Beeldvorming van CD19⁺ B-cellen in een experimenteel muismodel met auto-immuun encefalomyelitis met behulp van positronemissietomografie

Figuur 1: Onderzoeksopzet. Een overzicht van de belangrijkste technieken in dit artikel. (A) Door de muizen op hun rug in het scanbed te plaatsen, wordt de beweging in de wervelkolom verminderd. (B) PET/CT-beeldvorming van de muizen. (C) Maak een incisie langs de dorsale zijde van het dier om de wervelkolom bloot te leggen. (D) Snijd de wervelkolom in cervicale/thoracale en lumbale delen en verwijder de secties volgens de vijf aangegeven sneden. (E) Gebruik een injectiespuit om het ruggenmerg uit de wervelkolom te verwijderen door een afdichting te maken met de spuit en de wervelkolom en te spoelen vanaf de schedel- en staartuiteinden van de wervelkolom, zoals afgebeeld. (F) Geïsoleerde cervicale/thoracale en lumbale ruggenmergsegmenten. Afkorting: PET/CT = Positron emissie tomografie/computertomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met het Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) aan de Stanford University, een programma dat is geaccrediteerd door de Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International). Muizen werden ten minste 7 dagen voorafgaand aan het begin van het onderzoek aan het vivarium gewend om stress bij de muizen tot een minimum te beperken, aangezien stress de EAE-inductie kan beïnvloeden. 1. EAE-inductie bij vrouwelijke gehumaniseerde CD19-muizen Induceer gehumaniseerde CD19 C57BL/6J vrouwelijke muizen van 9-13 weken oud met EAE zoals eerder beschreven5 met behulp van MOG1-125. 2. Dierverzorging en scoring in EAE-muismodel Scoor ziekteprogressie en zorg voor de muizen zoals eerder beschreven5. In het kort, scoor dit model op een schaal van 1-5 als volgt: 1 is staartzwakte/slapheid, 2 is verzwakte achterpoten, 3 is achterpootverlamming, 4 is achterpootverlamming met zwakte van de voorpoten, 5 is stervende. 3. mAb-conjugatie, radiolabeling en karakterisering Conjugeer de bifunctionele chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-tetraazijnzuur mono-N-hydroxysuccinimide-ester (DOTA-NHS-ester) tot hCD19-mAb om radioactief te labelen met 64Cu.Vervang met behulp van een ontziltingskolom de hCD19-mAb-opslagbuffer door HEPES-buffer (pH 8,5-9): conditioneer de ontziltingskolom(men) met HEPES. Bereken het aantal benodigde kolommen op basis van de capaciteit van het monstervolume van de ontziltingskolom en het benodigde volume mAb: 0,5 ml buisjes: 30-130 μL monstervolume, 300 μL wasgoed; Buisjes van 2 ml: monstervolume van 200-700 μl, 1 ml wassen. Koel de centrifuge af tot 4 °C voor bufferuitwisseling via de ontziltingskolom. Haal de ontziltingskolom uit de koelkast. Verwijder de onderkant van de ontziltingskolom, draai de dop los en plaats de kolom in een opvangbuis. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.500 × g om de bewaaroplossing te verwijderen; Gooi de doorstroom met de bewaaroplossing weg en hergebruik de opvangbuis. Markeer een lijn op de kolom waar het hoogste punt van de ontziltende samengeperste hars schuin naar boven staat. Voeg HEPES-buffer toe aan de onderkant van de ontziltingskolom. Plaats de ontziltingskolom in de centrifuge met de lijn naar buiten gericht; Centrifugeer op 1.500 × g gedurende 2 min. Gooi de doorstroom weg en hergebruik de opvangbuis. Herhaal stap 3.1.4 en 3.1.5 2x met dezelfde opvangbuis en gooi de doorstroming tussen de stappen weg. Plaats de geconditioneerde ontzoutkolom in een nieuwe opvangbuis en etiketteer; dit buisje bevat de hCD19-mAb. Voeg hCD19-mAb toe aan de bovenkant van de geconditioneerde ontziltingskolom(men) en gebruik HEPES-buffer om de lege mAb-injectieflacon te spoelen; Voeg dit toe aan de bovenkant van de ontzoutingskolom (totaal volume volgens de aanbeveling van de fabrikant). Centrifugeer gedurende 2 minuten op 1.500 × g om de hCD19-mAb te elueren. Bewaar de doorstroom met de hCD19-mAb. Meet de concentratie hCD19-mAb met behulp van een UV/Vis-spectrofotometer en pas indien nodig aan op 0,5 μg/μL met HEPES-buffer. Voeg aan de hCD19-mAb-oplossing 1/50evan het volume van de mAb-oplossing van 0,5 M EDTA toe om de uiteindelijke concentratie EDTA 0,01 M in de hCD19-mAb-oplossing te verkrijgen. Laat de hCD19-mAb-EDTA-oplossing 15 minuten op kamertemperatuur staan. Haal de DOTA-NHS-ester uit de vriezer en laat op kamertemperatuur komen (10-15 min). Bereken het volume DMSO dat aan de DOTA-NHS-ester moet worden toegevoegd om een DOTA-concentratie te maken die de toevoeging van de gewenste DOTA/mAb-molaire verhouding mogelijk maakt (die meestal in de orde van grootte van 1-2 DOTA/mAb ligt).OPMERKING: Het volume DMSO-DOTA-NHS-ester toegevoegd aan hCD19-mAb mag niet groter zijn dan 10% van het mAb-volume. Dit moet worden gedaan met behulp van een spreadsheet, zodat het snel en herhaaldelijk kan worden gedaan. Bereken op basis van de gewenste verhouding van DOTA tot hCD19-mAb de hoeveelheid DOTA-NHS-ester die aan hCD19-mAb moet worden toegevoegd.nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg DOTA → mg/ml DOTA/DMSO → ml DMSO → verdunningsfactor van DOTA/DMSO-oplossing Weeg 1-2 mg van de DOTA-NHS-ester af en voeg zorgvuldig het juiste volume (berekend in stap 3.1.11) DMSO toe aan de DOTA-NHS-ester; Mengen en draaien. Pipeteer het berekende volume van de DOTA-NHS-esteroplossing (stap 3.1.12) in de hCD19-mAb-oplossing; veeg de buitenkant van de pipetpunt af voordat u deze toevoegt om er zeker van te zijn dat er geen extra DOTA-NHS-ester wordt toegevoegd (zonder de hoeveelheid in de pipet te veranderen). Meng voorzichtig en draai naar beneden. Zet in de koelkast (4 °C) om een nacht te reageren (12-16 uur). Zuivering en concentratieKoel de centrifuge af tot 4 °C voor de bufferwisselstappen van de centrifugaalconcentrator; plaats een metalen PCR-buisblok op droogijs om het geconjugeerde snel in te vriezen. Haal de DOTA-hCD19-mAb-reactie uit de koelkast en blus door TRIS-buffer van biologische kwaliteit toe te voegen: 10% van het totale reactievolume. Verwijder 10-20 μg van het monster voor massaspectrometrie-analyse. Conditioneer de ontziltingskolom(men) zoals hierboven beschreven (stappen 3.1.1-3.1.5) met 0,1 M ammoniumacetaatbuffer, pH 5,5. Buffervervang de DOTA-hCD19-mAb-oplossing door ammoniumacetaat (stappen 3.1.1-3.1.8). Concentreer de DOTA-hCD19-mAb-oplossing: voeg de oplossing toe aan een centrifugaalconcentrator met een molecuulgewicht van 50 kDa volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor volume. Centrifugeer bij 4.000 × g gedurende 10 minuten (of totdat het volume met 80%-90% is verminderd); Gooi de doorstroom weg. Herhaal dit nog negen keer (10 in totaal): voeg voldoende ammoniumacetaat toe om het volume terug te brengen naar het maximaal aanbevolen volume.OPMERKING: Het totaal moet zijn wat aanvankelijk is toegevoegd, inclusief wat er nog over is in de kolom, meestal 400-450 μL voor een centrifugaalconcentrator met een capaciteit van 500 μL.Spoel de reactieflacon met ammoniumacetaatbuffer om eventuele resterende DOTA-hCD19-mAb op te halen; Voeg het wasgoed toe aan de centrifugaalconcentrator. Centrifugeer bij 4.000 × g gedurende 10 min.NOTITIE: De centrifugetijd kan bij volgende spins worden verkort als het volume in minder tijd wordt verlaagd tot 80%-90%. Verwijder de eiwitoplossing uit de centrifugale concentrator. Let op het totale volume van de DOTA-hCD19-mAb.Voeg in centrifugaalconcentrator 2 voldoende ammoniumacetaatbuffer toe voor een totaal volume van 100 μL en pipet om te mengen. Sluit de centrifugaalconcentratorkolom af en keer om. Draai gedurende 2 minuten op 4.000 × g om de oplossing op te vangen. Overbrengen naar een nieuwe buis. Gebruik in centrifugaalconcentrator 500 een pipet om de mAb-oplossing uit de centrifugaalconcentrator op te vangen; Voeg toe aan een nieuwe tube. Meet de concentratie met behulp van een UV-VIS spectrofotometer. Als de concentratie hoger is dan 2 mg/ml, verdunnen met ammoniumacetaat tot 2 mg/ml. Aliquot 100 μg per PCR-buis (ongeveer 50 μL); label de buisjes met DOTA-hCD19-mAb, datum, massa en concentratie. Draai de flesjes naar beneden. Vries de DOTA-hCD19-mAb snel in op het gekoelde PCR-blok op droogijs (of vries in op droogijs). Zodra alle monsters zijn ingevroren, plaatst u ze in een vriezer van -80 °C. Meet het aantal DOTA per hCD19-mAb met behulp van massaspectrometrie. Bewaar een monster van ongeconjugeerd (zuiver) antilichaam van elke conjugatie om de verhouding te berekenen. Gebruik vergelijking (1) hieronder; molecuulgewicht wordt afgekort als MW.(1) Radioactieve etiketteringNOTITIE: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) voor het omgaan met radioactiviteit, inclusief een laboratoriumjas, handschoenen en een persoonlijke lichaams- en ringdosismeter, volgens de institutionele voorschriften. Onderzoek en vervang handschoenen regelmatig om radioactieve besmetting te voorkomen. Gebruik loodafscherming en vergroot de afstand tot de radioactieve bron door deze indien mogelijk met een tang te hanteren.Breng radioactiviteit over van de transportflacon naar een nieuwe injectieflacon met behulp van een pipet. Meet de radioactiviteit. Verwijder een aliquot voor de eerste radiolabelingreactie. Voeg 50 μL ammoniumacetaat (pH 5,5) per 1 mCi van 64Cu-CuCl3 toe. Meet de pH door 1 μL te pipetteren op een pH-strip met een bereik dat 5,5 opvangt met voldoende resolutie om onderscheid te maken tussen 5 en 6. Als de pH niet 4-5,5 is, verander deze dan met 1 M NaOH of 0,1 M HCl. Voeg kleine hoeveelheden toe, 1-5 μL, van 1 M NaOH als de pH lager is dan 4 of 0,1 M HCl als de pH hoger is dan 5,5 totdat de juiste pH is bereikt. Meng bij elke toevoeging grondig, draai naar beneden en meet de pH zoals hierboven beschreven. Noteer elke toevoeging en verwijdering van een oplossing (inclusief het controleren van de pH) zodat het uiteindelijke volume kan worden berekend. Zodra de optimale pH is bereikt, voegt u 10 μg DOTA-hCD19-mAb toe per 1 mCi van 64Cu-CuCl3. Meng voorzichtig en draai kort om. Plaats de reactieflacon op een thermomixer die is ingesteld op 37 °C en 400 omwentelingen per minuut (rpm). Blus na 30 minuten de reactie: deel het totale reactievolume door 50 en voeg dat volume van 0,5 M EDTA toe aan het reactiemengsel. Bepaal de etiketteringsefficiëntie met behulp van instant dunnelaagchromatografie (ITLC) om het percentage gebonden en vrij koper in de oplossing te meten.Knip stroken TLC-papier van 1 cm breed. Markeer 1 cm van de boven- en onderkant van de strip en maak een buis (conische kolf van 50 ml) met mobiele fase van minder dan 1 cm citroenzuur van 0,1 M (het niveau van de mobiele fase moet lager zijn dan de markering van 1 cm op de strip wanneer deze in de buis wordt geplaatst). Pipetteer 1 μl van de reactieoplossing op de strip aan de onderste 1 cm markering (oplosmiddelvoorkant) en plaats de strip in de buis. Kijk totdat het oplosmiddelfront de bovenste markering van 1 cm bereikt, verwijder de strip en wikkel deze in een stuk plasticfolie. Plaats de strip op het platform en haal deze door een radio-TLC-beeldscanner. Zoek naar de radioactief gelabelde mAb aan de oorsprong en de vrije 64Cu die meereist met het mobiele fasefront (Figuur 2). Als het percentage vrij koper minder dan 5% is (95% etiketteringsefficiëntie), ga dan verder met injectie bij dieren. Als het percentage vrij koper groter is dan 5%, ga dan verder met zuiveren.OPMERKING: Het percentage vrij koper hangt over het algemeen af van de verhouding DOTA-mAb tot 64Cu, reactietijd, pH en temperatuur. De reactieomstandigheden moeten door elke gebruiker worden geoptimaliseerd voor elke nieuwe mAb om consistente resultaten te garanderen. Zuivering via een wegwerp zwaartekrachtkolom van DNA-kwaliteitConditioneer een wegwerpbare zwaartekrachtstroomkolom van DNA-kwaliteit (ontzoutings-/bufferuitwisselingskolom) volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Plaats de wegwerpbare zwaartekrachtkolom van DNA-kwaliteit op een ringstandaard of ander instrument achter voldoende loden afscherming; Zorg ervoor dat het apparaat stabiel en gemakkelijk verplaatsbaar is. Plaats de buis onder de kolom. Pipeteer het ruwe reactiemengsel op de hars van de zwaartekrachtstroomkolom. Wacht tot alle vloeistof in de hars is gestroomd. Pipetteer voldoende PBS om het volledige volume (ruw product plus PBS) op 500 μl te brengen. Plaats de kolom over centrifugebuisjes van 1.5 ml met het label 1-10. Voeg 1 ml PBS toe aan de kolom. Verzamel vijf druppels in elke buis totdat de stroom is gestopt.NOTITIE: Er kunnen minder dan 10 buizen nodig zijn. Sluit de onderkant van de kolom af en meet de resterende radioactiviteit. Meet elke injectieflacon met doorstroom. Maak voor elke injectieflacon met meer dan 50 μCi een ITLC per stap 3.3.7 om het percentage gebonden koper in elke fractie te meten.OPMERKING: De eerste één of twee breuken bevatten alleen de mobiele fase; de radioactief gelabelde mAb zal als eerste elueren (meestal fracties 2 of 3 tot en met 5 of 6) en de vrije 64Cu zal als laatste elueren (sommige zullen aan de kolom blijven plakken). Het percentage gebonden 64Cu kan variëren tussen fracties. Combineer de fracties met een binding van meer dan 95% (minder dan 5% vrij koper); Gebruik de oplossing voor injectie. Voer desgewenst HPLC uit om radiolabeling5 te bevestigen en de molaire activiteit te berekenen. Bewaar een aliquot om de concentratie op een UV-VIS spectrofotometer te meten nadat deze 10 halfwaardetijden (127 uur of 5,3 dagen) is vervallen. 4. Bereiding van de dosis OPMERKING: Draag voordat u de dosis hanteert de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder laboratoriumjassen, lichaams- en vingerdosimeters en handschoenen. Injecteer 64Cu-DOTA-hCD19-mAb 18-24 uur voorafgaand aan de PET-scan, om een adequate circulatie van de radiotracer in het lichaam mogelijk te maken. Plaats de loodcontainer met de 64Cu-DOTA-hCD19-mAb direct achter de loodafscherming. Schakel de geigerteller in om mogelijke besmetting te controleren.NOTITIE: Wissel regelmatig van handschoenen bij het hanteren van radioactief materiaal. Het wordt aanbevolen om tijdens het trekken van de doses dubbele handschoenen aan te trekken om snel van handschoen te kunnen wisselen. Plaats verontreinigde scherpe voorwerpen en afval altijd in de daarvoor bestemde afgeschermde afvalruimte. Verdun de 64Cu-DOTA-hCD19-mAb tot een geschikte concentratie in een plastic centrifugebuisje met een lage binding van 1,5 ml.OPMERKING: De 64Cu-DOTA-hCD19-mAb bindt zich aan plastic als deze niet laag bindt; 64 okt.Cu bindt zich aan glas.Verdun de radiotracer in zoutoplossing om radiolyse te voorkomen en het trekken van consistente doses te vereenvoudigen. Bereid doses voor om indien mogelijk tussen 75 en 150 μCi in 100 μL toe te dienen. Zorg ervoor dat het maximale totale geïnjecteerde volume niet hoger is dan 10% van het lichaamsgewicht van de muis. Gebruik een insulinespuit van 500 μl (50 cc) om de dosis uit de plastic buis met lage binding op te zuigen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit zitten, aangezien deze intraveneus wordt geïnjecteerd.Etiketteer de spuiten vooraf met de bijbehorende diernummers. Noteer de dosisactiviteit en -tijd in een laboratoriumnotitieboekje voor gegevensanalyse. Houd de doses klaar voor injectie zodra de dieren zijn gekatheteriseerd om de tijd onder narcose te verkorten. Nadat de doses zijn voorbereid, bereidt u een standaard (fantoom) voor om te scannen om een kalibratiefactor te genereren.Vul een conische buis van 15 ml met 50-75 μCi activiteit verdund in water (of PBS).NOTITIE: Zorg voor een grondige menging van de oplossing. De standaard kan vrij zijn 64Cu die overblijft na etikettering.Meet de hoeveelheid activiteit in de norm en noteer de tijd. 5. Canulatie en injectie OPMERKING: Zie eerder beschreven methoden 6 voor intraveneuze canulatie van muizen voor injectie van de radiotracer6. Weeg en scoor de muizen op ernst van de ziekte zoals beschreven in rubriek 2.1 voordat de muizen worden verdoofd in een knockdown-doos gevuld met 1,5-3% isofluraan ter voorbereiding op toediening van radiotracer.OPMERKING: Deze muizen worden geïnjecteerd op het tafelblad, niet op de PET-scanner zoals eerder beschreven. Het is niet nodig om de katheters op hun plaats te lijmen voor injectie, omdat de muizen niet worden verplaatst tussen canulatie en injectie. Zodra een muis is gecanuleerd, steekt u de naald in het uiteinde van de katheter en injecteert u langzaam. Na de injectie volgt met een kleine spoeling met zoutoplossing door de katheter om ervoor te zorgen dat de volledige dosis wordt geïnjecteerd.OPMERKING: Het volume moet ongeveer gelijk zijn aan het dode volume van de katheter, dat 50 μL is voor de katheters die door de auteurs worden gebruikt.Injecteer over een stuk laboratoriumdoekje om eventuele druppels radiotracer op te vangen; Neem dit mee bij het meten van de restdosis. Noteer het tijdstip van injectie in een laboratoriumnotitieboekje. Verwijder de canule onmiddellijk na de injectie. Meet de canule, doseerspuit en het weefsel met behulp van een dosiskalibrator om de resterende dosis te bepalen die niet in de muis is geïnjecteerd.Noteer de activiteit en tijd in een labnotitieboek. Nadat de muizen zijn geïnjecteerd, labelt u hun kooien met een kooikaart die aangeeft dat de muizen radioactief zijn. Registreer en log de kooien volgens de richtlijnen van de instelling. Plaats de muizen vervolgens in een aangewezen radioactieve opslagplaats. 6. PET/CT-beeldvorming Voer PET-beeldvorming uit 18-24 uur na de injectie van 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. Weeg en scoor de muizen voordat ze worden gescand.OPMERKING: De gebruiksaanwijzing van de scanner is afhankelijk van de scanner die wordt gebruikt.Zorg ervoor dat de röntgencomponent van de PET/CT-scanner is opgewarmd en klaar is voor opname. Open de software voor het verwerven van PET-scanners op de computer. Klik in het vervolgkeuzemenu Investigator Login op de juiste laboratoriuminformatie. Maak op de pagina Project een nieuw project aan of selecteer een bestaand project in het vervolgkeuzemenu. Wanneer de initialisatieprompt automatisch op het scherm verschijnt, klikt u op Home Bed en wacht u tot het bed naar huis gaat. Klik vervolgens op Opwarmen CT.Zorg ervoor dat de CT-afschermingsdeur gesloten is om de CT op te warmen. Terwijl de scanner aan het opwarmen is, scoor je de EAE-muizen en injecteer je ze subcutaan met 0,2-0,4 ml warme zoutoplossing in de flank voor hydratatie. Nadat de scanner is opgewarmd, gaat u terug naar de computer om de PET-scans voor het onderzoek in te stellen.OPMERKING: Deze kunnen voorafgaand aan de dag van de scan worden ingesteld.Klik onder het kopje Recente onderzoeken op Nieuw onderzoek maken. Vul de naam van het onderzoek, het protocol, de verbinding en de informatie over de proefpersoon in.Als u een PET/CT uitvoert, selecteert u eerst PET-protocol en selecteert u vervolgens CT-protocol.OPMERKING: Doorgaans is een standaard CT voldoende voor het scannen van het EAE-muismodel. Een CT-scan duurt 1 minuut en wordt verkregen met binning op 2 x 2 bij een spanning van 80 kVp, een stroom van 150 μA en 720 projecties. CT-beelden worden gereconstrueerd met behulp van een Modified Feldkamp Algorithm. Kies voor het PET-protocol een statische scan van 10-15 minuten met 64 koperen. Als deze scan nog niet in de lijst met beschikbare protocollen staat, voeg deze dan toe door te klikken op het tabblad Protocollen in het menu Standaard , Nieuw protocol maken | Vervolgkeuzemenu Isotopen . Staat de gewenste isotoop er niet bij, klik dan op Meer | Voeg toe vanuit de bibliotheek en voeg de gewenste isotoop toe. Definieer de scanduur, klik op het keuzerondje voor Static Scan, geef het protocol een naam en klik op Opslaan. Ga terug naar het tabblad Studies en ga verder met het benoemen en instellen van alle gewenste scans voor de dag.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ook één “CT-test”-scan op te zetten met alleen een standaard CT om de bedpositionering van de eerste scan te controleren om een optimale plaatsing te garanderen. Dit zou de eerste scan moeten zijn die voor het onderzoek wordt uitgevoerd. Zodra de scanner klaar is, verdooft u de muizen in een knockdown-doos om ze voor te bereiden op de scan.OPMERKING: In dit stadium zijn de muizen waarschijnlijk erg ziek; Het is een goede gewoonte om de tijd onder narcose tot een minimum te beperken.Breng ooggel aan. Zorg ervoor dat het scanbed met vier muizen is uitgerust met verwarmingselementen, zoals verwarmingskussens of verwarmde lucht, met isofluraan ingesteld op 1.5%-2% en verwarmingskussen ingeschakeld (Afbeelding 3). Leg de muizen in rugligging op het scanbed.Naarmate de EAE-ziekte vordert, wordt de wervelkolom van de muis ernstig gebogen. Scan de muizen terwijl ze op hun rug liggen om de ruggengraat zoveel mogelijk te strekken, waardoor de analyse stroomafwaarts wordt verbeterd. Trek voorzichtig aan de staart van de muis om te helpen bij het strekken van de ruggengraat. Eenmaal in rugligging, plakt u elke muis stevig op zijn plaats met zachte microscooptape. Gebruik een strook tape over het hoofd en een andere voorzichtig over de buik om beweging als gevolg van ademhaling te minimaliseren.Noteer in een labnotitieboekje welke muis zich in welke scanpositie bevindt. Zodra de muizen zijn vastgezet, keert u terug naar de scancomputer om de scanner te bedienen. Open het menu Motion Controller . Klik op het gezichtsveld van het PET-centrum om de muizen op het scanbed in de PET-ring te verplaatsen. Voor de eerste scan van de dag klikt u op CT Center FOV. Eenmaal in positie, voert u de CT-testscan uit om er zeker van te zijn dat de positie correct is; Herhaal dit totdat de bedpositie bevredigend is.Plak een klein stukje witte tape op het scanbed om de juiste plaatsing van het bed voor de rest van het onderzoek te markeren. Zodra het bed op zijn plaats staat voor de PET-scan, start u de scanreeks door op Uitvoeren te klikken.Wacht tot de scanner automatisch van de PET-ring naar de CT gaat. Controleer altijd visueel of de dieren in de juiste positie zijn gekomen voor zowel PET als CT. Noteer de starttijd van de scan in een laboratoriumnotitieboekje voor vervalcorrectie van de dosis die tijdens de gegevensanalyse wordt geïnjecteerd. Nadat de scan is voltooid, laat u de afbeelding reconstrueren. Controleer de gegevens voordat u de dieren verwijdert.OPMERKING: 3D-geordende reconstructie van subsets verwachtingsmaximalisatie (OSEM) duurt ongeveer 5 minuten voor een statische scan. Controleer en keur de gegevens visueel goed, waarbij u de milt als positieve controle gebruikt, aangezien dit weefsel een groot aantal B-cellen bevat. Haal de dieren uit het scanbed en plaats ze in een met isofluraan gevulde knockdown-doos ter voorbereiding op perfusie en daaropvolgende dissectie. Herhaal stap 6.5-6.12 voor de overige muizen in het onderzoek. Wanneer alle muizen zijn gescand of bij het scannen van een groep die een open plek in het scanbed heeft, scant u de standaard die in stap 4.6 is voorbereid. 7. Dissectie voor ex vivo gammatelling en autoradiografie Zorg ervoor dat alle gammatellings- en centrifugebuisjes vooraf zijn gewogen voordat u gaat ontleden. Voer euthanasie uit via perfusie, zoals eerder beschreven6, met PBS en thoracotomie terwijl de muizen diep verdoofd zijn (continue inhalatie van 4% isofluraan, 2 L/min 100% O2). Om het beenmerg te verwijderen, snijdt u beide dijbenen bij de knie en het bekken door. Zorg ervoor dat beide koppen van het dijbeen zijn verwijderd.Plaats beide dijbenen in een centrifugebuis van 0,5 ml met een gat aan de onderkant (met een naald van 20 G) en waarvan het deksel is afgesneden. Plaats het buisje van 0,5 ml met de dijbenen in een centrifugebuisje van 1,5 ml met het deksel eraf. Plaats de hele buisopstelling in een minicentrifuge. Centrifugeer gedurende 4 minuten op 4.500 × g.OPMERKING: Het beenmerg moet door het gat in de 0.5 ml centrifugebuis worden losgemaakt en op de bodem van de 1.5 ml centrifugebuis bezinken.Scheid de buizen. Weeg de lege dijbenen in de centrifugebuis van 0,5 ml. Weeg het beenmerg in de centrifugebuis van 1,5 ml. Plaats elk centrifugebuisje in gammatelbuisjes. Verwijder de hersenen met een tang en schaar en zorg ervoor dat de hersenstam intact blijft. Plaats de hersenen in een gamma-telbuis. Noteer het droge gewicht, spoel het met PBS en bewaar het op ijs totdat het klaar is om te tellen. Voer de volgende stappen uit om het ruggenmerg te verwijderen.Verwijder de huid en vacht door een incisie te maken langs de dorsale zijde van het dier om de wervelkolom bloot te leggen (Figuur 1). Scheid de lumbale (L) van de cervicale (C) en thoracale regio’s door langs drie dwarsvlakken rond en door de wervelkolom te snijden: aan de basis van de nek (C1-wervel) (Figuur 1D, nummer 1); aan de basis van de ribbenkast (L1-wervel) (figuur 1D, nummer 2); aan de basis van het bekken (L5-wervel) (Figuur 1D, nummer 3). Snijd onder de ribbenkast (Figuur 1D, nummer 2). Snijd direct boven het heiligbeen om het lumbale ruggengraatgebied te scheiden. Knip de wervelkolom voorzichtig af vanaf het bekkenuiteinde totdat het lumbale ruggenmerg zichtbaar is (Figuur 1D, nummer 3). Snijd de omliggende weefsels af om de lumbale en cervicale/thoracale gebieden van de wervelkolom te isoleren (Figuur 1D, nummers 4 en 5). Om het ruggenmerg te verdrijven, gebruikt u een injectiespuit met schuifpunt (3-10 ml) gevuld met PBS. Maak met duim en wijsvinger een afdichting tussen de spuit en de wervelkolom.Duw de PBS voorzichtig door de spuit om het ruggenmerg op een absorberend kussentje te verdrijven (Figuur 1E); Herhaal dit voor beide spinale regio’s. Plaats de ruggenmergweefsels in een gammatelbuis. Noteer het drooggewicht en voeg PBS toe om ervoor te zorgen dat het weefsel zich op de bodem van de buis bevindt om uitdroging te voorkomen. Plaats de buis op ijs totdat hij klaar is om te tellen. Verdrijf het cervicale/thoracale ruggenmerg uit het craniale uiteinde en het lumbale ruggenmerg uit het caudale uiteinde van de wervelkolom (figuur 1E). 8. Ex vivo gammatelling Open de gammatellersoftware. Navigeer naar de werklijst en selecteer het gewenste protocol, zoals een 30 s telprotocol voor 64Cu. Bereid ten minste drie standaarden voor in afzonderlijke buizen. Voer ze nu uit voor gebruik in de analyse (stap 10.2). Streef ernaar om drie replicavolumes en hoeveelheden activiteit te maken in drie afzonderlijke buizen.OPMERKING: Een volume van 500 μL geeft goede resultaten. Hoewel de activiteit wordt bepaald door de gebruikte machine, werkt 10 μCi over het algemeen goed. Plaats de normen in een rek met de streepjescode die overeenkomt met het gewenste protocol dat moet worden uitgevoerd. Plaats het rek op de gammateller. Plaats na het noteren van de orgaangewichten de buisjes met de organen op het gammatelrek na de buisjes met de standaarden.OPMERKING: Organen die van belang zijn voor dit model kunnen axiale lymfeklieren, bloed, beenmerg, hersenen, cervicale lymfeklieren, dijbeen, hart, lever, lumbaal ruggenmerg, spier, milt, staart en cervicaal/thoracaal ruggenmerg zijn. Zet een rek met een stopbarcode achterin de gammateller. Druk op de afspeelknop op de computer. Druk indien mogelijk pas op Play als er meerdere rekken of organen moeten worden gebruikt, zodat alle buizen continu in één bestand kunnen worden geteld. Zorg ervoor dat er voor elke run een rek met een stopbarcode achter in de gammateller staat. Ren totdat alle monsters zijn geteld. Sla het bestand op en exporteer het. 9. Ex vivo autoradiografie (ARG) van CZS-weefsel Volg eerder gepubliceerde stappen voor zowel hersen- als ruggenmerg-ARG (met uitzondering van stappen 2-6 beschreven door Chaney et al., aangezien de muizen al zijn geïnjecteerd met radiotracer van de PET-scan)6.NOTITIE: Specifieke instructies voor het voorbereiden van de ARG-cassette van het ruggenmerg staan hiervermeld 6. Nadat de gammatelling voor het lumbale en cervicale/thoracale ruggenmerg is voltooid, plaatst u de buisjes onmiddellijk op ijs totdat alle CZS-weefsels zijn geteld.OPMERKING: Raadpleeg de eerder gepubliceerde methode voor ARG van de hersenen6. Kantel de buisjes voorzichtig zodat het ruggenmerg op een absorberend kussentje kan vallen. Als het ruggenmerg aan de zijkant van de buis plakt, spoel dan voorzichtig met koude PBS en kantel de buis opnieuw. Droog elk ruggenmerg zorgvuldig af door voorzichtig te deppen met een laboratoriumdoekje. Leg de gedroogde ruggenmerg op een georganiseerde manier op een dik zwart stuk papier.Label naast het ruggenmerg met een witte pen voor gemakkelijke identificatie. Laat ruimte in de hoeken en in het midden van het zwarte papier om stapels van drie microscoopglaasjes te plaatsen om als afstandhouders te fungeren om compressie van het ruggenmerg te voorkomen wanneer de ARG-cassette gesloten is. Gebruik 5-7 stapels. Zodra alle lumbale en cervicale/thoracale ruggenmerg op het zwarte papier zijn geplaatst en gelabeld, plaatst u het stuk papier voorzichtig in de ARG-cassette. Plaats de open cassette op een dienblad met droogijs om het ruggenmerg te bevriezen. Eenmaal bevroren, plaatst u voorzichtig plasticfolie tussen het digitale fosforopslagscherm en het ruggenmerg en plaatst u het scherm bovenop de monsters. Sluit de cassette onmiddellijk en plaats deze in de vriezer van -20 °C gedurende ongeveer 10 halfwaardetijden (~127 uur). Wanneer de belichtingstijd is verstreken, scant u de film met een fosforimager. Analyseer het resulterende digitale beeld (zie sectie 12 voor instructies). 10. Analyse van biodistributiegegevens Stel een “Dose Correction”-spreadsheet op om de tijdcorrectie voor het radioactieve verval wiskundig te bepalen, waardoor stralingsdoses worden genormaliseerd en vergelijkingen tussen proefpersonen mogelijk worden.Corrigeer alle doses naar de injectietijd, rekening houdend met de resterende activiteit die na de injectie in de spuit en katheter achterblijft. Gebruik de standaarden die in stap 8.2 zijn opgesteld, neem het gemiddelde van de activiteitshoeveelheid (μCi) en het genormaliseerde aantal per minuut (CPM). Deel de gemiddelde CPM door het gemiddelde standaard activiteitsbedrag om CPM/μCi te krijgen.OPMERKING: Zorg ervoor dat de activiteitshoeveelheid voor elke norm vervalgecorrigeerd is voor het tijdstip waarop de gammateller de CPM van de normen telt. De gammateller moet alle CPM-waarden normaliseren naar de starttijd van het protocol. Stel de spreadsheet “Resultaten” in om het uiteindelijke percentage geïnjecteerde dosis per gram weefsel (%ID/g) voor elk monster te berekenen.Corrigeer de genormaliseerde CPM van de gammateller voor elk geteld monster naar de injectietijd van het dier.OPMERKING: Vervalcorrectie kan op elk tijdstip plaatsvinden; zorg ervoor dat alle doses en CPM-waarden worden gecorrigeerd voor verval tot hetzelfde tijdstip. Normaliseer de voor verval gecorrigeerde CPM naar de massa van elk monster om de CPM per monster te bepalen. Bereken de totale geïnjecteerde CPM door de CPM in de staart af te trekken van de berekende geïnjecteerde CPM.OPMERKING: De staart hoeft niet massagecorrigeerd te worden, aangezien deze CPM-waarde gewoon wordt afgetrokken van de totale geïnjecteerde CPM om rekening te houden met eventuele extraveneuze tracer van injectie. Deel de CPM per massa door de totale geïnjecteerde CPM om %ID/g te berekenen. Stel een “Samenvatting”-spreadsheet in om de uiteindelijke resultaten weer te geven voor invoer in grafische software en daaropvolgende gegevensvisualisatie en statistische analyse. 11. Analyse van PET-afbeeldingen Open de PET-analysesoftware. lik op Bestand |Open lokale data | DICOM. Zoek het gewenste bestand (DICOM-formaat). Open zowel de PET als de CT. Stel in de Data Manager het PET- en CT-contrast in op de gewenste niveaus. Registreer en snijd individuele muizen bij.Selecteer in het navigatiemenu het tabblad Heroriëntatie/registratie. Ga naar het menu Rigide op dit tabblad. Wijs de CT-scan (0) aan als de Vaste scan en de PET-scan (1) als de Bewegende scan. Kies voor Rigid Transformation en Fast Quality. Klik op Registreren. Nadat de registratie is voltooid (5-10 min), klikt u op het vinkje om de registratie op te slaan. Inspecteer de gegevens visueel om er zeker van te zijn dat de registratie is geslaagd. Exporteer de sessie door te klikken op Bestand | Sessie | Exporteren. Snijd vervolgens elke muis bij in een volledige lichaamsuitsnede: ga naar het navigatiemenu en klik op Bijsnijden. Sleep de zijkanten van elke doorsnede vanaf de buitenrand naar binnen. Zodra de gewenste muis strak is bijgesneden, klikt u op het vinkje en exporteert u de sessie om op te slaan. Snijd vervolgens de hoofden van elke muis bij en zet ze recht voor hersenanalyse met behulp van de handmatige vertaling, rotaties en spiegels in het menu Registratie/heroriëntatie . Exporteren om op te slaan. Analyseer het ruggenmerg.Om te beginnen met de analyse van interessegebieden (ROI’s) in het ruggenmerg, opent u de 3D ROI-tool vanuit het navigatiemenu . Gebruik onder het kopje ROI’s het plusteken onder aan het menu om zes ROI’s te maken: lumbale ROI, cervicale/thoracale ROI, lumbaal skelet, thoracaal skelet, lumbale ruggenmerg, thoracale ruggenmerg.OPMERKING: De lumbale en cervicale/thoracale ROI’s zijn gegeneraliseerde grote ROI’s die zullen worden gebruikt om de skelet-ROI’s te maken (Figuur 4). Om visuele interferentie van het PET-signaal bij deze stap te voorkomen, klikt u op F3 om de PET uit te schakelen. Ga naar de bovenkant van de 3D ROI Tool Operator. Klik op de ononderbroken stip rechts van het cursorsymbool om de 3D-tekenmodus en het menu Erode/Dilate te openen. Selecteer Bol en verander de grootte in 20 pixels. Stel Dilate in op +5.Ga voordat u verder gaat naar de onderkant van het menu. Zorg ervoor dat de lumbale ROI is geselecteerd, aangezien dit de eerste ROI is die moet worden getrokken. Zoek op de CT de L6-wervel van de wervelkolom (waar de wervelkolom de heupen ontmoet). Begin met één wervel boven L6 en teken een ruwe ROI Lumbale ROI over de vijf wervels boven de heupen (L1-L5 wervels). Schakel vervolgens over naar Cervicale/Thoracale ROI en traceer de rest van de wervelkolom naar de basis van de schedel.OPMERKING: Dit hoeft niet nauwkeurig te zijn, omdat het wordt gebruikt om aan te geven waar Otsu-drempels moeten plaatsvinden in stap 11.4.8. Nadat u de algemene ROI’s hebt getekend, gaat u naar de bovenkant van de operator. Selecteer het menu Segmentatie-algoritmen . Selecteer in het vervolgkeuzemenu Otsu-drempels. Selecteer voor de invoer Lumbale ROI. Zorg ervoor dat onder aan het menu Lumbaal skelet is geselecteerd. Zorg ervoor dat in het vervolgkeuzemenu naast Afbeelding de CT-scan is geselecteerd en klik op Toepassen. Herhaal dit voor cervicale/thoracale ROI en thoracaal skelet.Als de Otsu-drempel de wervelkolom niet voldoende benadrukt, gebruik dan globale drempels en verander de Min-waarde in 350 en de Max in 3,500 voor handmatige drempels en pas indien nodig aan om de wervels te isoleren. Nadat u Otsu-drempels hebt gebruikt om de Skeleton-ROI’s te maken, keert u terug naar het menu Navigatie (cursorpictogram). Verwijder of vink de H-kolom (verbergen) aan voor zowel de ruwe lumbale als cervicale/thoracale ROI’s om ze te verbergen. Vink de kolom I (onveranderlijk) aan voor beide skelet-ROI’s, zodat ze niet kunnen worden bewerkt. Keer ten slotte terug naar de bovenkant van de 3D ROI Tool Operator en ga naar het 3D Paint-menu om de ROI’s van het ruggenmerg te tekenen.Selecteer het gereedschap Bol opnieuw en traceer het ruggenmerg in het skelet voor zowel lumbaal als thoracaal, waarbij u ervoor zorgt dat de juiste ROI onder aan het menu wordt geselecteerd. Om een ROI te wissen, klikt u op Command/Control en tekent u over het te wissen onderdeel. Controleer de ROI van het ruggenmerg van alle drie de vlakken om er zeker van te zijn dat er geen ROI buiten de wervelkolom wordt getrokken. Exporteer de resultaten van de ruggenmerganalyse.Als het PET-signaal is uitgeschakeld in stap 11.4.3, drukt u op F3 nadat de ROI’s van het ruggenmerg zijn getekend om de PET weer in te schakelen, of selecteert u de Visual Controller (VC) en klikt u op de PET-balk. Ga terug naar het menu Navigatie (cursorpictogram). Klik op het rasterpictogram om Tabel weer te geven. Kopieer de tabel naar spreadsheetsoftware en sla deze op. Exporteer ten slotte het bestand in PET-analysesoftware, zoals hierboven beschreven, om de getrokken ROI’s op te slaan. Analyseer de hersenen met behulp van een semi-geautomatiseerde 3D-atlas.Open het hoofdbijsnijdbestand. Importeer de hersenatlas van de muis door naar het menu Geavanceerde modules te gaan en de 3D Brain Atlas Tool te selecteren. Zorg ervoor dat de referentie is ingesteld op CT en dat de bijsnijdoptie niet is aangevinkt. Stel een pad in voor de uitvoermap. Wijzig in Geavanceerde instelling Transformeren in Versor-Affine. Behoud alle andere standaardinstellingen. Klik op Uitvoeren. Pas de atlas handmatig aan in het menu Heroriëntatie/Registratie en gebruik de CT van de schedel als richtlijn voor het passen van de atlas.Wees zeer voorzichtig als schaalvergroting nodig is, omdat dit de volumes van de hersenstructuur sterk kan beïnvloeden. Klik op het vinkje wanneer de aanpassing is voltooid. Voer de atlas opnieuw uit met 3D-ROI’s importeren geselecteerd. Exporteer het bestand om de atlas op te slaan die op de bijgesneden kop is gemonteerd. Na het tekenen en exporteren van alle ROI’s van de gewenste organen, berekent u een standaard bindingscorrectiewaarde. Corrigeer alle gegevens en converteer naar %ID/g zoals eerder beschreven6. Normaliseer naar het orgaan dat past bij het diermodel, zoals het hart, om te normaliseren naar radiotracer aanwezig in de bloedpool. 12. Ex vivo autoradiografie-analyse Open het digitale beeldbestand (.gel) met behulp van de beeldanalysesoftware. Pas de helderheid en het contrast aan tot de gewenste drempelwaarde. Pas desgewenst een geschikte kleuropzoektabel toe.OPMERKING: Koninklijke of grijze tinten worden aanbevolen voor het gemak van visualisatie.