utilizzando tampone 0,1 M di acetato di ammonio, pH 5,5. Tamponare la soluzione DOTA-hCD19-mAb in acetato di ammonio (passaggi 3.1.1-3.1.8). Concentrare la soluzione DOTA-hCD19-mAb: aggiungere la soluzione a un concentratore centrifugo cut-off a peso molecolare da 50 kDa seguendo le raccomandazioni del produttore sul volume. Centrifugare a 4.000 × g per 10 min (o fino a quando il volume non si riduce dell’80%-90%); Scartare il flusso. Ripetere l’operazione altre nove volte (10 in totale): aggiungere una quantità sufficiente di acetato di ammonio per riportare il volume al volume massimo consigliato.NOTA: Il totale deve essere quello che è stato aggiunto inizialmente, compreso ciò che è rimasto nella colonna, di solito 400-450 μL per un concentratore centrifugo con capacità di 500 μL.Sciacquare il flaconcino di reazione con tampone di acetato di ammonio per recuperare eventuali residui di DOTA-hCD19-mAb; Aggiungere il lavaggio al concentratore centrifugo. Centrifugare a 4.000 × g per 10 min.NOTA: Il tempo di centrifuga può essere ridotto nelle centrifughe successive se il volume viene ridotto all’80%-90% in meno tempo. Rimuovere la soluzione proteica dal concentratore centrifugo. Notare il volume totale del DOTA-hCD19-mAb.Nel concentratore centrifugo 2, aggiungere una quantità sufficiente di tampone di acetato di ammonio per un volume totale di 100 μL e pipetterare per miscelare. Tappare la colonna del concentratore centrifugo e capovolgere. Centrifugare a 4.000 × g per 2 minuti per raccogliere la soluzione. Trasferire in un nuovo tubo. Nel concentratore centrifugo 500, utilizzare una pipetta per raccogliere la soluzione di anticorpi monoclonali dal concentratore centrifugo; Aggiungi a un nuovo tubo. Misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis. Se la concentrazione è superiore a 2 mg/mL, diluire con acetato di ammonio a 2 mg/mL. Aliquota: 100 μg per provetta PCR (circa 50 μL); etichettare le provette con DOTA-hCD19-mAb, data, massa e concentrazione. Gira le fiale. Congelare a scatto il DOTA-hCD19-mAb sul blocco PCR refrigerato su ghiaccio secco (o congelare su ghiaccio secco). Una volta congelati tutti i campioni, metterli in un congelatore a -80 °C. Misurare il numero di DOTA per hCD19-mAb mediante spettrometria di massa. Conservare un campione di anticorpo non coniugato (puro) da ciascuna coniugazione per calcolare il rapporto. Utilizzare l’equazione (1) riportata di seguito; il peso molecolare è abbreviato in MW.(1) RadiomarcaturaNOTA: Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati per la manipolazione della radioattività, tra cui camice da laboratorio, guanti e dosimetri personali per il corpo e ad anello, seguendo le normative istituzionali. Ispezionare e cambiare regolarmente i guanti per prevenire la contaminazione radioattiva. Utilizzare una schermatura di piombo e aumentare la distanza dalla sorgente radioattiva maneggiando con le pinze quando possibile.Trasferire la radioattività dal flaconcino di spedizione a un nuovo flaconcino utilizzando una pipetta. Misurare la radioattività. Rimuovere un’aliquota per la prima reazione di radiomarcatura. Aggiungere 50 μL di acetato di ammonio (pH 5,5) per 1 mCi di 64Cu-CuCl3. Misurare il pH pipettando 1 μL su una striscia di pH con un intervallo che cattura 5,5 con una risoluzione sufficiente per distinguere tra 5 e 6. Se il pH non è 4-5,5, modificarlo utilizzando 1 M di NaOH o 0,1 M di HCl. Aggiungere piccole quantità, 1-5 μL, di 1 M di NaOH se il pH è inferiore a 4 o 0,1 M di HCl se il pH è maggiore di 5,5 fino a raggiungere il pH corretto. Ad ogni aggiunta, mescolare accuratamente, abbassare la rotazione e misurare il pH come descritto sopra. Annotare ogni aggiunta e rimozione di qualsiasi soluzione (anche per controllare il pH) in modo da poter calcolare il volume finale. Una volta raggiunto il pH ottimale, aggiungere 10 μg di DOTA-hCD19-mAb per 1 mCi di 64Cu-CuCl3. Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente. Posizionare il flaconcino di reazione su un termomiscelatore impostato a 37 °C e 400 giri al minuto (giri/min). Dopo 30 minuti, spegnere la reazione: dividere il volume totale della reazione per 50 e aggiungere quel volume di 0,5 M EDTA alla miscela di reazione. Determinare l’efficienza di marcatura utilizzando la cromatografia istantanea su strato sottile (ITLC) per misurare la percentuale di rame legato e libero nella soluzione.Taglia strisce di carta TLC larghe 1 cm. Segnare 1 cm dall’alto e dal basso della striscia e preparare una provetta (matraccio conico da 50 mL) con fase mobile inferiore a 1 cm di acido citrico 0,1 M (il livello della fase mobile deve essere inferiore al segno di 1 cm sulla striscia quando viene inserita nella provetta). Pipettare 1 μL della soluzione di reazione sulla striscia in basso a 1 cm (fronte del solvente) e posizionare la striscia nella provetta. Osservate fino a quando la parte anteriore del solvente non raggiunge il segno superiore di 1 cm, rimuovete la striscia e avvolgetela in un pezzo di pellicola trasparente. Posiziona la striscia sulla piattaforma e fallo passare attraverso uno scanner di imaging radio-TLC. Cercare l’anticorpo monoclonale radiomarcato all’origine e liberare 64Cu che viaggia con il fronte di fase mobile (Figura 2). Se la percentuale di rame libero è inferiore al 5% (efficienza di marcatura del 95%), procedere con l’iniezione negli animali. Se la percentuale di rame libero è superiore al 5%, procedere con la purificazione.NOTA: La percentuale di rame libero dipende generalmente dal rapporto tra DOTA-mAb e 64Cu, dal tempo di reazione, dal pH e dalla temperatura. Le condizioni di reazione devono essere ottimizzate da ciascun utente per ogni nuovo anticorpo monoclonale per garantire risultati coerenti. Purificazione tramite una colonna a gravità monouso di grado DNACondizionare una colonna monouso a flusso gravitazionale di grado DNA (colonna di desalinizzazione/scambio tampone) secondo le indicazioni del produttore. Posizionare la colonna gravitazionale monouso per grado di DNA su un supporto ad anello o su un altro strumento dietro un’adeguata schermatura di piombo; Assicurarsi che l’apparecchio sia stabile e facilmente spostabile. Posizionare il tubo sotto la colonna. Pipettare la miscela di reazione grezza sulla resina della colonna a flusso gravitazionale. Attendere che tutto il liquido sia fluito nella resina. Pipettare PBS sufficiente a portare l’intero volume (prodotto grezzo più PBS) a 500 μL. Smaltire il flusso. Posizionare la colonna su provette da centrifuga da 1,5 mL etichettate da 1 a 10. Aggiungere 1 mL di PBS alla colonna. Raccogliere cinque gocce in ogni provetta fino a quando il flusso non si è fermato.NOTA: Potrebbero essere necessari meno di 10 tubi. Tappare il fondo della colonna e misurare la radioattività residua. Misurare ogni flaconcino con il flusso. Per ogni flaconcino con più di 50 μCi, preparare un ITLC secondo il passaggio 3.3.7 per misurare la percentuale di rame legato in ciascuna frazione.NOTA: La prima o due frazioni conterranno solo la fase mobile; l’anticorpo monoclonale radiomarcato eluirà per primo (in genere le frazioni da 2 o 3 a 5 o 6) e il 64Cu libero eluirà per ultimo (alcuni si attaccheranno alla colonna). La percentuale di 64Cu può variare tra le frazioni. Combinare le frazioni con un legame superiore al 95% (meno del 5% di rame libero); Usi la soluzione iniettabile. Se lo si desidera, eseguire l’HPLC ad esclusione dimensionale per confermare la radiomarcatura5 e calcolare l’attività molare. Conservare un’aliquota per misurare la concentrazione su uno spettrofotometro UV-Vis dopo che è decaduto per 10 emivite (127 ore o 5,3 giorni). 4. Preparazione della dose NOTA: Prima di maneggiare la dose, indossare DPI adeguati, inclusi camice da laboratorio, dosimetri per il corpo e le dita e guanti. Iniettare 64Cu-DOTA-hCD19-mAb 18-24 ore prima della scansione PET, per consentire un’adeguata circolazione del radiotracciante nell’organismo. Posizionare immediatamente il contenitore di piombo con il 64Cu-DOTA-hCD19-mAb dietro la schermatura di piombo. Attivare il contatore Geiger per monitorare la potenziale contaminazione.NOTA: Cambiare frequentemente i guanti quando si maneggia materiale radioattivo. Si consiglia di utilizzare due guanti durante il prelievo delle dosi per facilitare un rapido cambio dei guanti. Posizionare sempre oggetti taglienti e spazzatura contaminati nell’area designata per i rifiuti schermati. Diluire il 64Cu-DOTA-hCD19-mAb a una concentrazione appropriata in una provetta da centrifuga in plastica da 1,5 mL a basso legame con legante.NOTA: Il 64Cu-DOTA-hCD19-mAb si legherà alla plastica se non è a basso legame; 64Cu si legherà al vetro.Diluire il radiotracciante in soluzione fisiologica per prevenire la radiolisi e semplificare il prelievo di dosi costanti. Preparare dosi da somministrare tra 75 e 150 μCi in 100 μL, se possibile. Assicurarsi che il volume totale massimo iniettato non superi il 10% del peso corporeo del topo. Utilizzare una siringa da insulina da 500 μL (50 cc) per prelevare la dose dal tubo di plastica a basso legame. Assicurarsi che non ci siano bolle nella siringa poiché verrà iniettata per via endovenosa.Preetichettare le siringhe con i numeri degli animali corrispondenti. Registrare la dose, l’attività e il tempo in un quaderno di laboratorio per l’analisi dei dati. Tenere le dosi pronte per l’iniezione non appena gli animali vengono cateterizzati per ridurre il tempo sotto anestesia. Dopo aver preparato le dosi, preparare uno standard (phantom) per la scansione per generare un fattore di calibrazione.Riempire una provetta conica da 15 mL con 50-75 μCi di attività diluita in acqua (o PBS).NOTA: Assicurarsi di miscelare accuratamente la soluzione. Lo standard può essere libero 64Cu rimasto dall’etichettatura.Misurare la quantità di attività nello standard e registrare l’ora. 5. Incannulamento e iniezione NOTA: Vedere i metodi6 descritti in precedenza per l’incannulamento endovenoso di topi per l’iniezione del radiotracciante6. Pesare e valutare i topi in base alla gravità della malattia, come descritto nel paragrafo 2.1, prima di anestetizzare i topi in una scatola knockdown riempita con isoflurano all’1,5-3% in preparazione alla somministrazione del radiotracciante.NOTA: Questi mouse verranno iniettati sul piano di lavoro, non sullo scanner PET come descritto in precedenza. Non è necessario incollare i cateteri in posizione per l’iniezione, poiché i topi non verranno spostati tra l’incannulamento e l’iniezione. Una volta che un topo è incannulato, inserire l’ago nell’estremità del catetere e iniettare lentamente. Dopo l’iniezione, seguire con un piccolo lavaggio salino attraverso il catetere per assicurarsi che venga iniettata l’intera dose.NOTA: Il volume deve essere approssimativamente uguale al volume morto del catetere, che è di 50 μL per i cateteri utilizzati dagli autori.Iniettare su un pezzo di salvietta da laboratorio per raccogliere eventuali gocce di radiotracciante; includerlo quando si misura la dose residua. Registrare l’ora dell’iniezione in un quaderno di laboratorio. Rimuovere la cannula immediatamente dopo l’iniezione. Misurare la cannula, la siringa dosatrice e il tessuto utilizzando un calibratore di dose per determinare la dose residua che non è stata iniettata nel topo.Registrare l’attività e l’ora in un taccuino di laboratorio. Dopo che i topi sono stati iniettati, etichettare le loro gabbie con una scheda che indica che i topi sono radioattivi. Registrare e registrare le gabbie secondo le linee guida istituzionali. Quindi, posizionare i topi in un’area di detenzione radioattiva designata. 6. Imaging PET/TC Eseguire l’imaging PET 18-24 ore dopo l’iniezione di 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. Pesare e valutare i topi prima della scansione.NOTA: Le istruzioni per l’uso dello scanner dipendono dallo scanner in uso.Assicurarsi che la componente a raggi X dello scanner PET/CT sia riscaldata e pronta per l’acquisizione. Aprire il software di acquisizione dello scanner PET sul computer. Dal menu a discesa Investigator Login (Accesso sperimentatore ), fare clic sulle informazioni di laboratorio appropriate. Nella pagina Progetto , crea un nuovo progetto o seleziona un progetto esistente dal menu a discesa. Quando il prompt di inizializzazione appare automaticamente sullo schermo, fai clic su Home Bed e attendi che il letto torni a casa. Quindi, fai clic su Warm up CT.Assicurarsi che lo sportello di schermatura del TA sia chiuso per consentire al TA di riscaldarsi. Mentre lo scanner si sta riscaldando, segnare i topi EAE e iniettarli per via sottocutanea con 0,2-0,4 mL di soluzione salina calda nel fianco per l’idratazione. Dopo che lo scanner si è riscaldato, tornare al computer per impostare le scansioni PET per lo studio.NOTA: Questi possono essere impostati prima del giorno della scansione.Sotto l’intestazione Studi recenti , fai clic su Crea nuovo studio. Compila il nome dello studio, il protocollo, il composto e le informazioni sull’argomento.Se si esegue una PET/CT, selezionare prima Protocollo PET , quindi selezionare Protocollo CT.NOTA: In genere, una TA standard è sufficiente per la scansione del modello di mouse EAE. Una TAC dura 1 minuto e viene acquisita con binning a 2 x 2 a tensione 80 kVp, corrente 150 μA e proiezioni 720. Le immagini TC vengono ricostruite utilizzando un algoritmo di Feldkamp modificato. Per il protocollo PET, scegliere una scansione statica a 64 rame di 10-15 minuti. Se questa scansione non è già presente nell’elenco dei protocolli disponibili, aggiungerla facendo clic sulla scheda Protocolli nel menu Standard , Crea nuovo protocollo | Menu a tendina Isotopi . Se l’isotopo desiderato non è presente nell’elenco, fare clic su Altro | Aggiungi dalla libreria e aggiungi l’isotopo desiderato. Definire la durata della scansione, fare clic sul pulsante di opzione Scansione statica, assegnare un nome al protocollo e fare clic su Salva. Tornare alla scheda Studi e continuare a nominare e impostare tutte le scansioni desiderate per il giorno.NOTA: Si consiglia di impostare anche una scansione “TC Test” utilizzando solo una TAC standard per verificare il posizionamento del letto della prima scansione per garantire un posizionamento ottimale. Questa dovrebbe essere la prima scansione eseguita per lo studio. Una volta che lo scanner è pronto, anestetizzare i topi in una scatola a scomparsa per prepararli alla scansione.NOTA: In questa fase, i topi sono probabilmente molto malati; È buona norma ridurre al minimo il tempo in anestesia.Applicare il gel per gli occhi. Assicurarsi che il piano di scansione a quattro mouse sia dotato di elementi riscaldanti, come termofori o aria riscaldata, con l’isoflurano impostato su 1,5%-2% e il termoforo acceso (Figura 3). Posizionare i topi in posizione supina sul letto di scansione.Man mano che la malattia EAE progredisce, la colonna vertebrale del topo diventa gravemente curva. Scansiona i topi mentre sono sulla schiena per raddrizzare il più possibile la colonna vertebrale, migliorando l’analisi a valle. Tira delicatamente la coda del topo per aiutare a raddrizzare la colonna vertebrale. Una volta in posizione supina, fissare saldamente ogni mouse in posizione con del nastro morbido per microscopio. Usa una striscia di nastro adesivo sulla testa e un’altra delicatamente sulla pancia per ridurre al minimo il movimento dovuto alla respirazione.Registrare in un quaderno di laboratorio quale mouse si trova in quale posizione di scansione. Una volta fissati i mouse, tornare al computer di scansione per utilizzare lo scanner. Apri il menu Motion Controller . Fare clic su FOV centrale PET per spostare i topi sul piano di scansione nell’anello PET. Per la prima scansione della giornata, fare clic su CT Center FOV. Una volta in posizione, eseguire la scansione del test TC per assicurarsi che la posizione sia corretta; Ripetere fino a quando la posizione del letto non è soddisfacente.Posizionare un piccolo pezzo di nastro adesivo bianco sul letto di scansione per contrassegnare la corretta posizione del letto per il resto dello studio. Una volta che il letto è in posizione per la scansione PET, avviare la sequenza di scansione facendo clic su Esegui.Attendere che lo scanner si sposti automaticamente dall’anello PET alla TC. Controllare sempre visivamente se gli animali si sono spostati nella posizione corretta sia per la PET che per la TC. Registrare l’ora di inizio della scansione in un quaderno di laboratorio per la correzione del decadimento della dose iniettata durante l’analisi dei dati. Al termine della scansione, consentire la ricostruzione dell’immagine. Controllare i dati prima di rimuovere gli animali.NOTA: la ricostruzione OSEM (3D Ordered Subsets Expectation-Maximization) richiederà circa 5 minuti per una scansione statica. Controllare visivamente e approvare i dati, utilizzando la milza come controllo positivo poiché questo tessuto contiene un gran numero di cellule B. Rimuovere gli animali dal letto di scansione e metterli in una scatola di abbattimento riempita di isoflurano in preparazione alla perfusione e alla successiva dissezione. Ripetere i passaggi 6.5-6.12 per i topi rimanenti nello studio. Quando tutti i mouse vengono scansionati o quando si esegue la scansione di un gruppo che ha uno spazio libero nel letto di scansione, eseguire la scansione dello standard preparato al punto 4.6. 7. Dissezione per conteggio gamma ex vivo e autoradiografia Prima di sezionare, assicurarsi che tutte le provette per il conteggio gamma e la centrifuga siano state prepesate. Eseguire l’eutanasia per perfusione, come descritto in precedenza 6, con PBS e toracotomia mentre i topi vengono anestetizzatiin profondità (inalazione continua di isoflurano al 4%, 2 L/min 100% O2 ). Per rimuovere il midollo osseo, tagliare entrambi i femori all’altezza del ginocchio e del bacino. Assicurarsi che entrambe le teste siano rimosse dal femore.Mettere entrambi i femori in una provetta da centrifuga da 0,5 mL con un foro sul fondo (usando un ago da 20 G) e con il coperchio tagliato. Posizionare la provetta da 0,5 mL contenente i femori all’interno di una provetta da centrifuga da 1,5 mL con il coperchio tagliato. Metti l’intera configurazione della provetta in una mini centrifuga. Centrifugare per 4 minuti a 4.500 × g.NOTA: Il midollo osseo deve essere rimosso attraverso il foro della provetta da centrifuga da 0,5 mL e depositarsi sul fondo della provetta da centrifuga da 1,5 mL.Separare i tubi. Pesare i femori vuoti nella provetta da centrifuga da 0,5 mL. Pesare il midollo osseo nella provetta da centrifuga da 1,5 mL. Posizionare ogni provetta da centrifuga nelle provette per il conteggio della gamma. Rimuovere il cervello utilizzando pinze e forbici, avendo cura di mantenere intatto il tronco encefalico. Metti il cervello in un tubo per il conteggio gamma. Registrare il peso secco, sciacquare con PBS e tenere sul ghiaccio fino al momento del conteggio. Per rimuovere il midollo spinale, eseguire i seguenti passaggi.Rimuovere la pelle e il pelo praticando un’incisione lungo il lato dorsale dell’animale per esporre la colonna vertebrale (Figura 1). Separare la regione lombare (L) da quella cervicale (C) e toracica tagliando lungo tre piani trasversali attorno e attraverso la colonna vertebrale: alla base del collo (vertebra C1) (Figura 1D, numero 1); alla base della gabbia toracica (vertebra L1) (Figura 1D, numero 2); alla base del bacino (vertebra L5) (Figura 1D, Numero 3). Tagliare sotto la gabbia toracica (Figura 1D, numero 2). Tagliare direttamente sopra l’osso sacro per separare la regione spinale lombare. Tagliare con cura la colonna vertebrale dall’estremità pelvica fino a quando il midollo spinale lombare non è visibile (Figura 1D, numero 3). Tagliare i tessuti circostanti per isolare le regioni lombare e cervicale/toracica della colonna vertebrale (Figura 1D, numeri 4 e 5). Per espellere il midollo spinale, utilizzare una siringa con punta a scorrimento (3-10 ml) riempita con PBS. Creare un sigillo tra la siringa e la colonna vertebrale usando il pollice e l’indice.Spingere delicatamente il PBS attraverso la siringa per espellere il midollo spinale su un tampone assorbente (Figura 1E); Ripetere l’operazione per entrambe le regioni spinali. Posizionare i tessuti del midollo spinale in una provetta per il conteggio gamma. Registrare il peso secco e aggiungere PBS per assicurarsi che il tessuto sia sul fondo della provetta per evitare che si secchi. Metti il tubo sul ghiaccio fino a quando non è pronto per il conteggio. Espellere il midollo spinale cervicale/toracico dall’estremità cranica e il midollo spinale lombare dall’estremità caudale della colonna vertebrale (Figura 1E). 8. Conteggio gamma ex vivo Aprire il software del contatore gamma. Passare all’elenco di lavoro e selezionare il protocollo desiderato, ad esempio un protocollo di conteggio di 30 s per 64Cu. Preparare almeno tre standard in provette separate. Eseguirli ora per l’uso nell’analisi (passaggio 10.2). L’obiettivo è quello di replicare tre volumi e quantità di attività in tre tubi separati.NOTA: Un volume di 500 μL dà buoni risultati. Mentre l’attività sarà determinata dalla macchina utilizzata, 10 μCi generalmente funzionano bene. Collocare gli standard in un rack etichettato con il codice a barre corrispondente al protocollo desiderato da eseguire. Posizionare il rack sul contatore gamma. Dopo aver registrato i pesi degli organi, posizionare le provette contenenti gli organi sul rack per il conteggio gamma dopo le provette contenenti gli standard.NOTA: Gli organi di interesse per questo modello possono includere linfonodi assiali, sangue, midollo osseo, cervello, linfonodi cervicali, femore, cuore, fegato, midollo spinale lombare, muscoli, milza, coda e midollo spinale cervicale/toracico. Metti un rack con un codice a barre di arresto nella parte posteriore del contatore gamma. Premere il pulsante Riproduci sul computer. Se possibile, non premere Play fino a quando non ci sono più rack o organi da far funzionare per consentire a tutte le valvole di essere contate continuamente in un unico file. Assicurarsi che un rack con un codice a barre di arresto sia nella parte posteriore del contatore gamma per ogni corsa. Eseguire fino a quando tutti i campioni non sono stati contati. Salvare ed esportare il file. 9. Autoradiografia ex vivo (ARG) del tessuto del SNC Seguire i passaggi precedentemente pubblicati per l’ARG cerebrale e del midollo spinale (escludendo i passaggi 2-6 descritti da Chaney et al., poiché i topi sono già iniettati con radiotracciante dalla scansione PET)6.NOTA: Di seguito sono elencate le istruzioni specifiche per la preparazione della cassetta ARG del midollo spinale6. Dopo aver completato il conteggio gamma per il midollo spinale lombare e cervicale/toracico, posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio fino a quando tutti i tessuti del SNC non sono stati contati.NOTA: Fare riferimento al metodo precedentemente pubblicato per l’ARG del cervello6. Inclinare delicatamente i tubi per consentire al midollo spinale di cadere su un tampone assorbente. Se il midollo spinale si attacca al lato del tubo, sciacquare delicatamente con PBS freddo e inclinare nuovamente il tubo. Asciugare accuratamente ogni midollo spinale tamponando delicatamente con un fazzoletto di laboratorio. Disporre il midollo spinale essiccato in modo organizzato su uno spesso foglio di carta nero.Etichetta accanto al midollo spinale con una penna bianca per una facile identificazione. Lasciare spazio agli angoli e al centro della carta nera per posizionare pile di tre vetrini da microscopio che fungano da distanziatori per evitare la compressione del midollo spinale quando la cassetta ARG è chiusa. Usa 5-7 accumuli. Una volta che tutti i midollari lombari e cervicali/toracici sono posizionati sulla carta nera ed etichettati, posizionare con cura il pezzo di carta nella cassetta ARG. Posizionare la cassetta aperta su un vassoio di ghiaccio secco per congelare il midollo spinale. Una volta congelato, posizionare delicatamente un involucro di plastica tra lo schermo digitale per la conservazione del fosforo e il midollo spinale e posizionare lo schermo sopra i campioni. Chiudere immediatamente la cassetta e metterla nel congelatore a -20 °C per circa 10 emivite (~127 h). Al termine del tempo di esposizione, eseguire la scansione della pellicola utilizzando un imager al fosforo. Analizzare l’immagine digitale risultante (vedere la sezione 12 per le istruzioni). 10. Analisi dei dati di biodistribuzione Impostare un foglio di calcolo “Correzione della dose” per determinare matematicamente la correzione temporale per il decadimento radioattivo, normalizzando così le dosi di radiazioni e consentendo confronti tra i soggetti.Correggere tutte le dosi in base al tempo di iniezione, tenendo conto dell’attività residua rimasta nella siringa e nel catetere dopo l’iniezione. Utilizzando gli standard preparati nel passaggio 8.2, calcolare la media della quantità di attività (μCi) e dei conteggi normalizzati al minuto (CPM). Dividi il CPM medio per l’importo medio dell’attività standard per ottenere CPM/μCi.NOTA: Assicurarsi che la quantità di attività per ogni standard sia corretta per il decadimento in base al tempo in cui il contatore gamma conta il CPM degli standard. Il contatore gamma deve normalizzare tutti i valori CPM all’ora di inizio del protocollo. Impostare il foglio di calcolo “Risultati” per calcolare la percentuale finale di dose iniettata per grammo di tessuto (%ID/g) per ciascun campione.Correggere il decadimento del CPM normalizzato dal contatore gamma per ogni campione conteggiato in base al tempo di iniezione dell’animale.NOTA: La correzione del decadimento può essere in qualsiasi punto temporale; assicurarsi che tutte le dosi e i valori CPM siano corretti per il decadimento allo stesso punto temporale. Normalizzare il CPM corretto per il decadimento alla massa di ciascun campione per determinare il CPM per campione. Calcola il CPM totale iniettato sottraendo il CPM nella coda dal CPM iniettato calcolato.NOTA: La coda non deve essere corretta in massa in quanto questo valore CPM verrà semplicemente sottratto dal CPM totale iniettato per tenere conto di eventuali traccianti extravenosi dall’iniezione. Dividi il CPM per massa per il CPM totale iniettato per calcolare %ID/g. Imposta un foglio di calcolo “Riepilogo” per visualizzare i risultati finali per l’inserimento in un software grafico e la successiva visualizzazione dei dati e l’analisi statistica. 11. Analisi dell’immagine PET Aprire il software di analisi PET. leccare su File |Open Local Data | DICOM. Individuare il file desiderato (formato DICOM). Aprire sia il PET che il CT. In Data Manager, regolare il contrasto PET e CT ai livelli desiderati. Registra e ritaglia i singoli topi.Nel menu di navigazione , selezionare la scheda Riorientamento/Registrazione . Vai al menu Rigido all’interno di questa scheda. Designare la scansione TC (0 ) come scansione fissa e la scansione PET (1) come scansione in movimento . Selezionare Trasformazione rigida e Qualità rapida . Fare clic su Registrati. Al termine della registrazione (5-10 min), fare clic sul segno di spunta per salvare la registrazione. Ispeziona visivamente i dati per assicurarti che la registrazione sia andata a buon fine. Esportare la sessione cliccando su File | Sessione | Esportazione. Quindi, ritaglia ogni mouse in un ritaglio a corpo intero: vai al menu Navigazione e fai clic su Ritaglio. Trascinate verso l’interno i lati di ciascuna sezione trasversale dallo spigolo esterno. Una volta che il mouse desiderato è ben ritagliato, fare clic sul segno di spunta ed esportare la sessione per salvarla. Quindi, ritaglia e raddrizza le teste di ciascun mouse per l’analisi del cervello utilizzando la traslazione, le rotazioni e i capovolgimenti manuali nel menu Registrazione/Riorientamento . Esporta per salvare. Analizza il midollo spinale.Per iniziare l’analisi delle regioni di interesse (ROI) nel midollo spinale, aprire lo strumento ROI 3D dal menu di navigazione . Sotto l’intestazione ROI, utilizzare il segno più nella parte inferiore del menu per creare sei ROI: ROI lombare, ROI cervicale/toracica, Scheletro lombare, Scheletro toracico, Midollo spinale lombare, Midollo spinale toracico.NOTA: Le ROI lombari e cervicali/toraciche sono ROI generalizzate di grandi dimensioni che verranno utilizzate per creare le ROI dello scheletro (Figura 4). Per evitare interferenze visive dal segnale PET con questo passaggio, fare clic su F3 per disattivare il PET. Vai all’inizio dell’operatore dello strumento ROI 3D. Fare clic sul punto pieno a destra del simbolo del cursore per aprire il menu Modalità disegno 3D ed erode/dilatazione . Seleziona Sfera e modifica la dimensione a 20 pixel. Imposta Dilata su +5.Prima di procedere, vai in fondo al menu. Assicurati che il ROI lombare sia selezionato, poiché questo è il primo ROI da disegnare. Sulla TC, trova la vertebra L6 della colonna vertebrale (dove la colonna vertebrale incontra i fianchi). Partendo da una vertebra sopra L6, disegna una ROI lombare approssimativa sulle cinque vertebre sopra i fianchi (vertebre L1-L5). Quindi, passa alla ROI cervicale/toracica e traccia il resto della colonna vertebrale fino alla base del cranio.NOTA: Non è necessario che sia preciso, in quanto viene utilizzato per indicare dove deve verificarsi la soglia Otsu nel passaggio 11.4.8. Dopo aver disegnato le ROI generalizzate, vai nella parte superiore dell’operatore. Selezionare il menu Algoritmi di segmentazione . Dal menu a discesa, seleziona Otsu Thresholding. Per l’input, selezionare ROI lombare. Nella parte inferiore del menu, assicurati che sia selezionata l’opzione Scheletro lombare . Nel menu a discesa accanto a Immagine, assicurati che la scansione TC sia selezionata e fai clic su Applica. Ripetere per la ROI cervicale/toracica e lo scheletro toracico.Se la soglia Otsu non evidenzia sufficientemente la colonna vertebrale, utilizzare la soglia globale e modificare il valore Min a 350 e il valore Max a 3.500 per la soglia manuale e regolare se necessario per isolare le vertebre. Dopo aver utilizzato Otsu Thresholding per creare le ROI di scheletro, tornare al menu di navigazione (icona del cursore). Elimina o seleziona la colonna H (nascondi) per entrambe le ROI lombari e cervicali/toraciche, per nasconderle. Selezionare la colonna I (non modificabile) per entrambe le ROI dello scheletro in modo che non possano essere modificate. Infine, torna all’inizio dell’operatore dello strumento ROI 3D e vai al menu 3D Paint per disegnare le ROI del midollo spinale.Seleziona di nuovo lo strumento Sfera e traccia il midollo spinale all’interno dello scheletro sia per Lombare che per Toracico, assicurandoti che il ROI corretto sia selezionato nella parte inferiore del menu. Per cancellare qualsiasi ROI, fare clic su Comando/Controllo e disegnare sulla parte da cancellare. Controllare la ROI del midollo spinale da tutti e tre i piani per assicurarsi che non vi sia alcuna ROI disegnata al di fuori della colonna vertebrale. Esporta i risultati dell’analisi del midollo spinale.Se il segnale PET è stato disattivato nel passaggio 11.4.3, premere F3 dopo che le ROI del midollo spinale sono state disegnate per riattivare il PET, oppure selezionare il Visual Controller (VC) e fare clic sulla barra PET. Tornare al menu di navigazione (icona del cursore). Fare clic sull’icona della griglia per visualizzare la tabella. Copia la tabella nel software per fogli di calcolo e salva. Infine, esporta il file in un software di analisi PET, come descritto sopra, per salvare i ROI disegnati. Analizza il cervello utilizzando un atlante 3D semi-automatizzato.Aprire il file di ritaglio della testa. Importa l’atlante cerebrale del mouse andando al menu Moduli avanzati e selezionando lo strumento Atlante del cervello 3D. Assicuratevi che il riferimento sia impostato su CT e che l’opzione di ritaglio sia deselezionata. Impostare un percorso per la directory di output. In Impostazioni avanzate, modificare Trasforma in Versor-Affine. Mantenere tutte le altre impostazioni predefinite. Fare clic su Esegui. Regolare manualmente l’atlante nel menu Riorientamento/Registrazione e utilizzare la TC del cranio come linea guida per l’adattamento dell’atlante.Prestare molta attenzione se è necessario il ridimensionamento, in quanto ciò può influenzare notevolmente i volumi della struttura cerebrale. Fare clic sul segno di spunta al termine della regolazione. Eseguire nuovamente l’atlante con l’opzione Importa ROI 3D selezionata. Esportare il file per salvare l’atlante adattato alla testa ritagliata. Dopo aver disegnato ed esportato tutte le ROI dagli organi desiderati, calcolare un valore standard di correzione del legame. Correggere il decadimento di tutti i dati e convertirli in %ID/g come descritto in precedenza6. Normalizzare all’organo che si adatta al modello animale, come il cuore per normalizzare il radiotracciante presente nel pool sanguigno. 12. Analisi autoradiografica ex vivo Aprire il file di immagine digitale (.gel) utilizzando il software di analisi delle immagini. Regolare la luminosità e il contrasto alla soglia desiderata. Se lo si desidera, applicare una tabella di ricerca dei colori adatta.NOTA: I colori Royal o Grays sono consigliati per facilitare la visualizzazione.