הדמיה של תאי CD19⁺ B במודל ניסיוני של עכבר אנצפלומיאליטיס אוטואימונית באמצעות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים

איור 1: עיצוב המחקר. סקירה כללית של טכניקות מפתח במאמר זה. (A) הנחת העכברים במיטת הסריקה על גבם מפחיתה את התנועה בעמוד השדרה. (B) הדמיית PET/CT של העכברים. (C) בצע חתך במורד הצד הגבי של בעל החיים כדי לחשוף את עמוד השדרה. (D) חתכו את עמוד השדרה לחלקים צוואריים/חזיים ומותניים והסירו את החלקים הבאים אחרי חמשת החתכים שצוינו. (E) השתמש במזרק כדי להסיר את חוט השדרה מעמוד השדרה על ידי יצירת חותם עם המזרק ועמוד השדרה ושטיפה מהקצוות הגולגולתיים והקאודליים של עמוד השדרה כפי שמוצג. (F) מקטעי עמוד השדרה הצווארי/חזי והמותני המבודדים. קיצור: PET/CT = טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפאנל המנהלי לטיפול בחיות מעבדה (APLAC) באוניברסיטת סטנפורד, תוכנית המוכרת על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה (AAALAC International). עכברים התאקלמו בויבריום לפחות 7 ימים לפני תחילת המחקר כדי למזער את הלחץ על העכברים, מכיוון שלחץ יכול להשפיע על השראת EAE. 1. השראת EAE בנקבות עכברי CD19 מונשים יש להשרות נקבות CD19 C57BL/6J אנושיות בגילאי 9-13 שבועות עם EAE כפי שתואר קודם לכן5 באמצעות MOG1-125. 2. טיפול בבעלי חיים וניקוד במודל עכבר EAE ציון התקדמות המחלה וטיפול בעכבריםכפי שתואר קודם 5. בקצרה, ציון מודל זה בסולם של 1-5 כדלקמן: 1 הוא חולשה / צליעה זנב, 2 הוא גפיים אחוריות מוחלשות, 3 הוא שיתוק גפיים אחוריות, 4 הוא שיתוק גפיים אחוריות עם חולשת גפיים קדמיות, 5 הוא moribund. 3. צימוד mAb, תיוג רדיו ואפיון הצמידו את הכלטור הדו-תפקודי 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid mono-N-hydroxysuccinimide ester (DOTA-NHS-ester) ל-hCD19-mAb ל-radiolabel עם 64Cu.באמצעות עמודת התפלה, החלף את מאגר האחסון hCD19-mAb במאגר HEPES (pH 8.5-9): התנה את עמודות ההתפלה ב- HEPES. חישוב מספר העמודות הדרושות בהתבסס על נפח מדגם עמודת התפלה ונפח mAb נדרש: 0.5 מ”ל צינורות: 30-130 מיקרוליטר נפח מדגם, 300 מיקרוליטר שטיפה; 2 מ”ל צינורות: 200-700 μL נפח דגימה, 1 מ”ל לשטוף. מצננים את הצנטריפוגה ל-4°C לצורך החלפת חיץ דרך עמודת ההתפלה. מוציאים את עמוד ההתפלה מהמקרר. הסירו את החלק התחתון של עמודת ההתפלה, שחררו את המכסה והכניסו את העמוד לצינור איסוף. צנטריפוגה ב 1,500 × גרם למשך 2 דקות כדי להסיר את פתרון האחסון; מחק את הזרימה המכילה את פתרון האחסון ועשה שימוש חוזר בצינור האיסוף. סמן קו על העמוד שבו הנקודה הגבוהה ביותר של השרף הדחוס להתפלה מוטה כלפי מעלה. הוסף חיץ HEPES לצד התחתון של עמודת ההתפלה. מקם את עמוד ההתפלה בצנטריפוגה כשהקו פונה כלפי חוץ; יש לסחור במהירות של 1,500 × גרם למשך 2 דקות. יש להשליך את הזרימה ולעשות שימוש חוזר בצינור האיסוף. חזור על שלבים 3.1.4 ו- 3.1.5 2x באמצעות אותו צינור איסוף והשלכת הזרימה בין השלבים. מניחים את עמודת ההתפלה המותנית בצינור איסוף ותווית חדשים; צינור זה יכיל את hCD19-mAb. הוסף hCD19-mAb לחלק העליון של עמודות ההתפלה המותנות והשתמש במאגר HEPES כדי לשטוף את בקבוקון ה- mAb הריק; הוסף זאת לראש עמודת ההתפלה (נפח כולל לפי המלצת היצרן). סובב ב 1,500 × גרם במשך 2 דקות כדי ללוטש את hCD19-mAb. שמור על הזרימה המכילה את hCD19-mAb. מדוד את הריכוז של hCD19-mAb באמצעות ספקטרופוטומטר UV/Vis והתאם ל- 0.5 מיקרוגרם / μL עם חיץ HEPES במידת הצורך. לתמיסת hCD19-mAb, הוסף 1/50 הנפח של תמיסת mAb של 0.5 M EDTA כדי להפוך את הריכוז הסופי של EDTA ל- 0.01 M בתמיסת hCD19-mAb. תן לתמיסת hCD19-mAb-EDTA לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מוציאים את DOTA-NHS-ester מהמקפיא ומאפשרים לו להגיע לטמפרטורת החדר (10-15 דקות). חשב את נפח ה- DMSO כדי להוסיף ל- DOTA-NHS-ester כדי ליצור ריכוז DOTA שיאפשר הוספה של היחס המולרי הרצוי של DOTA/mAb (שהוא בדרך כלל בסדר גודל של 1-2 DOTA/mAb).הערה: נפח DMSO-DOTA-NHS-ester שנוסף ל- hCD19-mAb לא יעלה על 10% מנפח mAb. זה צריך להיעשות באמצעות גיליון אלקטרוני, כך שזה יכול להיעשות במהירות שוב ושוב. בהתבסס על היחס הרצוי של DOTA ל- hCD19-mAb, חשב את כמות DOTA-NHS-ester להוסיף ל- hCD19-mAb.nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → מ”ג DOTA → מ”ג/מ”ל DOTA/DMSO → מ”ל DMSO גורם דילול → של תמיסת DOTA/DMSO לשקול 1-2 מ”ג של DOTA-NHS-ester, ובזהירות להוסיף את הנפח הנכון (מחושב בשלב 3.1.11) של DMSO ל- DOTA-NHS-ester; מערבבים ומסובבים. פיפטה נפח מחושב של פתרון DOTA-NHS-ester (שלב 3.1.12) לתוך פתרון hCD19-mAb; נגבו את החלק החיצוני של קצה הפיפט לפני ההוספה כדי להבטיח שלא יתווסף DOTA-NHS-ester נוסף (מבלי לשנות את הכמות בפיפטה). מערבבים ומסובבים בעדינות. מכניסים למקרר (4°C) לתגובה למשך הלילה (12-16 שעות). טיהור וריכוזמצננים את הצנטריפוגה ל -4 מעלות צלזיוס עבור שלבי החלפת החיץ של הרכז הצנטריפוגלי; הניחו בלוק צינור PCR מתכתי על קרח יבש להקפאת הצמדה. הסר את תגובת DOTA-hCD19-mAb מהמקרר ומרווה על ידי הוספת מאגר TRIS בדרגה ביולוגית: 10% מנפח התגובה הכולל. הסר 10-20 מיקרוגרם מהדגימה לניתוח ספקטרומטריית מסות. התנה את עמודות ההתפלה כמתואר לעיל (שלבים 3.1.1-3.1.5), באמצעות מאגר אמוניום אצטט 0.1 M, pH 5.5. מאגר להחליף את תמיסת DOTA-hCD19-mAb לאמוניום אצטט (שלבים 3.1.1-3.1.8). רכז את תמיסת DOTA-hCD19-mAb: הוסף את התמיסה לרכז צנטריפוגלי בעל חיתוך משקל מולקולרי של 50 kDa בהתאם להמלצות היצרן לגבי נפח. צנטריפוגה בעוצמה של 4,000 × גרם למשך 10 דקות (או עד להפחתת הנפח ב-80%-90%); מחק את הזרימה. חזרו על הפעולה תשע פעמים נוספות (10 בסך הכל): הוסיפו מספיק אמוניום אצטט כדי להחזיר את עוצמת הקול לנפח המרבי המומלץ.הערה: הסכום הכולל צריך להיות מה שנוסף בתחילה, כולל מה שנשאר בעמודה, בדרך כלל 400-450 μL עבור רכז צנטריפוגלי קיבולת 500 μL.שטוף את בקבוקון התגובה עם מאגר אמוניום אצטט כדי לאחזר כל שארית DOTA-hCD19-mAb; מוסיפים את הכביסה לרכז הצנטריפוגלי. צנטריפוגה בעוצמה של 4,000 × גרם למשך 10 דקות.הערה: זמן הסחיטה עשוי להתקצר בסיבובים הבאים אם עוצמת הקול מופחתת ל- 80%-90% בפחות זמן. הסר את תמיסת החלבון מהרכז הצנטריפוגלי. שים לב לאמצעי האחסון הכולל של DOTA-hCD19-mAb.ברכז צנטריפוגלי 2, מוסיפים מספיק חיץ אמוניום אצטט לנפח כולל של 100 μL ופיפטה לערבוב. מכסים את עמוד הרכז הצנטריפוגלי והופכים אותו. סובבים ב 4,000 × גרם במשך 2 דקות כדי לאסוף את התמיסה. מעבירים לצינור חדש. ברכז צנטריפוגלי 500, השתמש בפיפט כדי לאסוף את תמיסת mAb מהרכז הצנטריפוגלי; הוסף לצינור חדש. מדוד את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis. אם הריכוז הוא מעל 2 מ”ג / מ”ל, לדלל עם אמוניום אצטט ל 2 מ”ג / מ”ל. Aliquot 100 מיקרוגרם לכל צינור PCR (כ 50 μL); תייגו את הצינורות עם DOTA-hCD19-mAb, תאריך, מסה וריכוז. סובבו את הבקבוקונים. הצמד להקפיא את DOTA-hCD19-mAb על בלוק PCR צונן על קרח יבש (או להקפיא על קרח יבש). לאחר שכל הדגימות קפואות, הכניסו אותן למקפיא בטמפרטורה של -80°C. מדוד את מספר DOTA לכל hCD19-mAb לפי ספקטרומטריית מסות. שמור דגימה של נוגדן לא מצומד (טהור) מכל צימוד כדי לחשב את היחס. השתמש במשוואה (1) המפורטת להלן; המשקל המולקולרי מקוצר MW.(1) תיוג רדיוהערה: יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים לטיפול ברדיואקטיביות, כולל מעיל מעבדה, כפפות ודוזימטרים אישיים לגוף ולטבעת, בהתאם לתקנות המוסדיות. יש לסקור ולהחליף כפפות באופן קבוע כדי למנוע זיהום רדיואקטיבי. השתמש במיגון עופרת והגדל את המרחק מהמקור הרדיואקטיבי על ידי טיפול במלקחיים במידת האפשר.העברת רדיואקטיביות מבקבוקון המשלוח לבקבוקון חדש באמצעות פיפטה. למדוד את הרדיואקטיביות. הסר aliquot עבור תגובת התיוג הרדיואקטיבי הראשונה. הוסף 50 μL של אמוניום אצטט (pH 5.5) לכל 1 mCi של 64Cu-CuCl3. מדוד את ה- pH על ידי פיפטציה של 1 μL על רצועת pH עם טווח שלוכד 5.5 עם רזולוציה מספקת כדי להבחין בין 5 ל -6. אם ה- pH אינו 4-5.5, שנה אותו באמצעות 1 M NaOH או 0.1 M HCl. הוסף כמויות קטנות, 1-5 μL, של 1 M NaOH אם ה- pH נמוך מ- 4 או 0.1 M HCl אם ה- pH גדול מ- 5.5 עד שתגיע ל- pH הנכון. עם כל תוספת, מערבבים היטב, מסובבים כלפי מטה ומודדים את רמת החומציות כמתואר לעיל. שים לב לכל הוספה והסרה של כל פתרון (כולל בדיקת ה- pH) כדי שניתן יהיה לחשב את הנפח הסופי. לאחר השגת ה- pH האופטימלי, הוסף 10 מיקרוגרם של DOTA-hCD19-mAb לכל 1 mCi של 64Cu-CuCl3. מערבבים בעדינות ומסובבים לזמן קצר. הניחו את בקבוקון התגובה על תרמומיקסר, כוונו לטמפרטורה של 37°C ו-400 סיבובים לדקה (סל”ד). לאחר 30 דקות, הרוו את התגובה: חלקו את נפח התגובה הכולל ב-50, והוסיפו נפח של 0.5 M EDTA לתערובת התגובה. קבע את יעילות ההתוויה באמצעות כרומטוגרפיה מיידית של שכבה דקה (ITLC) כדי למדוד את אחוז הנחושת המאוגדת והחופשית בתמיסה.גזור רצועות נייר TLC ברוחב 1 ס”מ. סמן 1 ס”מ מהחלק העליון והתחתון של הרצועה והכן צינור (50 מ”ל צלוחיות חרוטיות) עם פאזה ניידת פחות מ 1 ס”מ של 0.1 מ ‘חומצת לימון (רמת הפאזה הניידת צריכה להיות מתחת לסימן 1 ס”מ על הרצועה כאשר היא ממוקמת בצינור). פיפטה 1 μL של תמיסת התגובה על הרצועה בסימן 1 ס”מ התחתון (חזית ממס) ומניחים את הרצועה בצינור. צפו עד שחזית הממס תגיע ל-1 ס”מ העליון, הסירו את הרצועה ועטפו אותה בחתיכת ניילון נצמד. הניחו את הרצועה על הפלטפורמה והעבירו אותה דרך סורק הדמיה רדיו-TLC. חפשו את mAb המסומן ברדיו במקור ו-64Cu חופשי שנע עם חזית הפאזה הניידת (איור 2). אם אחוז הנחושת החופשית נמוך מ-5% (יעילות סימון של 95%), יש להמשיך בהזרקה לבעלי חיים. אם אחוז הנחושת החופשית גדול מ -5%, המשך בטיהור.הערה: אחוז הנחושת החופשית תלוי בדרך כלל ביחס של DOTA-mAb ל- 64Cu, זמן תגובה, pH וטמפרטורה. תנאי התגובה צריכים להיות ממוטבים על ידי כל משתמש עבור כל mAb חדש כדי להבטיח תוצאות עקביות. טיהור באמצעות עמוד כבידה חד פעמי בדרגת DNAהתניית עמודת זרימת כבידה חד-פעמית בדרגת DNA (עמודת התפלה/החלפת חיץ) בהתאם להוראות היצרן. הניחו את עמוד הכבידה החד-פעמי בדרגת DNA על מעמד טבעת או מכשיר אחר מאחורי מיגון עופרת הולם; ודא שהמנגנון יציב וניתן להזזה בקלות. הניחו את הצינור מתחת לעמודה. פיפטה תערובת התגובה הגסה על שרף עמוד זרימת הכבידה. חכו עד שכל הנוזלים יזרמו לתוך השרף. פיפטה מספיק PBS כדי להביא את כל נפח (מוצר גולמי בתוספת PBS) ל 500 μL. להיפטר זרימה. מניחים את העמוד מעל צינורות צנטריפוגות בנפח 1.5 מ”ל המסומנים 1-10. הוסף 1 מ”ל של PBS לעמודה. יש לטפטף חמש טיפות בכל צינור עד להפסקת הזרימה.הערה: ייתכן שיידרשו פחות מ-10 צינורות. מכסים את תחתית העמודה ומודדים את שאריות הרדיואקטיביות. מדדו כל בקבוקון עם זרימה. עבור כל בקבוקון עם יותר מ- 50 μCi, הכינו ITLC לכל שלב 3.3.7 כדי למדוד את אחוז הנחושת הקשורה בכל שבר.הערה: השבר הראשון או שניים יכילו פאזה ניידת בלבד; ה-mAb המסומן ברדיו ילוט ראשון (בדרך כלל שברים 2 או 3 עד 5 או 6) וה-64Cu החופשי ייצמד אחרון (חלקם יידבקו לעמודה). אחוז החסימה 64Cu עשוי להשתנות בין שברים. שלב את השברים עם כריכה גדולה מ 95% (פחות מ 5% נחושת חופשית); השתמש בתמיסה להזרקה. אם תרצה, בצע HPLC ללא גודל כדי לאשר תיוג רדיו5 ולחשב את הפעילות המולרית. שמור aliquot כדי למדוד את הריכוז על ספקטרופוטומטר UV-Vis לאחר שהוא נרקב 10 זמן מחצית החיים (127 שעות או 5.3 ימים). 4. הכנת מינון הערה: לפני הטיפול במינון, יש ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים, כולל מעיל מעבדה, דוזימטרים לגוף ולאצבעות וכפפות. יש להזריק 64Cu-DOTA-hCD19-mAb 18-24 שעות לפני סריקת PET, כדי לאפשר זרימת דם נאותה של הרדיוטרייסר בגוף. הניחו מיד את מיכל העופרת עם 64Cu-DOTA-hCD19-mAb מאחורי מיגון עופרת. הפעל את מונה גייגר כדי לפקח על זיהום פוטנציאלי.הערה: יש להחליף כפפות לעתים קרובות בעת טיפול בחומר רדיואקטיבי. מומלץ להשתמש בכפפה כפולה בזמן נטילת מינונים כדי להקל על החלפת כפפות מהירה. הניחו תמיד את החדים והאשפה המזוהמים באזור האשפה הייעודי והממוגן. יש לדלל את 64Cu-DOTA-hCD19-mAb לריכוז מתאים בצינור צנטריפוגת פלסטיק 1.5 מ”ל בעל קישור נמוך.הערה: 64Cu-DOTA-hCD19-mAb ייקשר לפלסטיק אם הוא אינו קשור נמוך; 64Cu ייקשר לזכוכית.לדלל את radiotracer במי מלח כדי למנוע רדיוליזה ולפשט ציור מינונים עקביים. להכין מינונים לנהל בין 75 ל 150 μCi ב 100 μL, אם אפשר. ודא שהנפח הכולל המרבי של ההזרקה אינו עולה על 10% ממשקל הגוף של העכבר. השתמש מזרק אינסולין 500 μL (50 cc) כדי למשוך את המינון מתוך צינור פלסטיק קישור נמוך. ודא שאין בועות במזרק שכן הוא יוזרק תוך ורידי.תייגו מראש את המזרקים עם מספרי בעלי החיים המתאימים. רשום את פעילות המינון והזמן במחברת מעבדה לצורך ניתוח נתונים. הכינו את המינונים להזרקה ברגע שבעלי החיים עוברים צנתור כדי להפחית את זמן ההרדמה. לאחר הכנת המנות, הכינו תקן (פנטום) לסריקה כדי ליצור גורם כיול.מלא צינור חרוטי 15 מ”ל עם 50-75 μCi של פעילות מדולל במים (או PBS).הערה: ודא ערבוב יסודי של התמיסה. התקן יכול להיות ללא 64Cu שנותרו מהתוויה.מדוד את כמות הפעילות בתקן ותעד את השעה. 5. קנולציה והזרקה הערה: ראה שיטות 6 שתוארו קודם לכן לקנולציה תוך ורידית של עכברים להזרקת הרדיוטרייסר6. לשקול ולדרג את העכברים לפי חומרת המחלה כמתואר בסעיף 2.1 לפני הרדמת עכברים בקופסת הרדמה מלאה באיזופלורן 1.5-3% כהכנה למתן רדיוטרייסרים.הערה: עכברים אלה יוזרקו על ראש הספסל, ולא על סורק PET כפי שתואר קודם לכן. אין צורך להדביק את הצנתרים במקום להזרקה, מכיוון שהעכברים לא יועברו בין קנולציה להזרקה. ברגע שעכבר משומר, מכניסים את המחט לקצה הצנתר ומזריקים לאט. לאחר ההזרקה, יש להמשיך עם סומק מלח קטן דרך הצנתר כדי לוודא שהמינון כולו מוזרק.הערה: הנפח צריך להיות שווה בקירוב לנפח המת של הצנתר, שהוא 50 μL עבור הצנתרים המשמשים את המחברים.להזריק מעל חתיכת מגבון מעבדה כדי לאסוף כל טפטופים של radiotracer; כלול זאת בעת מדידת המינון השיורי. רשום את זמן ההזרקה במחברת מעבדה. מוציאים את הצינורית מיד לאחר ההזרקה. מדוד את הצינורית, מזרק המינון והרקמה באמצעות כיול מינון כדי לקבוע את המינון השיורי שלא הוזרק לעכבר.רשום את הפעילות והשעה במחברת מעבדה. לאחר הזרקת העכברים, תייגו את הכלובים שלהם בכרטיס כלוב המציין שהעכברים רדיואקטיביים. יש לתעד ולתעד את הכלובים בהתאם להנחיות המוסדיים. לאחר מכן, הניחו את העכברים באזור החזקה רדיואקטיבי ייעודי. 6. הדמיית PET/CT בצע הדמיית PET 18-24 שעות לאחר הזרקת 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. שקלו והניקוד של העכברים לפני הסריקה.הערה: הוראות ההפעלה של הסורק תלויות בסורק שבו נעשה שימוש.ודא שרכיב הרנטגן בסורק PET/CT מחומם ומוכן לרכישה. פתח את תוכנת רכישת סורק PET במחשב. בתפריט הנפתח כניסת חוקר , לחץ על פרטי המעבדה המתאימים. בדף פרוייקט, צור פרוייקט חדש או בחר פרוייקט קיים מהתפריט הנפתח . כאשר בקשת האתחול מופיעה באופן אוטומטי על המסך, לחץ על מיטת בית והמתן למיטה הביתה. לאחר מכן, לחץ על חימום CT.ודא שדלת המיגון של ה-CT סגורה כדי לאפשר ל-CT להתחמם. בזמן שהסורק מתחמם, הבקיעו את עכברי EAE והזריקו להם תת עורית עם 0.2-0.4 מ”ל מלח חם באגף ללחות. לאחר חימום הסורק, חזור למחשב כדי להגדיר את סריקות ה-PET עבור המחקר.הערה: ניתן להגדיר אותם לפני יום הסריקה.תחת הכותרת מחקרים אחרונים , לחץ על צור מחקר חדש. מלא את שם המחקר, פרוטוקול, תרכובת ומידע על הנושא.אם אתה מבצע PET/CT, בחר תחילה פרוטוקול PET ולאחר מכן בחר פרוטוקול CT.הערה: בדרך כלל, CT סטנדרטי מספיק לסריקת מודל העכבר EAE. סריקת CT היא באורך של דקה אחת ונרכשת עם בינינג ב 2 x 2 במתח 80 kVp, זרם 150 μA ו 720 הקרנות. תמונות CT משוחזרות באמצעות אלגוריתם פלדקאמפ שונה. עבור פרוטוקול PET, בחר סריקה סטטית של 10-15 דקות של 64 נחושת. אם סריקה זו עדיין אינה מופיעה ברשימת הפרוטוקולים הזמינים, הוסף אותה על-ידי לחיצה על הכרטיסייה פרוטוקולים בתפריט רגיל , צור פרוטוקול חדש | תפריט נפתח איזוטופים . אם האיזוטופ הרצוי אינו מופיע ברשימה, לחץ על עוד | מוסיפים מהספרייה ומוסיפים את האיזוטופ הרצוי. הגדר את משך הסריקה, לחץ על כפתור הבחירה לסריקה סטטית, תן שם לפרוטוקול ולחץ על שמור. חזור לכרטיסייה מחקרים והמשך לתת שם ולהגדיר את כל הסריקות הרצויות ליום.הערה: מומלץ גם להגדיר סריקת “CT Test” אחת באמצעות CT סטנדרטי בלבד כדי לבדוק את מיקום המיטה של הסריקה הראשונה כדי להבטיח מיקום אופטימלי. זו אמורה להיות הסריקה הראשונה שתתבצע עבור המחקר. ברגע שהסורק מוכן, הרדימו את העכברים בקופסת הרדמה כדי להכין אותם לסריקה.הערה: בשלב זה, העכברים ככל הנראה חולים מאוד; מומלץ למזער את הזמן תחת הרדמה.יש למרוח ג’ל עיניים. ודאו שמיטת הסריקה בעלת ארבעת העכברים מצוידת בגופי חימום, כגון כריות חימום או אוויר מחומם, כאשר איזופלורן מכוון ל-1.5%-2% וכרית חימום מופעלת (איור 3). הניחו את העכברים במצב שכיבה על מיטת הסריקה.ככל שמחלת EAE מתקדמת, עמוד השדרה של העכבר מתעקל קשות. סרוק את העכברים בזמן שהם על גבם כדי ליישר את עמוד השדרה ככל האפשר, ולשפר את הניתוח במורד הזרם. משוך בעדינות את זנב העכבר כדי לסייע ביישור עמוד השדרה. ברגע שאתה במצב שכיבה, הדביק היטב כל עכבר למקומו באמצעות סרט מיקרוסקופ רך. השתמש ברצועה אחת של סרט מעל הראש ועוד בעדינות מעל הבטן כדי למזער את התנועה עקב נשימה.רשום במחברת מעבדה איזה עכבר נמצא באיזו עמדת סריקה. לאחר אבטחת העכברים, חזור למחשב הסורק כדי להפעיל את הסורק. פתח את תפריט בקר תנועה . לחצו על PET Center FOV כדי להעביר את העכברים על מיטת הסריקה לתוך טבעת ה-PET. לסריקה הראשונה של היום, לחץ על CT Center FOV. לאחר המיקום, הפעל את סריקת בדיקת ה- CT כדי לוודא שהתנוחה נכונה; חזרו על הפעולה עד שתנוחת המיטה משביעת רצון.הניחו פיסת סרט לבן קטנה על מיטת הסריקה כדי לסמן את מיקום המיטה הנכון לשארית חדר העבודה. לאחר שהמיטה מונחת במקומה לסריקת PET, התחל את רצף הסריקה על ידי לחיצה על הפעל.המתן עד שהסורק יעבור אוטומטית מטבעת ה-PET ל-CT. בדקו תמיד ויזואלית אם בעלי החיים עברו לתנוחה המתאימה הן ל-PET והן ל-CT. רשום את זמן תחילת הסריקה במחברת מעבדה לתיקון ריקבון של המינון המוזרק במהלך ניתוח הנתונים. לאחר השלמת הסריקה, אפשרו לתמונה להיבנות מחדש. בדוק את הנתונים לפני הסרת בעלי החיים.הערה: שחזור תת-קבוצות מסודרות בתלת-ממד של ציפייה-מקסום (OSEM) יימשך כ-5 דקות לסריקה סטטית. בדוק חזותית ואשר את הנתונים, תוך שימוש בטחול כבקרה חיובית מכיוון שרקמה זו מכילה מספר רב של תאי B. הוציאו את בעלי החיים ממיטת הסריקה והניחו אותם בקופסת הדחה מלאה באיזופלורן כהכנה לזילוח ולנתיחה שלאחר מכן. חזור על שלבים 6.5-6.12 עבור העכברים הנותרים במחקר. כאשר כל העכברים נסרקים או בעת סריקת קבוצה שיש לה מקום פתוח במיטת הסריקה, סרוק את התקן שהוכן בשלב 4.6. 7. דיסקציה לספירת גמא ex vivo ואוטורדיוגרפיה לפני הניתוח, ודא שכל צינורות ספירת הגמא והצנטריפוגות נשקלו מראש. בצע המתת חסד באמצעות זילוח, כפי שתואר קודם לכן6, עם PBS ו thoracotomy כאשר העכברים מורדמים עמוק (שאיפה מתמשכת של 4% isoflurane, 2 L / min 100% O2). כדי להסיר את מח העצם, לחתוך את שתי הירכיים בברך ובאגן. יש לוודא ששני הראשים מוסרים מעצם הירך.מניחים את שתי עצם הירך בצינור צנטריפוגה של 0.5 מ”ל שיש לו חור בתחתית (באמצעות מחט 20 גרם) והמכסה שלו נחתך. מניחים את צינור ה-0.5 מ”ל המכיל את עצם הירך בתוך צינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ”ל עם חיתוך המכסה. מקם את כל מערך הצינור בצנטריפוגה קטנה. יש לסחור במשך 4 דקות במהירות של 4,500 × גרם.הערה: יש לעקור את מח העצם דרך החור בצינור הצנטריפוגה 0.5 מ”ל ולהתיישב בתחתית צינור הצנטריפוגה 1.5 מ”ל.מפרידים את הצינורות. שוקלים את עצם הירך הריקה בצינור הצנטריפוגה 0.5 מ”ל. שוקלים את מח העצם בצינור הצנטריפוגה 1.5 מ”ל. מניחים כל צינור צנטריפוגה בצינורות ספירת גמא. הסר את המוח באמצעות מלקחיים ומספריים, תוך הקפדה על גזע המוח שלם. הכניסו את המוח לצינור ספירת גמא. רשמו את המשקל היבש, שטפו עם PBS ושמרו על קרח עד לספירה. כדי להסיר את חוט השדרה, בצע את השלבים הבאים.הסירו את העור והפרווה על-ידי ביצוע חתך במורד הצד הגבי של החיה כדי לחשוף את עמוד השדרה (איור 1). הפרידו את האזור המותני (L) מאזור צוואר הרחם (C) ומאזור בית החזה על-ידי חיתוך לאורך שלושה מישורים רוחביים סביב עמוד השדרה ודרכו: בבסיס הצוואר (חוליית C1) (איור 1D, מספר 1); בבסיס כלוב הצלעות (חוליית L1) (איור 1D, מספר 2); בבסיס האגן (חוליה L5) (איור 1D, מספר 3). חתכו מתחת לכלוב הצלעות (איור 1D, מספר 2). יש לחתוך ישירות מעל עצם העצה כדי להפריד את אזור עמוד השדרה המותני. חתכו בזהירות את עמוד השדרה מקצה האגן עד שחוט השדרה המותני נראה לעין (איור 1D, מספר 3). חתכו את הרקמות שמסביב כדי לבודד את האזורים המותניים וצוואר הרחם/בית החזה בעמוד השדרה (איור 1D, מספרים 4 ו-5). כדי לגרש את חוט השדרה, השתמש במזרק קצה החלקה (3-10 מ”ל) מלא PBS. צור אטם בין המזרק לעמוד השדרה באמצעות האגודל והאצבע.דחפו בעדינות את PBS דרך המזרק כדי לגרש את חוט השדרה אל פד סופג (איור 1E); חזור על הפעולה עבור שני אזורי עמוד השדרה. הניחו את רקמות חוט השדרה בצינור ספירת גמא. רשום את המשקל היבש והוסף PBS כדי לוודא שהרקמה נמצאת בתחתית הצינור כדי למנוע התייבשות. מניחים את הצינור על קרח עד שהוא מוכן לספירה. גרשו את חוט השדרה הצווארי/החזי מקצה הגולגולת ואת חוט השדרה המותני מהקצה הקאודלי של עמוד השדרה (איור 1E). 8. ספירת גמא Ex vivo פתח את תוכנת מונה הגמא. נווט לרשימת העבודה ובחר את הפרוטוקול הרצוי, כגון פרוטוקול ספירה של 30 שניות עבור 64Cu. הכינו לפחות שלושה תקנים בצינורות נפרדים. הפעל אותם כעת לשימוש בניתוח (שלב 10.2). המטרה היא ליצור שלושה נפחים וכמויות פעילות משוכפלים בשלושה צינורות נפרדים.הערה: נפח של 500 μL נותן תוצאות טובות. בעוד הפעילות תיקבע על ידי המכונה בשימוש, 10 μCi בדרך כלל עובד טוב. מקם את התקנים בארון תקשורת המסומן בברקוד המתאים לפרוטוקול הרצוי להפעלה. הניחו את המדף על מונה גמא. לאחר רישום משקלי האיברים, הניחו את הצינורות המכילים את האיברים על מדף ספירת הגמא אחרי הצינורות המכילים את התקנים.הערה: איברים בעלי עניין עבור מודל זה יכולים לכלול בלוטות לימפה ציריות, דם, מח עצם, מוח, בלוטות לימפה צוואריות, עצם הירך, לב, כבד, חוט השדרה המותני, שרירים, טחול, זנב וחוט השדרה הצווארי/חזי. שים מתלה עם ברקוד עצירה בחלק האחורי של מונה הגמא. לחץ על לחצן הפעל במחשב. במידת האפשר, אל תלחץ על הפעל עד שיש להפעיל מספר ארונות תקשורת או איברים כדי לאפשר ספירה רציפה של כל הצינורות בקובץ אחד. ודא שארון תקשורת עם ברקוד עצירה נמצא בחלק האחורי של מונה הגמא עבור כל ריצה. הפעל עד שכל הדגימות ייספרו. שמור וייצא את הקובץ. 9. אוטורדיוגרפיה Ex vivo (ARG) של רקמת CNS בצע את השלבים שפורסמו בעבר עבור ARG הן במוח והן בחוט השדרה (תוך אי הכללת שלבים 2-6 שתוארו על ידי צ’ייני ואחרים, מכיוון שהעכברים כבר מוזרקים עם רדיוטרייסר מסריקת PET)6.הערה: הוראות ספציפיות להכנת קלטת ARG חוט השדרה מפורטות כאן6. לאחר השלמת ספירת הגמא עבור חוטי השדרה המותניים וצוואר הרחם/בית החזה, הניחו מיד את הצינורות על קרח עד שכל רקמות מערכת העצבים המרכזית נספרו.הערה: עיין בשיטה שפורסמה בעבר עבור ARG של המוח6. הטו בעדינות את הצינורות כדי לאפשר לחוט השדרה ליפול החוצה על פד סופג. אם חוט השדרה נדבק לצד הצינור, שטפו בעדינות עם PBS קר והטו את הצינור שוב. יבש בזהירות כל חוט שדרה על ידי ניקוי עדין עם רקמת מעבדה. הניחו את חוטי השדרה המיובשים בצורה מסודרת על פיסת נייר שחורה ועבה.יש להדביק תווית ליד חוט השדרה בעט לבן לזיהוי קל. השאירו מקום בפינות ובאמצע הנייר השחור כדי להניח ערימות של שלוש שקופיות מיקרוסקופ שישמשו כספייסרים כדי למנוע דחיסה של חוטי השדרה כאשר קלטת ARG סגורה. יש להשתמש ב-5-7 ערימות. לאחר שכל חוטי השדרה המותניים וצוואר הרחם/בית החזה ממוקמים על הנייר השחור ומסומנים, הניחו בזהירות את פיסת הנייר בקסטת ARG. הניחו את הקלטת הפתוחה על מגש קרח יבש כדי להקפיא את חוטי השדרה. לאחר ההקפאה, הניחו בעדינות ניילון נצמד בין מסך אחסון הזרחן הדיגיטלי לבין חוטי השדרה והניחו את המסך על גבי הדגימות. סגור מיד את הקלטת והנח אותה במקפיא -20 ° C למשך כ -10 מחצית חיים (~ 127 שעות). לאחר השלמת זמן החשיפה, סרוק את סרט הצילום באמצעות מצלמת זרחן. נתח את התמונה הדיגיטלית המתקבלת (עיין בסעיף 12 לקבלת הוראות). 10. ניתוח נתוני התפלגות ביולוגית הגדר גיליון אלקטרוני “תיקון מנה” כדי לקבוע מתמטית את תיקון הזמן עבור הדעיכה הרדיואקטיבית, ובכך לנרמל את מנות הקרינה ולאפשר השוואה בין נבדקים.תיקון כל המינונים לזמן ההזרקה, תוך התחשבות בפעילות השיורית שנותרה במזרק ובקטטר לאחר ההזרקה. באמצעות התקנים שהוכנו בשלב 8.2, ממוצע כמות הפעילות (μCi) וספירה מנורמלת לדקה (CPM). חלק את העלות הממוצעת לקליק בכמות הפעילות הסטנדרטית הממוצעת כדי לקבל CPM/μCi.הערה: ודא שכמות הפעילות עבור כל תקן מתוקנת עד למועד שבו מונה הגמא סופר את העלות לאלף של התקנים. מונה הגמא אמור לנרמל את כל ערכי CPM לזמן ההתחלה של הפרוטוקול. הגדר את הגיליון האלקטרוני “תוצאות” כדי לחשב את האחוז הסופי של המינון המוזרק לגרם של רקמה (%ID/g) עבור כל דגימה.ריקבון – תקן את ה- CPM המנורמל ממונה הגמא עבור כל דגימה שנספרת לזמן ההזרקה של החיה.הערה: תיקון ריקבון יכול להיות בכל נקודת זמן; ודא שכל המינונים וערכי CPM מתוקנים לאותה נקודת זמן. נרמל את ה- CPM המתוקן בדעיכה למסה של כל דגימה כדי לקבוע את ה- CPM לכל דגימה. חשב את סך ה- CPM המוזרק על-ידי הפחתת ה- CPM בזנב מה- CPM המוזרק המחושב.הערה: אין צורך לתקן את הזנב באופן המוני מכיוון שערך CPM זה פשוט יופחת מסך ה- CPM המוזרק כדי לקחת בחשבון כל נותב חיצוני מההזרקה. חלק את ה-CPM למסה בסך ה-CPM המוזרק כדי לחשב %ID/g. הגדר גיליון אלקטרוני “סיכום” כדי להציג את התוצאות הסופיות עבור קלט בתוכנת גרפים ולאחר מכן תצוגה חזותית של נתונים וניתוח סטטיסטי. 11. ניתוח תמונות PET פתח את תוכנת ניתוח PET. ללקק בקובץ |פתח נתונים מקומיים | דיקום. אתר את הקובץ הרצוי (פורמט DICOM). פתח גם את ה-PET וגם את ה-CT. במנהל הנתונים, התאם את ניגודיות ה- PET וה- CT לרמות הרצויות. רשום וחתוך עכברים בודדים.בתפריט ניווט , בחר בכרטיסיה כיוון מחדש/רישום . עבור אל תפריט קשיח בכרטיסייה זו. הגדר את סריקת ה- CT (0) כסריקה הקבועה ואת סריקת ה- PET (1) כסריקה הנעה. בחר Rigid Transformation and Fast Quality. לחץ על הרשמה. לאחר השלמת ההרשמה (5-10 דקות), לחץ על סימן הביקורת כדי לשמור את ההרשמה. בדוק חזותית את הנתונים כדי לוודא שההרשמה הצליחה. ייצא את ההפעלה על ידי לחיצה על קובץ | מושב | ייצוא. לאחר מכן, חתוך כל עכבר בחיתוך גוף מלא: עבור לתפריט ניווט ולחץ על חיתוך. גרור את הצדדים של כל חתך רוחב מהקצה החיצוני כלפי פנים. לאחר חיתוך העכבר הרצוי בחוזקה, לחץ על סימן הביקורת וייצא את ההפעלה כדי לשמור. לאחר מכן, חתוך ויישר את הראשים של כל עכבר לצורך ניתוח המוח באמצעות התרגום הידני, סיבובים והטלות בתפריט רישום/כיוון מחדש . יצא כדי לשמור. לנתח את חוט השדרה.כדי להתחיל בניתוח אזורי עניין (ROI) בחוט השדרה, פתח את כלי החזר ההשקעה התלת-ממדי מתפריט הניווט . תחת הכותרת החזר השקעה, השתמש בסימן הפלוס בתחתית התפריט כדי ליצור שישה ROIs: החזר השקעה מותני, ROI צוואר הרחם/חזה, שלד מותני, שלד בית החזה, חוט השדרה המותני, חוט השדרה החזי.הערה: ROI מותני וצוואר הרחם/חזה הם ROI גדולים כלליים שישמשו ליצירת ROI השלד (איור 4). כדי למנוע הפרעה חזותית מהאות של הבחינה הפסיכומטרית בשלב זה, לחצו על F3 כדי לכבות את הבחינה הפסיכומטרית. עבור לחלק העליון של מפעיל כלי החזר ההשקעה בתלת-ממד. לחץ על הנקודה המלאה מימין לסמל הסמן כדי לפתוח את תפריט מצב צביעה תלת-ממדי ותפריט שחיקה/הרחבה . בחר כדור ושנה את הגודל ל- 20 פיקסלים. הגדר את הרחבה ל – +5.לפני שתמשיך, עבור לתחתית התפריט. ודא שההחזר על ההשקעה המותני נבחר, מכיוון שזהו החזר ההשקעה הראשון שנמשך. ב- CT, מצא את חוליית L6 של עמוד השדרה (היכן שעמוד השדרה פוגש את הירכיים). החל מחולייה אחת מעל L6, צייר ROI מותני ROI גס מעל חמש החוליות מעל הירכיים (חוליות L1-L5). לאחר מכן, עבור ל – ROI צוואר הרחם / בית החזה ועקוב אחר שארית עמוד השדרה לבסיס הגולגולת.הערה: פעולה זו אינה חייבת להיות מדויקת, מכיוון שהיא משמשת כדי לציין היכן סף Otsu אמור להתרחש בשלב 11.4.8. לאחר ציור החזר ההשקעה הכללי, עבור לחלק העליון של המפעיל. בחרו בתפריט ‘אלגוריתמי סגמנטציה ‘. מהתפריט הנפתח, בחר Otsu Thresholding. עבור הקלט, בחר החזר השקעה מותני. בתחתית התפריט, ודא שנבחרה שלד מותני . בתפריט הנפתח לצד תמונה, ודא שסריקת ה- CT נבחרה ולחץ על החל. חזור על הפעולה עבור ROI צוואר הרחם/ בית החזה ושלד בית החזה.אם סף אוטסו אינו מדגיש מספיק את עמוד השדרה, השתמש בסף גלובלי ושנה את ערך המינימום ל- 350 ואת המקסימום ל- 3,500 לסף ידני והתאם לפי הצורך כדי לבודד את החוליות. לאחר השימוש ב- Otsu Thresholding ליצירת החזר ההשקעה על השלד, חזור לתפריט ניווט (סמל הסמן). מחק או סמן את העמודה H (הסתר) הן עבור המותני המחוספס והן עבור החזר ההשקעה על צוואר הרחם/בית החזה כדי להסתיר אותם. סמן את העמודה I (בלתי משתנה) עבור שני החזרי ההשקעה של השלד כך שלא ניתן יהיה לערוך אותם. לבסוף, חזור לחלק העליון של מפעיל כלי החזר ההשקעה התלת-ממדי ועבור לתפריט צביעה תלת-ממדית כדי לצייר את החזר ההשקעה על חוט השדרה.בחר שוב בכלי Sphere ועקוב אחר חוט השדרה בתוך השלד הן עבור Lumbar והן עבור Thoracic, כדי להבטיח את החזר ההשקעה הנכון נבחר בתחתית התפריט. כדי למחוק החזר השקעה כלשהו, לחץ על Command/Control וצייר מעל החלק שברצונך למחוק. בדוק את החזר ההשקעה על חוט השדרה מכל שלושת המישורים כדי לוודא שאין החזר ROI מחוץ לעמוד השדרה. ייצוא תוצאות ניתוח חוט השדרה.אם אות ה-PET כבוי בשלב 11.4.3, הקש F3 לאחר משיכה של החזר ההשקעה על חוט השדרה כדי להפעיל מחדש את ה-PET, או בחר את הבקר החזותי (VC) ולחץ על סרגל ה-PET. חזור לתפריט ניווט (סמל הסמן). לחץ על סמל הרשת כדי להציג טבלה. העתק את הטבלה לתוכנת גיליון אלקטרוני ושמור. לבסוף, ייצא את הקובץ בתוכנת ניתוח PET, כמתואר לעיל, כדי לשמור את החזר ההשקעה שנמשך. נתחו את המוח באמצעות אטלס תלת-ממדי חצי-אוטומטי.פתח את קובץ חיתוך הראש. ייבא את אטלס המוח של העכבר על-ידי מעבר לתפריט מודולים מתקדמים ובחירה בכלי אטלס המוח התלת-ממדי. ודא שההפניה מוגדרת ל- CT ושאפשרות החיתוך אינה מסומנת. הגדר נתיב עבור ספריית הפלט. בהגדרה מתקדמת, שנה את המרה ל- Versor-Affine. שמור על כל הגדרות ברירת המחדל האחרות. לחץ על הפעל. התאימו ידנית את האטלס בתפריט Reorientation/Registration והשתמשו ב-CT של הגולגולת כקו מנחה להתאמת האטלס.השתמש בזהירות רבה אם קנה המידה נחוץ, שכן זה יכול להשפיע מאוד על נפחי מבנה המוח. לחץ על סימן הביקורת עם השלמת ההתאמה. הפעל מחדש את האטלס כאשר האפשרות ייבוא החזר השקעה תלת-ממדי נבחרה . יצא את הקובץ כדי לשמור את האטלס המותאם לראש החתוך. לאחר ציור וייצוא של כל החזר ההשקעה מהאיברים הרצויים, חשב ערך תיקון מחייב סטנדרטי. תיקון דעיכה של כל הנתונים וההמרה ל- %ID/g כמתואר לעיל6. לנרמל לאיבר המתאים למודל החי, כגון הלב לנרמל לרדיוטרייסר הקיים בבריכת הדם. 12. ניתוח אוטורדיוגרפיה Ex vivo פתח את קובץ התמונה הדיגיטלית ( .gel) באמצעות תוכנת ניתוח התמונות. התאם את הבהירות והניגודיות לסף הרצוי. החל טבלת בדיקת מידע צבעונית מתאימה אם תרצה בכך.הערה: מומלץ להשתמש בצבעי רויאל או אפור כדי להקל על התצוגה החזותית.