Imagerie des lymphocytes B CD19⁺ dans un modèle murin expérimental d’encéphalomyélite auto-immune à l’aide de la tomographie par émission de positons

Figure 1 : Plan de l’étude. Un aperçu des techniques clés dans cet article. (A) Placer les souris sur le dos dans le lit de balayage réduit les mouvements de la colonne vertébrale. (B) Imagerie TEP/TDM des souris. (C) Faites une incision sur la face dorsale de l’animal pour exposer la colonne vertébrale. (D) Divisez la colonne vertébrale en deux parties cervicales/thoraciques et lombaires et retirez les sections qui suivent les cinq coupes indiquées. (E) À l’aide d’une seringue, retirer la moelle épinière de la colonne vertébrale en faisant un joint avec la seringue et la colonne vertébrale et en rinçant les extrémités crânienne et caudale de la colonne vertébrale comme indiqué. (F) Segments isolés de la moelle épinière cervicale/thoracique et lombaire. Abréviation : TEP/TDM = tomographie par émission de positons/tomodensitométrie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément à l’Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) de l’Université de Stanford, un programme accrédité par l’Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International). Les souris ont été acclimatées au vivarium pendant au moins 7 jours avant le début de l’étude afin de minimiser le stress sur les souris, car le stress peut affecter l’induction de l’EAE. 1. Induction de l’EAE chez les souris CD19 humanisées femelles Induire des souris femelles CD19 C57BL/6J humanisées âgées de 9 à 13 semaines avec EAE comme décrit précédemment5 en utilisant MOG1-125. 2. Soins aux animaux et notation dans le modèle de souris EAE Évaluez la progression de la maladie et les soins aux souris comme décrit précédemment5. En bref, notez ce modèle sur une échelle de 1 à 5 comme suit : 1 est la faiblesse / la mollesse de la queue, 2 est l’affaiblissement des membres postérieurs, 3 est la paralysie des membres postérieurs, 4 est la paralysie des membres postérieurs avec faiblesse des membres antérieurs, 5 est moribond. 3. Conjugaison, radiomarquage et caractérisation des anticorps monoclonaux Conjuguer l’ester mono-N-hydroxysuccinimide de l’acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique (ester DOTA-NHS) au hCD19-mAb pour radiomarquer avec 64Cu.À l’aide d’une colonne de dessalage, remplacez le tampon de stockage hCD19-mAb par un tampon HEPES (pH 8,5-9) : conditionnez la ou les colonnes de dessalage avec HEPES. Calculer le nombre de colonnes nécessaires en fonction de la capacité du volume d’échantillon de la colonne de dessalage et du volume d’anticorps monoclonaux requis : tubes de 0,5 mL : 30 à 130 μL de volume d’échantillon, 300 μL de lavage ; Tubes de 2 ml : volume d’échantillon de 200 à 700 μl, lavage de 1 ml. Refroidir la centrifugeuse à 4 °C pour l’échange de tampon via la colonne de dessalage. Récupérez la colonne de dessalage du réfrigérateur. Retirez le bas de la colonne de dessalage, desserrez le bouchon et placez la colonne dans un tube de collecte. Centrifuger à 1 500 × g pendant 2 min pour éliminer la solution de stockage ; Jetez le passage contenant la solution de stockage et réutilisez le tube de collecte. Tracez une ligne sur la colonne où le point le plus élevé de la résine compactée de dessalage est incliné vers le haut. Ajoutez un tampon HEPES sur le côté inférieur de la colonne de dessalage. Placez la colonne de dessalage dans la centrifugeuse avec la ligne vers l’extérieur ; Essorez à 1 500 × g pendant 2 min. Jetez le flux et réutilisez le tube de collecte. Répétez les étapes 3.1.4 et 3.1.5 2 fois en utilisant le même tube de collecte et en jetant l’écoulement entre les étapes. Placez la colonne de dessalage conditionnée dans un nouveau tube de collecte et étiquetez-le ; ce tube contiendra le hCD19-mAb. Ajouter de l’hCD19-mAb au sommet de la ou des colonnes de dessalage conditionnées et utiliser un tampon HEPES pour rincer le flacon d’anticorps monoclonaux vide ; Ajoutez-le en haut de la colonne de dessalage (volume total selon les recommandations du fabricant). Essorez à 1 500 × g pendant 2 min pour éluer le hCD19-mAb. Conservez le flux contenant le hCD19-mAb. Mesurez la concentration d’hCD19-mAb à l’aide d’un spectrophotomètre UV/Vis et ajustez-la à 0,5 μg/μL avec un tampon HEPES si nécessaire. À la solution d’anticorps monoclonaux hCD19, ajouter 1/50edu volume de la solution d’anticorps monoclonaux de 0,5 M d’EDTA pour obtenir la concentration finale d’anticorps monoclonaux de 0,01 M dans la solution d’anticorps monoclonaux hCD19. Laisser reposer la solution hCD19-mAb-EDTA à température ambiante pendant 15 min. Retirez l’ester DOTA-NHS du congélateur et laissez-le revenir à température ambiante (10-15 min). Calculez le volume de DMSO à ajouter à l’ester DOTA-NHS pour obtenir une concentration de DOTA qui permettra d’ajouter le rapport molaire DOTA/mAb souhaité (qui est généralement de l’ordre de 1 à 2 DOTA/mAb).REMARQUE : Le volume d’ester DMSO-DOTA-NHS ajouté à l’anticorps monoclonal hCD19 ne doit pas dépasser 10 % du volume d’anticorps monoclonaux. Cela doit être fait à l’aide d’une feuille de calcul afin que cela puisse être fait rapidement et à plusieurs reprises. Sur la base du rapport souhaité entre DOTA et hCD19-mAb, calculez la quantité d’ester DOTA-NHS à ajouter à hCD19-mAb.nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg de DOTA → mg/mL DOTA/DMSO → mL de DMSO → facteur de dilution de la solution DOTA/DMSO Peser 1 à 2 mg d’ester DOTA-NHS et ajouter soigneusement le volume correct (calculé à l’étape 3.1.11) de DMSO à l’ester DOTA-NHS ; Mélangez et essorez. Pipeter le volume calculé de la solution d’ester DOTA-NHS (étape 3.1.12) dans la solution de hCD19-mAb ; essuyez l’extérieur de l’embout de la pipette avant l’ajout pour vous assurer qu’il n’y a pas d’ajout supplémentaire d’ester DOTA-NHS (sans modifier la quantité dans la pipette). Mélangez doucement et essorez. Placer au réfrigérateur (4 °C) pour réagir toute la nuit (12-16 h). Purification et concentrationRefroidir la centrifugeuse à 4 °C pour les étapes d’échange du tampon du concentrateur centrifuge ; placez un bloc de tube PCR en métal sur de la glace carbonique pour congeler le conjugué. Sortez la réaction DOTA-hCD19-mAb du réfrigérateur et trempez-la en ajoutant un tampon TRIS de qualité biologique : 10 % du volume total de la réaction. Prélever 10 à 20 μg de l’échantillon pour l’analyse par spectrométrie de masse. Conditionner la ou les colonnes de dessalage comme décrit ci-dessus (étapes 3.1.1 à 3.1.5), à l’aide d’un tampon d’acétate d’ammonium de 0,1 M, pH 5,5. Remplacer la solution de DOTA-hCD19-mAb par de l’acétate d’ammonium (étapes 3.1.1-3.1.8). Concentrer la solution DOTA-hCD19-mAb : ajouter la solution à un concentrateur centrifuge de coupure de 50 kDa de poids moléculaire en suivant les recommandations du fabricant en matière de volume. Centrifuger à 4 000 × g pendant 10 min (ou jusqu’à ce que le volume soit réduit de 80 % à 90 %) ; Jetez l’écoulement. Répétez neuf fois de plus (10 au total) : ajoutez suffisamment d’acétate d’ammonium pour ramener le volume au volume maximum recommandé.REMARQUE : Le total doit correspondre à ce qui a été ajouté initialement, y compris ce qui reste dans la colonne, généralement 400-450 μL pour un concentrateur centrifuge d’une capacité de 500 μL.Rincer le flacon de réaction avec un tampon d’acétate d’ammonium pour récupérer tout résidu de DOTA-hCD19-mAb ; Ajoutez le lavage dans le concentrateur centrifuge. Centrifuger à 4 000 × g pendant 10 min.REMARQUE : Le temps d’essorage peut être réduit lors des tours suivants si le volume est réduit à 80%-90% en moins de temps. Retirez la solution protéique du concentrateur centrifuge. Notez le volume total du DOTA-hCD19-mAb.Dans le concentrateur centrifuge 2, ajouter suffisamment de tampon d’acétate d’ammonium pour un volume total de 100 μL et la pipette pour mélanger. Fermez la colonne du concentrateur centrifuge et inversez-la. Essorez à 4 000 × g pendant 2 min pour recueillir la solution. Transférer dans un nouveau tube. Dans le concentrateur centrifuge 500, utilisez une pipette pour recueillir la solution d’anticorps monoclonaux du concentrateur centrifuge ; ajouter à un nouveau tube. Mesurez la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis. Si la concentration est supérieure à 2 mg/mL, diluer avec de l’acétate d’ammonium à 2 mg/mL. Aliquote 100 μg par tube PCR (environ 50 μL) ; étiquetez les tubes avec DOTA-hCD19-mAb, la date, la masse et la concentration. Faites tourner les flacons. Congelez le DOTA-hCD19-mAb sur le bloc PCR réfrigéré sur de la glace carbonique (ou congelez-le sur de la glace sèche). Une fois tous les échantillons congelés, placez-les dans un congélateur à -80 °C. Mesurer le nombre de DOTA par hCD19-mAb par spectrométrie de masse. Conservez un échantillon d’anticorps non conjugués (purs) de chaque conjugaison pour calculer le rapport. Utilisez l’équation (1) ci-dessous ; la masse moléculaire est abrégée MW.(1) RadiomarquageREMARQUE : Porter l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié pour manipuler la radioactivité, y compris une blouse de laboratoire, des gants et un dosimètre corporel et annulaire individuel, conformément aux règlements de l’établissement. Inspectez et changez régulièrement de gants pour éviter toute contamination radioactive. Utilisez un blindage en plomb et augmentez la distance par rapport à la source radioactive en manipulant avec des pinces lorsque cela est possible.Transférez la radioactivité du flacon d’expédition vers un nouveau flacon à l’aide d’une pipette. Mesurez la radioactivité. Retirer une aliquote pour la première réaction de radiomarquage. Ajouter 50 μL d’acétate d’ammonium (pH 5,5) par 1 mCi de 64Cu-CuCl3. Mesurez le pH en pipetant 1 μL sur une bandelette de pH avec une plage de 5,5 avec une résolution suffisante pour distinguer 5 et 6. Si le pH n’est pas de 4 à 5,5, modifiez-le en utilisant 1 M de NaOH ou 0,1 M de HCl. Ajouter de petites quantités, de 1 à 5 μL, de 1 M de NaOH si le pH est inférieur à 4 ou de 0,1 M HCl si le pH est supérieur à 5,5 jusqu’à ce que le pH correct soit atteint. À chaque ajout, mélangez soigneusement, essorez et mesurez le pH comme décrit ci-dessus. Notez chaque ajout et retrait de toute solution (y compris pour vérifier le pH) afin que le volume final puisse être calculé. Une fois le pH optimal atteint, ajouter 10 μg de DOTA-hCD19-mAb pour 1 mCi de 64Cu-CuCl3. Mélangez doucement et essorez brièvement. Placez le flacon de réaction sur un thermomélangeur réglé à 37 °C et 400 tours par minute (tr/min). Au bout de 30 min, tremper la réaction : diviser le volume total de la réaction par 50 et ajouter ce volume de 0,5 M EDTA au mélange réactionnel. Déterminer l’efficacité du marquage à l’aide de la chromatographie instantanée sur couche mince (ITLC) pour mesurer le pourcentage de cuivre lié et libre dans la solution.Découpez des bandes de papier TLC de 1 cm de large. Marquez à 1 cm du haut et du bas de la bandelette et préparez un tube (fiole conique de 50 ml) avec une phase mobile de moins de 1 cm d’acide citrique 0,1 M (le niveau de phase mobile doit être inférieur au repère de 1 cm sur la bandelette lorsqu’elle est placée dans le tube). Pipeter 1 μL de la solution réactionnelle sur la bandelette au repère inférieur de 1 cm (avant de solvant) et placer la bandelette dans le tube. Surveillez jusqu’à ce que le devant du solvant atteigne la marque supérieure de 1 cm, retirez la bande et enveloppez-la dans un morceau de film plastique. Placez la bandelette sur la plate-forme et passez-la dans un scanner d’imagerie radio-TLC. Recherchez l’anticorps monoclonal radiomarqué à l’origine et le 64Cu libre qui se déplace avec le front de phase mobile (Figure 2). Si le pourcentage de cuivre libre est inférieur à 5 % (efficacité d’étiquetage de 95 %), procéder à l’injection chez les animaux. Si le pourcentage de cuivre libre est supérieur à 5%, procédez à la purification.REMARQUE : Le pourcentage de cuivre libre dépend généralement du rapport DOTA-mAb à 64Cu, du temps de réaction, du pH et de la température. Les conditions de réaction doivent être optimisées par chaque utilisateur pour chaque nouvel anticorps monoclonal afin d’assurer des résultats cohérents. Purification à l’aide d’une colonne gravitaire jetable de qualité ADNConditionner une colonne d’écoulement gravitaire jetable de qualité ADN (colonne de dessalage/d’échange de tampon) selon les instructions du fabricant. Placez la colonne gravitationnelle jetable de qualité ADN sur un support annulaire ou un autre instrument derrière un blindage de plomb adéquat ; Assurez-vous que l’appareil est stable et facilement déplaçable. Placez le tube sous la colonne. Pipeter le mélange réactionnel brut sur la résine de la colonne d’écoulement par gravité. Attendez que tout le liquide se soit écoulé dans la résine. Pipeter suffisamment de PBS pour porter le volume total (produit brut plus PBS) à 500 μL. Placez la colonne au-dessus de tubes à centrifuger de 1,5 ml étiquetés de 1 à 10. Ajouter 1 mL de PBS dans la colonne. Recueillez cinq gouttes dans chaque tube jusqu’à ce que l’écoulement se soit arrêté.REMARQUE : Moins de 10 tubes peuvent être nécessaires. Coiffez le bas de la colonne et mesurez la radioactivité résiduelle. Mesurez chaque flacon avec un écoulement continu. Pour chaque flacon de plus de 50 μCi, préparer un ITLC à l’étape 3.3.7 pour mesurer le pourcentage de cuivre lié dans chaque fraction.REMARQUE : La ou les deux premières fractions ne contiendront que la phase mobile ; les anticorps monoclonaux radiomarqués élueront en premier (généralement les fractions 2 ou 3 à 5 ou 6) et les 64Cu libres élueront en dernier (certains colleront à la colonne). Le pourcentage lié 64Cu peut varier d’une fraction à l’autre. Combiner les fractions avec une liaison supérieure à 95 % (moins de 5 % de cuivre libre) ; Utilisez la solution injectable. Si vous le souhaitez, effectuez une HPLC d’exclusion de taille pour confirmer le radiomarquage5 et calculer l’activité molaire. Conservez une aliquote pour mesurer la concentration sur un spectrophotomètre UV-Vis après qu’il se soit désintégré pendant 10 demi-vies (127 h ou 5,3 jours). 4. Préparation de la dose REMARQUE : Avant de manipuler la dose, portez un EPI approprié, y compris une blouse de laboratoire, des dosimètres corporels et des dosimètres pour les doigts et des gants. Injecter 64 anticorps monoclonaux Cu-DOTA-hCD19 18 à 24h avant la TEP, afin de permettre une circulation adéquate du radiotraceur dans l’organisme. Placez immédiatement le récipient en plomb avec le 64Cu-DOTA-hCD19-mAb derrière un blindage en plomb. Allumez le compteur Geiger pour surveiller la contamination potentielle.REMARQUE : Changez fréquemment de gants lorsque vous manipulez des matières radioactives. Il est recommandé de porter deux gants pendant le prélèvement des doses pour faciliter les changements rapides de gants. Placez toujours les objets tranchants et les déchets contaminés dans la zone de déchets protégée désignée. Diluer le 64Cu-DOTA-hCD19-mAb à une concentration appropriée dans un tube à centrifuger en plastique de 1,5 mL à faible liaison.REMARQUE : Le 64Cu-DOTA-hCD19-mAb se liera au plastique s’il n’est pas à faible liaison ; 64 ansCu se liera au verre.Diluer le radiotraceur dans une solution saline pour éviter la radiolyse et simplifier le prélèvement de doses constantes. Préparer des doses à administrer entre 75 et 150 μCi dans 100 μL, si possible. Assurez-vous que le volume total maximal injecté ne dépasse pas 10 % du poids corporel de la souris. Utilisez une seringue à insuline de 500 μL (50 cc) pour prélever la dose dans le tube en plastique à faible liaison. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans la seringue car elle sera injectée par voie intraveineuse.Pré-étiquetez les seringues avec les numéros d’animaux correspondants. Enregistrez l’activité et la durée de la dose dans un cahier de laboratoire pour l’analyse des données. Préparez les doses pour l’injection dès que les animaux sont cathétérisés afin de réduire le temps passé sous anesthésie. Une fois les doses préparées, préparez un étalon (fantôme) pour le balayage afin de générer un facteur d’étalonnage.Remplir un tube conique de 15 mL avec 50 à 75 μCi d’activité diluée dans de l’eau (ou du PBS).REMARQUE : Assurez-vous de bien mélanger la solution. L’étalon peut être exempt de 64Cu restants de l’étiquetage.Mesurez la quantité d’activité dans la norme et enregistrez le temps. 5. Canulation et injection NOTE : Voir les méthodes6 décrites précédemment pour la canulation intraveineuse de souris pour injection du radiotraceur6. Peser et noter les souris en fonction de la gravité de la maladie, comme décrit à la section 2.1, avant d’anesthésier les souris dans une boîte de démolition remplie d’isoflurane à 1,5 à 3 % en vue de l’administration de radiotraceurs.REMARQUE : Ces souris seront injectées sur la paillasse, et non sur le scanner TEP comme décrit précédemment. Il n’est pas nécessaire de coller les cathéters en place pour l’injection, car les souris ne seront pas déplacées entre la canulation et l’injection. Une fois qu’une souris est canulée, insérez l’aiguille dans l’extrémité du cathéter et injectez lentement. Après l’injection, appliquez ensuite une petite solution saline à travers le cathéter pour vous assurer que toute la dose est injectée.REMARQUE : Le volume doit être approximativement égal au volume mort du cathéter, qui est de 50 μL pour les cathéters utilisés par les auteurs.Injecter sur un morceau de lingette de laboratoire pour recueillir les gouttes de radiotraceur ; Tenez-en compte lors de la mesure de la dose résiduelle. Notez l’heure de l’injection dans un cahier de laboratoire. Retirez la canule immédiatement après l’injection. Mesurez la canule, la seringue doseuse et le tissu à l’aide d’un calibrateur de dose pour déterminer la dose résiduelle qui n’a pas été injectée à la souris.Enregistrez l’activité et le temps dans un cahier de laboratoire. Une fois les souris injectées, étiquetez leurs cages avec une carte de cage indiquant que les souris sont radioactives. Consigner et consigner les cages conformément aux directives de l’établissement. Ensuite, placez les souris dans une zone d’attente radioactive désignée. 6. Imagerie TEP/TDM Réaliser une imagerie TEP 18 à 24 h après l’injection de 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. Pesez et notez les souris avant le scan.REMARQUE : Le mode d’emploi du scanner dépend du scanner utilisé.Assurez-vous que la composante radiographique du tomodensitomètre est réchauffée et prête pour l’acquisition. Ouvrez le logiciel d’acquisition du scanner TEP sur l’ordinateur. Dans le menu déroulant Connexion de l’investigateur , cliquez sur les informations de laboratoire appropriées. Sur la page Projet, créez un nouveau projet ou sélectionnez un projet existant dans le menu déroulant. Lorsque l’invite d’initialisation apparaît automatiquement à l’écran, cliquez sur Home Bed et attendez que Bed to Home soit à la maison. Ensuite, cliquez sur Warm up CT.Assurez-vous que la porte de blindage de la tomodensitométrie est fermée pour permettre à la tomodensitométrie de se réchauffer. Pendant que le scanner se réchauffe, marquez les souris EAE et injectez-leur par voie sous-cutanée 0,2 à 0,4 ml de solution saline chaude dans le flanc pour les hydrater. Une fois le scanner réchauffé, retournez à l’ordinateur pour configurer les tomodensitogrammes pour l’étude.REMARQUE : Ceux-ci peuvent être configurés avant le jour de l’analyse.Sous l’en-tête Études récentes , cliquez sur Créer une nouvelle étude. Remplissez le nom de l’étude, le protocole, le composé et les informations sur le sujet.Si vous effectuez une TEP/TDM, sélectionnez d’abord Protocole TEP , puis Protocole CT.REMARQUE : En règle générale, une tomodensitométrie standard est suffisante pour scanner le modèle de souris EAE. Une tomodensitométrie dure 1 min et est acquise avec un binning à 2 x 2 à une tension de 80 kVp, un courant de 150 μA et des projections de 720. Les images TDM sont reconstruites à l’aide d’un algorithme de Feldkamp modifié. Pour le protocole PET, choisissez un balayage statique de 10 à 15 minutes à 64 cuivres. Si cette analyse ne figure pas déjà dans la liste des protocoles disponibles, ajoutez-la en cliquant sur l’onglet Protocoles dans le menu Standard , Créer un nouveau protocole | Menu déroulant Isotopes . Si l’isotope souhaité n’est pas répertorié, cliquez sur Plus | Ajouter à partir de la bibliothèque et ajouter l’isotope souhaité. Définissez la durée de l’analyse, cliquez sur la case d’option pour l’analyse statique, nommez le protocole et cliquez sur Enregistrer. Revenez à l’onglet Études et continuez à nommer et à configurer toutes les analyses souhaitées pour la journée.REMARQUE : Il est recommandé de configurer également un « test de tomodensitométrie » en utilisant uniquement un scanner standard pour vérifier le positionnement du lit du premier balayage afin d’assurer un placement optimal. Il doit s’agir de la première analyse de l’étude. Une fois que le scanner est prêt, anesthésiez les souris dans une boîte démontable pour les préparer à l’analyse.REMARQUE : À ce stade, les souris sont probablement très malades ; Il est préférable de minimiser le temps passé sous anesthésie.Appliquez un gel pour les yeux. Assurez-vous que le plateau de numérisation à quatre souris est équipé d’éléments chauffants, tels que des coussins chauffants ou de l’air chauffé, avec l’isoflurane réglé sur 1,5 % à 2 % et le coussin chauffant allumé (Figure 3). Placez les souris en décubitus dorsal sur le lit de numérisation.Au fur et à mesure que la maladie EAE progresse, la colonne vertébrale de la souris devient sévèrement courbée. Scannez les souris pendant qu’elles sont sur le dos pour redresser la colonne vertébrale autant que possible, améliorant ainsi l’analyse en aval. Tirez doucement sur la queue de la souris pour aider à redresser la colonne vertébrale. Une fois en position couchée, fixez solidement chaque souris avec du ruban adhésif souple pour microscope. Utilisez une bande de ruban adhésif sur la tête et une autre doucement sur le ventre pour minimiser les mouvements dus à la respiration.Enregistrez dans un cahier de laboratoire quelle souris se trouve dans quelle position de numérisation. Une fois les souris sécurisées, retournez à l’ordinateur de numérisation pour faire fonctionner le scanner. Ouvrez le menu Contrôleur de mouvement . Cliquez sur le champ de vision du centre PET pour déplacer les souris sur le lit de numérisation dans l’anneau PET. Pour le premier scan de la journée, cliquez sur CT Center FOV. Une fois en position, exécutez le test CT pour vous assurer que la position est correcte ; Répétez l’opération jusqu’à ce que la position du lit soit satisfaisante.Placez un petit morceau de ruban adhésif blanc sur le lit de numérisation pour marquer l’emplacement correct du lit pour le reste de l’étude. Une fois que le lit est en place pour la TEP, lancez la séquence de balayage en cliquant sur Exécuter.Attendez que le scanner passe automatiquement de l’anneau PET au scanner. Vérifiez toujours visuellement si les animaux se sont déplacés dans la bonne position pour la TEP et la TDM. Enregistrez l’heure de début de l’analyse dans un cahier de laboratoire pour corriger la décroissance de la dose injectée pendant l’analyse des données. Une fois la numérisation terminée, laissez l’image se reconstruire. Vérifiez les données avant de retirer les animaux.REMARQUE : La reconstruction OSEM (Expectation Expectation-Maximization) ordonnée en 3D prendra environ 5 minutes pour un balayage statique. Vérifiez visuellement et approuvez les données, en utilisant la rate comme témoin positif, car ce tissu contient un grand nombre de lymphocytes B. Retirez les animaux du lit d’analyse et placez-les dans une boîte de démolition remplie d’isoflurane en vue de la perfusion et de la dissection subséquente. Répétez les étapes 6.5 à 6.12 pour les souris restantes de l’étude. Lorsque toutes les souris sont scannées ou lors de l’analyse d’un groupe qui a une place libre dans le lit de numérisation, scannez l’étalon préparé à l’étape 4.6. 7. Dissection pour comptage gamma ex vivo et autoradiographie Avant de disséquer, assurez-vous que tous les tubes de comptage gamma et de centrifugation ont été pré-pesés. Pratiquer l’euthanasie par perfusion, comme décrit précédemment6, avec PBS et thoracotomie pendant que les souris sont anesthésiées en profondeur (inhalation continue d’isoflurane à 4 %, 2 L/min à 100 % d’O2). Pour enlever la moelle osseuse, coupez les deux fémurs au niveau du genou et du bassin. Assurez-vous que les deux têtes sont retirées du fémur.Placez les deux fémurs dans un tube à centrifuger de 0,5 mL percé d’un trou au fond (à l’aide d’une aiguille de 20 G) dont le couvercle est coupé. Placez le tube de 0,5 ml contenant les fémurs à l’intérieur d’un tube à centrifuger de 1,5 ml avec le couvercle coupé. Placez l’ensemble du tube dans une mini centrifugeuse. Essorez pendant 4 min à 4 500 × g.REMARQUE : La moelle osseuse doit être délogée par le trou du tube à centrifuger de 0,5 mL et se déposer au fond du tube à centrifuger de 1,5 mL.Séparez les tubes. Peser les fémurs vides dans le tube à centrifuger de 0,5 ml. Peser la moelle osseuse dans le tube à centrifuger de 1,5 ml. Placez chaque tube à centrifuger dans des tubes de comptage gamma. Retirez le cerveau à l’aide d’une pince et de ciseaux, en prenant soin de garder le tronc cérébral intact. Placez le cerveau dans un tube de comptage gamma. Enregistrez le poids sec, rincez avec PBS et gardez sur de la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à compter. Pour retirer la moelle épinière, effectuez les opérations suivantes.Retirez la peau et la fourrure en faisant une incision sur la face dorsale de l’animal pour exposer la colonne vertébrale (figure 1). Séparez les régions lombaires (L) des régions cervicales (C) et thoracique en coupant le long de trois plans transversaux autour et à travers la colonne vertébrale : à la base du cou (vertèbre C1) (Figure 1D, numéro 1) ; à la base de la cage thoracique (vertèbre L1) (Figure 1D, numéro 2) ; à la base du bassin (vertèbre L5) (Figure 1D, numéro 3). Coupez sous la cage thoracique (Figure 1D, numéro 2). Coupez directement au-dessus du sacrum pour séparer la région lombaire de la colonne vertébrale. Coupez soigneusement la colonne vertébrale à partir de l’extrémité pelvienne jusqu’à ce que la moelle épinière lombaire soit visible (Figure 1D, numéro 3). Coupez les tissus environnants pour isoler les régions lombaire et cervicale/thoracique de la colonne vertébrale (figure 1D, numéros 4 et 5). Pour expulser la moelle épinière, utilisez une seringue à embout coulissant (3 à 10 ml) remplie de PBS. Créez un joint entre la seringue et la colonne vertébrale à l’aide du pouce et de l’index.Poussez doucement le PBS à travers la seringue pour expulser la moelle épinière sur un tampon absorbant (Figure 1E) ; Répétez l’opération pour les deux régions de la colonne vertébrale. Placez les tissus de la moelle épinière dans un tube de comptage gamma. Enregistrez le poids sec et ajoutez du PBS pour vous assurer que le tissu est au fond du tube afin d’éviter qu’il ne se dessèche. Placez le tube sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à compter. Expulser la moelle épinière cervicale/thoracique de l’extrémité crânienne et la moelle épinière lombaire de l’extrémité caudale de la colonne vertébrale (Figure 1E). 8. Comptage gamma ex vivo Ouvrez le logiciel du compteur gamma. Accédez à la liste de travail et sélectionnez le protocole souhaité, par exemple un protocole de comptage de 30 s pour 64Cu. Préparez au moins trois étalons dans des tubes séparés. Exécutez-les maintenant pour les utiliser dans l’analyse (étape 10.2). Essayez de faire trois volumes et quantités d’activité répétés dans trois tubes distincts.REMARQUE : Un volume de 500 μL donne de bons résultats. Bien que l’activité soit déterminée par la machine utilisée, 10 μCi fonctionnent généralement bien. Placez les étalons dans un rack étiqueté avec le code-barres correspondant au protocole souhaité à exécuter. Placez la grille sur le compteur gamma. Après avoir enregistré les poids des orgues, placez les tubes contenant les organes sur la grille de comptage gamma après les tubes contenant les étalons.REMARQUE : Les organes d’intérêt pour ce modèle peuvent inclure les ganglions lymphatiques axiaux, le sang, la moelle osseuse, le cerveau, les ganglions lymphatiques cervicaux, le fémur, le cœur, le foie, la moelle épinière lombaire, les muscles, la rate, la queue et la moelle épinière cervicale/thoracique. Placez une grille avec un code-barres d’arrêt à l’arrière du compteur gamma. Appuyez sur le bouton Lecture de l’ordinateur. Si possible, n’appuyez pas sur Play tant qu’il n’y a pas plusieurs racks ou organes à exécuter pour permettre à tous les tubes d’être comptés en continu dans un seul fichier. Assurez-vous qu’un rack avec un code-barres d’arrêt se trouve à l’arrière du compteur gamma pour chaque passage. Exécutez jusqu’à ce que tous les échantillons aient été comptés. Enregistrez et exportez le fichier. 9. Autoradiographie ex vivo (ARG) du tissu du SNC Suivez les étapes précédemment publiées pour l’ARG du cerveau et de la moelle épinière (tout en excluant les étapes 2 à 6 décrites par Chaney et al., car les souris ont déjà reçu une injection de radiotraceur à partir de la TEP)6.REMARQUE : Des instructions spécifiques pour la préparation de la cassette ARG de la moelle épinière sont répertoriées ici6. Une fois le comptage gamma terminé pour la moelle épinière lombaire et cervicale/thoracique, placez rapidement les tubes sur de la glace jusqu’à ce que tous les tissus du SNC aient été comptés.REMARQUE : Reportez-vous à la méthode publiée précédemment pour l’ARG du cerveau6. Inclinez doucement les tubes pour permettre aux moelles épinières de tomber sur un tampon absorbant. Si la moelle épinière colle sur le côté du tube, rincez doucement avec du PBS froid et inclinez à nouveau le tube. Séchez soigneusement chaque moelle épinière en épongeant doucement avec un mouchoir en papier. Placez les moelles épinières séchées de manière organisée sur un morceau de papier noir épais.Étiquetez à côté de la moelle épinière avec un stylo blanc pour une identification facile. Laissez de l’espace dans les coins et au milieu du papier noir pour placer des piles de trois lames de microscope qui agissent comme des entretoises pour empêcher la compression de la moelle épinière lorsque la cassette ARG est fermée. Utilisez 5 à 7 piles. Une fois que toutes les moelles lombaires et cervicales/thoraciques sont positionnées sur le papier noir et étiquetées, placez soigneusement le morceau de papier dans la cassette ARG. Placez la cassette ouverte sur un plateau de glace carbonique pour geler la moelle épinière. Une fois congelé, placez délicatement une pellicule plastique entre l’écran de stockage du phosphore numérique et la moelle épinière et placez l’écran sur les échantillons. Fermez immédiatement la cassette et placez-la au congélateur à -20 °C pendant environ 10 demi-vies (~127 h). Lorsque le temps d’exposition est terminé, numérisez le film à l’aide d’un imageur au phosphore. Analysez l’image numérique résultante (voir la section 12 pour les instructions). 10. Analyse des données de biodistribution Mettre en place une feuille de calcul « Correction de dose » pour déterminer mathématiquement la correction temporelle de la désintégration radioactive, normalisant ainsi les doses de rayonnement et permettant des comparaisons entre les sujets.Corriger la carie de toutes les doses jusqu’au moment de l’injection, en tenant compte de l’activité résiduelle laissée dans la seringue et le cathéter après l’injection. À l’aide des étalons préparés à l’étape 8.2, faites la moyenne de la quantité d’activité (μCi) et du nombre normalisé par minute (CPM). Divisez le CPM moyen par la quantité moyenne d’activité standard pour obtenir le CPM/μCi.REMARQUE : Assurez-vous que la quantité d’activité de chaque étalon est corrigée en fonction de la décroissance au moment où le compteur gamma compte le CPM des étalons. Le compteur gamma doit normaliser toutes les valeurs de CPM à l’heure de début du protocole. Configurez la feuille de calcul « Résultats » pour calculer le pourcentage final de dose injectée par gramme de tissu (% ID/g) pour chaque échantillon.Corriger la décroissance du CPM normalisé à partir du compteur gamma pour chaque échantillon compté jusqu’au moment de l’injection de l’animal.REMARQUE : La correction de la décroissance peut être effectuée à n’importe quel moment ; s’assurer que toutes les doses et les valeurs de CPM sont corrigées de la décroissance au même point de temps. Normalisez le CPM corrigé de la décroissance à la masse de chaque échantillon pour déterminer le CPM par échantillon. Calculez le CPM total injecté en soustrayant le CPM dans la queue du CPM injecté calculé.REMARQUE : La queue n’a pas besoin d’être corrigée en masse car cette valeur de CPM sera simplement soustraite du CPM total injecté pour tenir compte de tout traceur extraveineux de l’injection. Divisez le CPM par masse par le CPM total injecté pour calculer le %ID/g. Configurez une feuille de calcul « Résumé » pour afficher les résultats finaux à saisir dans un logiciel graphique, puis à visualiser les données et à effectuer des analyses statistiques. 11. Analyse d’images TEP Ouvrez le logiciel d’analyse TEP. lécher sur le fichier |Ouvrir les données locales | DICOM. Localisez le fichier souhaité (format DICOM). Ouvrez à la fois le PET et le CT. Dans le gestionnaire de données, ajustez le contraste TEP et CT aux niveaux souhaités. Enregistrez et recadrez des souris individuelles.Dans le menu Navigation , sélectionnez l’onglet Réorientation/Enregistrement . Allez dans le menu Rigide dans cet onglet. Désignez la tomodensitométrie (0) comme la tomodensitométrie fixe et la tomographie par émission de positons (1) comme la tomodensitométrie (1). Choisissez une transformation rigide et une qualité rapide . Cliquez sur S’inscrire. Une fois l’inscription terminée (5-10 min), cliquez sur la coche pour enregistrer l’inscription. Inspectez visuellement les données pour vous assurer que l’enregistrement a réussi. Exportez la session en cliquant sur Fichier | Séance | Exporter. Ensuite, recadrez chaque souris dans un recadrage complet du corps : allez dans le menu de navigation et cliquez sur Recadrage. Faites glisser les côtés de chaque coupe transversale du bord extérieur vers l’intérieur. Une fois que la souris souhaitée est bien recadrée, cliquez sur la coche et exportez la session à enregistrer. Ensuite, recadrez et redressez la tête de chaque souris pour l’analyse du cerveau à l’aide de la translation, des rotations et des retournements manuels dans le menu Enregistrement/Réorientation . Exportez pour enregistrer. Analysez la moelle épinière.Pour commencer l’analyse des régions d’intérêt (ROI) dans la moelle épinière, ouvrez l’outil ROI 3D dans le menu de navigation . Sous l’en-tête ROI, utilisez le signe plus en bas du menu pour créer six ROI : ROI lombaire, ROI cervical/thoracique, Squelette lombaire, Squelette thoracique, Moelle épinière lombaire, Moelle épinière thoracique.REMARQUE : Les RCI lombaires et cervicaux/thoraciques sont des ROI généralisés de grande taille qui seront utilisés pour créer les ROI du squelette (Figure 4). Pour éviter les interférences visuelles du signal PET avec cette étape, cliquez sur F3 pour désactiver le PET. Accédez au haut de l’opérateur d’outil 3D ROI. Cliquez sur le point plein à droite du symbole du curseur pour ouvrir le menu Mode Peinture 3D et Éroder/Dilater . Sélectionnez Sphère et définissez la taille sur 20 pixels. Réglez Dilate sur +5.Avant de continuer, allez en bas du menu. Assurez-vous que le ROI lombaire est sélectionné, car il s’agit du premier ROI à être dessiné. Sur le scanner, trouvez la vertèbre L6 de la colonne vertébrale (là où la colonne vertébrale rencontre les hanches). En commençant par une vertèbre au-dessus de L6, dessinez un ROI lombaire approximatif sur les cinq vertèbres au-dessus des hanches (vertèbres L1-L5). Ensuite, passez au ROI cervical/thoracique et tracez le reste de la colonne vertébrale jusqu’à la base du crâne.REMARQUE : Il n’est pas nécessaire que ce soit précis, car il est utilisé pour indiquer où le seuillage Otsu doit avoir lieu à l’étape 11.4.8. Après avoir dessiné les ROI généralisés, allez en haut de l’opérateur. Sélectionnez le menu Algorithmes de segmentation . Dans le menu déroulant, sélectionnez Otsu Thresholding. Pour l’entrée, sélectionnez Lumbar ROI. En bas du menu, assurez-vous que l’option Squelette lombaire est sélectionnée. Dans le menu déroulant à côté de Image, assurez-vous que la tomodensitométrie est sélectionnée et cliquez sur Appliquer. Répétez l’opération pour le ROI cervical/ thoracique et le squelette thoracique.Si le seuillage Otsu ne met pas suffisamment en évidence la colonne vertébrale, utilisez le seuillage global et remplacez la valeur Min par 350 et la valeur Max par 3 500 pour le seuillage manuel et ajustez-la si nécessaire pour isoler les vertèbres. Après avoir utilisé le seuillage Otsu pour créer les ROI squelettes, revenez au menu de navigation (icône du curseur). Supprimez ou cochez la colonne H (masquer) pour les ROI rugueux lombaires et cervicaux/thoraciques afin de les masquer. Cochez la colonne I (immuable) pour les deux ROI squelettes afin qu’ils ne puissent pas être modifiés. Enfin, revenez en haut de l’opérateur d’outil 3D ROI et accédez au menu Peinture 3D pour dessiner les ROI de la moelle épinière.Sélectionnez à nouveau l’outil Sphère et tracez la moelle épinière dans le squelette pour les zones lombaires et thoraciques, en veillant à ce que le retour sur investissement correct soit sélectionné en bas du menu. Pour effacer tout ROI, cliquez sur Commande/Contrôle et dessinez sur la partie à effacer. Vérifiez le ROI de la moelle épinière à partir des trois plans pour vous assurer qu’il n’y a pas de ROI tiré à l’extérieur de la colonne vertébrale. Exportez les résultats de l’analyse de la moelle épinière.Si le signal PET a été désactivé à l’étape 11.4.3, appuyez sur F3 une fois que les ROI de la moelle épinière sont dessinés pour réactiver le TEP, ou sélectionnez le contrôleur visuel (VC) et cliquez sur la barre PET. Retournez dans le menu de navigation (icône en forme de curseur). Cliquez sur l’icône de la grille pour afficher le tableau. Copiez le tableau dans un tableur et enregistrez-le. Enfin, exportez le fichier dans un logiciel d’analyse TEP, comme décrit ci-dessus, pour enregistrer les ROI dessinés. Analysez le cerveau à l’aide d’un atlas 3D semi-automatisé.Ouvrez le fichier de recadrage de la tête. Importez l’atlas du cerveau de la souris en accédant au menu Modules avancés et en sélectionnant l’outil Atlas du cerveau 3D. Assurez-vous que la référence est définie sur CT et que l’option de recadrage n’est pas cochée. Définissez un chemin d’accès pour le répertoire de sortie. Dans Paramètres avancés, remplacez Transformer par Versor-Affine. Conservez tous les autres paramètres par défaut. Cliquez sur Exécuter. Ajustez manuellement l’atlas dans le menu Réorientation/Enregistrement et utilisez la tomodensitométrie du crâne comme guide pour l’ajustement de l’atlas.Soyez très prudent si un détartrage est nécessaire, car cela peut affecter considérablement les volumes de la structure du cerveau. Cliquez sur la coche lorsque le réglage est terminé. Réexécutez l’atlas en sélectionnant l’option Importer des ROI 3D . Exportez le fichier pour enregistrer l’atlas adapté à la tête recadrée. Après avoir dessiné et exporté tous les ROI des organes souhaités, calculez une valeur de correction de liaison standard. Corrigez toutes les données et convertissez-les en %ID/g comme décrit précédemment6. Normaliser à l’organe qui convient au modèle animal, comme le cœur pour normaliser au radiotraceur présent dans le pool sanguin. 12. Analyse d’autoradiographie ex vivo Ouvrez le fichier d’image numérique (.gel) à l’aide du logiciel d’analyse d’image. Ajustez la luminosité et le contraste au seuil souhaité. Appliquez une table de correspondance de couleur appropriée si vous le souhaitez.REMARQUE : Royal ou Grays sont recommandés pour faciliter la visualisation.