Mikro Gözenekli Tavlanmış Partikül İskelesi için Mikrojel Yapı Taşlarının Mikroakışkan Sentezi

1. MethMAL tavlama makromer sentezi NOT: Bu protokol özellikle 1 g PEG-maleimid modifiye etmek içindir, ancak daha büyük partiler yapmak için ölçeklendirilebilir. Karıştırma çubuğuna sahip küçük bir cam beherde 10 mL 1x fosfat tamponlu saline (PBS, pH 7.4) 1 g 4 kollu 20 kDa PEG-maleimid ekleyin. PEG tamamen çözünene kadar (~ 30 dakika) çözeltiyi 300 rpm’de karıştırın. 300 rpm’de karıştırma ile reaksiyona 14.65 mg 2-aminoetantiol (maleimid [MAL] molar oranına 0.67: 1 tiol [SH]) ekleyin.NOT: 2-aminoetanitol üzerindeki tiol grupları, Michael tipi ilaveyle PEG-MAL’ın yaklaşık üç koluna eklenecek ve amin uç grupları bırakılacaktır.Eklenecek 2-aminoetantiol miktarı için aşağıdaki örnek hesaplamaya dikkat edin:NOT: Çok az miktarda ölçmekten kaçınmak için, 100 mg 2-aminoetantiol 1 mL 1x PBS (pH 7.4) içinde çözün ve bu çözeltinin 146.5 μL’sini reaksiyona ekleyin. Adım 1.2.’den sonra 1 saat ve 10 dakika bekleyin, ardından yeni bir cam beherde 5 mL 1x PBS’de (pH 7.4) 160.1 mg 4-(4,6-Dimetoksi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinyum klorür (DMTMM, PEG’e 12:1 molar oran) ve 32,77 μL metakrilik asit (PEG’e 8:1 molar oran) karıştırın ve 300 rpm’de karıştırarak 50 dakika reaksiyona sokun.NOT: Bu adımda, metakrilik asit, daha sonra PEG üzerindeki mevcut amin gruplarına bağlanabilen oldukça reaktif bir ester oluşturmak için DMTMM ile reaksiyona girer.Eklenecek DMTMM miktarını hesaplamak için aşağıdaki örnek hesaplamaya dikkat edin: Eklenecek metakrilik asit miktarını hesaplamak için aşağıdaki örnek hesaplamaya uyun: Metakrilik asit/DMTMM çözeltisini 20 kDa PEG-MAL/2-aminoetantiol çözeltisi ile beherin içine ekleyin. Beherin içine 53.56 μL trietilamin (metakrilik aside 1:1 molar oran) ekleyin ve 300 rpm’de karıştırarak gece boyunca reaksiyona girmesine izin verin. Toz ve diğer kirleticilerin beherin içine girmesini önlemek için beheri folyo ile örtün.Eklenecek trietilamin miktarı için aşağıdaki örnek hesaplamaya uyun: Reaksiyonu yılan derisi diyaliz tüpüne aktarın (moleküler ağırlık kesme: 3.500 Da). Diyaliz tüpünü, 300 rpm’de karıştırarak 3 gün boyunca deiyonize (DI) suya (hacim boruyu tamamen kaplamalıdır) 1 M NaCl içeren büyük bir beherin içine yerleştirin. Toplam altı yıkama için 1 M NaCl çözeltisini günde 2 kez değiştirin. DI suyunda 6 saat diyaliz. Toplam altı yıkama için DI suyunu her saat başı değiştirin. Reaksiyonu 50 mL’lik bir konik tüpe aktarın ve -80 ° C’de dondurun. Tüpü -70 °C başlangıç sıcaklığında ve 0 °C ila 0.01 °C / dak sıcaklık rampasında en az 72 saat boyunca liyofilize edin. 700 μL kloroform-d içinde 25 mg MethMAL’ı çözerek ve bir NMR tüpüne aktararak numuneyi 1H-NMR için hazırlayın. 1H-NMR spektrumunu edinin.NOT: Bu protokoldeki spektrumlar, aşağıdaki parametrelere sahip 500 MHz’lik bir spektrometre kullanılarak elde edilmiştir: süpürme genişliği = 6.467,3 Hz, zaman gecikmesi = 13,1 s, edinme süresi = 5,1 s, darbe süresi = 5,1 μs ve tarama sayısı = 8. Analiz için, maleimid zirvesini referans olarak entegre edin (~ 6.76 ppm) ve ardından iki metakrilamit zirvesini (~ 5.35 ppm ve 5.6 ppm) entegre edin. Metakrilamit pik alanlarının oranını, metakrilamit ile modifiye edilmiş kolların yüzdesini elde etmek için her üç zirvenin toplam alanına bölün.NOT: Kabul edilebilir bir değişiklik,% 67-75 metakrilamit fonksiyonel grup ikamesidir. MethMAL için örnek 1 H-NMR spektrumu Şekil 1’de gösterilmiştir.İkame denkleminin derecesi olarak denklem (1) kullanın:(1) Resim 1: MethMAL’ın kimyasal yapısı ve 1adet H-NMR spektrumu. (A) Kimyasal yapı: MethMAL tavlama makromeri, üç metakrilamit kolu ile modifiye edilmiş 20 kDa 4 kollu poli (etilen glikol) ‘den oluşur. (B) Bu yapı, PEG-MAL spektrumlarında bulunmayan 5.36 ppm (3) ve 5.76 ppm’de (2) pikler ve 6.71 ppm’de (1) bir tepe oluşturan bir maleimide kolu üretir. Çözücü, kloroform, 7.26 ppm’de bir tepe noktası üretti ve bu numunedeki artık su, 2.2 ppm’de (spektrumlarda etiketlenmiş) bir tepe noktası oluşturdu. MethMAL spektrumlarında, maleimide zirvesi 0.27’lik bir entegre alana sahipti ve metakrilatit zirve alanlarının toplamı 0.73 (0.37 + 0.36) idi. Metakrilamit yüzdesi modifikasyonu% 73 idi (0.73 / (0.27 + 0.73)). Bu rakam Pfaff ve ark.14’ten alınmıştır. Telif Hakkı (2021) Amerikan Kimya Derneği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 2. Mikrojel öncü jelasyon kinetiği NOT: Jelasyon süresi, jel öncü bileşenlerini çözmek için kullanılan tamponun pH’ı ayarlanarak değiştirilebilir. PEG-maleimid hidrojelleri için, daha asidik bir pH tipik olarak daha yavaş jelasyon süresine karşılık gelir, çünkü tiyolat konsantrasyonu daha düşük pH15’te azalır. İstenilen polimer, çapraz bağlayıcı ve diğer jel öncü bileşenlerinin (yani peptitler, glikozaminoglikanlar) konsantrasyonlarını önceden belirleyin. PEG-MAL, RGD ve MethMAL’ı (PEG-omurga) 10x PBS’de (pH 1.5) ve MMP-2 çapraz bağlayıcıyı 1x PBS’de (pH 7.4) çözün.NOT: Bu protokolde, jel öncü çözeltisi, 45.88 mg / mL 4 kollu PEG-MAL (10 kDa), 0.82 mg / mL RGD, 8.06 mg / mL MethMAL ve 4.62 mg / mL MMP-2 çapraz bağlayıcıdan (enzimatik olarak parçalanabilir çapraz bağlayıcı) oluşan yayınlanmış bir formülasyon3’tür. 0,4 mm’lik bir boşluk boyutu, 1,0’lık bir kesme gerinimi, 1,0 Hz’lik bir frekans ve 10.800 s’lik bir süre kullanarak depolama ve kayıp modüllerini izlemek için bir viskozimetre veya eşdeğer bir cihaz hazırlayın.35 mm plakalı rotor (P35/Ti) geometrisini takın. Nemlendirilmiş bir ortamı korumak için geometrinin etrafında nemlendirilmiş bir oda veya nemli bir sünger kullanın. PEG omurgasını ve MMP çapraz bağlayıcıyı 1:1 hacimsel oranda karıştırın. Pipet, viskozimetre aşamasının ortasına jel öncü çözeltisinin 400 μL’sidir. Geometriyi, önceden belirlenmiş 0,4 mm’lik boşluk boyutuna ulaşana kadar yavaşça sahneye indirin ve hemen oda sıcaklığında 6 saate kadar depolama (G’) ve kayıp (G”) modüllerini izlemeye başlayın.NOT: Jelasyonun, depolama modülü kayıp modülünden daha büyük hale geldiğinde başladığı ve jelasyonun depolama modülü platoları olduğunda tamamlandığı kabul edilir. Temsili bir jelasyon kinetik eğrisi Şekil 2’de gösterilmiştir. Şekil 2: Bir viskozimetre tarafından belirlenen bir MAP jel öncü çözeltisinin (pH 4.5) jelasyon kinetiğinin temsili eğrisi. Jelasyon, depolama (G’) modülündeki hızlı artışta başlar ve G’ eğrisi platoları olduğunda jelleşme tamamlanır. G” kayıp modülünü gösterir. Bu rakam Pruett ve ark.3’ten alınmıştır. Telif Hakkı (2021) Wiley-VCH GmBH. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 3. Mikroakışkan cihaz imalatı NOT: Bu protokol, Şekil 3A’da görülebilen de Rutte ve ark.13’ten uyarlanmış bir mikroakışkan adım emülsifikasyon cihazı tasarımının cihaz üretimini açıklamaktadır. Bununla birlikte, bu protokol bir SU-8 gofrete kazınmış herhangi bir cihaz tasarımıyla kullanılabilir. Üretim için uygun temiz oda tesisleri mevcut olmadığı sürece, SU-8 silikon gofret ana imalatının dış kaynak kullanımı önerilir. SU-8 gofret fotomaskesinden ilk polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan cihazını oluşturun.Baz ve kürleme maddesini 10:1 w/w oranında karıştırarak ~200 g PDMS hazırlayın ( bkz. SU-8 gofreti, mikroakışkan tasarım yukarı bakacak şekilde bir kültür kabına yerleştirin (gofretin kenarlarını tabağa bantlayın). Gofret üzerinde 1-1,5 cm kalınlığında bir tabaka oluşturmak için PDMS’yi kabın içine dökün. Herhangi bir kabarcığı çıkarmak için çanağı vakum altına yerleştirin. PDMS’nin katılaşana kadar sertleşmesine izin verin (oda sıcaklığında 24 saat veya 60 ° C’de ~ 2 saat). PDMS kürlendikten sonra, PDMS boyunca bir dikdörtgeni kesmek için dikkatlice bir tıraş bıçağı veya neşter kullanın, böylece gofret üzerindeki tasarımın etrafında 0,5-1 cm’lik bir boşluk vardır.NOT: Çok fazla basınç kullanmayın ve gofrete zarar vermemek (ör. çatlama, çizilme) önlemek için çok nazik olun. Bir spatula’yı kesiklerden birine sıkıştırın ve PDMS’yi gofretten ayırmak için kesimler boyunca kaydırın.NOT: PDMS gofretten ayrıldıkça, PDMS’nin altında bir hava kabarcığı oluşmaya başlayacaktır ( bkz. Şekil 3B). PDMS dikdörtgenini yavaşça çanaktan çıkarmak için spatulayı kullanın.NOT: Gofret üzerindeki PDMS’de ortaya çıkan boşluk, mikroakışkan cihazların kalıbı olacaktır. SU-8 gofret fotomaskesinden sonraki PDMS mikroakışkan aygıtları oluşturun.Baz ve kürleme maddesini 10: 1 oranında karıştırarak kalıp başına ~ 15-20 g PDMS hazırlayın. Gofretin üzerinde 5 mm’lik bir PDMS tabakası oluşturmak için PDMS’yi kalıptaki dikdörtgen boşluğa dökün. Herhangi bir kabarcığı çıkarmak için kalıbı vakum altına alın. PDMS’nin tamamen katılaşana kadar sertleşmesine izin verin (oda sıcaklığında 24 saat veya 60 ° C’de 2 saat). PDMS kürlendikten sonra, PDMS’yi dikdörtgenin kenarlarından kesmek için bir tıraş bıçağı veya neşter kullanın.NOT: Çok fazla basınç kullanmayın ve gofrete zarar vermemek (yani çatlamak) için çok nazik olun. Bir spatula’yı kesiklerden birine sıkıştırın ve PDMS’yi gofretten ayırmak için kesimler boyunca kaydırın.NOT: PDMS gofretten ayrıldıkça, PDMS altında bir hava kabarcığı oluşmaya başlayacaktır. İki giriş ve çıkışta PDMS dikdörtgeni boyunca delikler oluşturmak için 1,5 mm’lik bir biyopsi zımba kullanın ( bkz. Şekil 3B). Tek bir gofret üzerinde birden fazla cihaz varsa, PDMS’yi her cihaz arasında hafifçe puanlamak için bir spatula veya tıraş bıçağı kullanın, ardından PDMS’yi puanlanan çizgiler boyunca yavaşça katlayın, böylece PDMS kendi başına çok temiz bir şekilde ayrılır. PDMS aygıtlarını tozsuz bir kapta saklayın. PDMS mikroakışkan cihazlarını cam slaytlara bağlayın.PDMS mikroakışkan cihazı başına bir cam slayt hazırlayın. Slayttaki tozları temizlemek için bant, filtrelenmiş hava veya izopropil alkol (IPA) yıkamaları kullanın. Bir sonraki adıma geçmeden önce slaytların tamamen kuru olduğundan emin olun. Küçük bir plastik tepsiye yan yana bir cam slayt ve bir PDMS cihazı yerleştirin (96 delikli bir plaka kapağı bunun için iyi çalışır) ve bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Kapıyı ve hava akış valfini kapatın ve vakum pompasını açın. En az 30 saniye çalışmasına izin verin, ardından kapatın. Oksijen tankı gaz tüpünü hava akış valfine bağlayın. Plazma odasının 30 saniye boyunca oksijenle dolmasına izin verin, ardından oksijeni kapatın ve hava akış valfini kapatın. Vakum pompasını açın ve radyofrekans (RF) seviyesini yüksek olarak ayarlayın. Oda mor-pembe bir renge dönene kadar bekleyin ( Şekil 3B’ye bakın). 30 sn geçmesine izin verin. Zamanlayıcı söndüğünde, plazmayı kapatın ve vakumlayın. Ardından, vakumu serbest bırakmak için hava akış valfini yavaşça açın. Tepsiyi plazma temizleyiciden çıkarın. PDMS cihazını yapıştırmak için yavaşça cam kızağın üzerine çevirin. Yapıştırma gerçekleştikçe, PDMS’nin şeffaflığındaki küçük farkı gözlemleyin.NOT: En iyi sonuçları elde etmek için, yapıştırılmış cihazları kullanımdan hemen öncesine kadar 60 °C’de saklayın. PDMS mikroakışkan cihazlarının yüzey işlemesiNovec yağında PFOCTS (trikloro(1H,1H,2H,2H-perflorooktil)silan) seyrelterek yüzey işlemini hazırlayın (1:50). 3-4 cihaz için 1 mL kullanın. Hacmi 1 mL’lik bir şırıngaya aktarın ve 25 G’lik bir iğne takın.NOT: Bu protokolde kullanılan iğneler eğimlidir, bu nedenle keskinlikleri kullanırken dikkatli olun. İstenirse künt iğneler de kullanılabilir. Tedavi edilecek cihaz başına 10-12 cm’lik bir Tygon boru parçası kesin. ~ 7 cm uzunluğunda bir parça PEEK borusu kesin. İğnenin Tygon boru girişlerini delmesini önlemeye yardımcı olmak için Şekil 4A’da gösterildiği gibi Tygon borusunun ucuna birkaç milimetrelik PEEK borusu yerleştirin. Cihazları ısıtılmış odadan çıkarın ve Tygon borusunun PEEK olmayan ucunu sulu giriş deliğine yerleştirin. Yüzey işleme şırıngasının iğnesini PEEK borusuna yerleştirin ve yağ odası çıkış deliğini örtün ( Şekil 3B’ye bakınız). Tedaviyi cihaza yavaşça enjekte edin ve kabarcıklar olmadan cihazı doldurduğundan emin olun. Önce sulu odaların dolmasını, ardından daha küçük kanalların ve ardından yağ odasının dolmasını bekleyin. Tygon borusunu cihazdan çıkarın. Cihaz doldurulduktan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika dinlendirin. 5 mL’lik bir şırıngayı sadece yağ ile doldurun (silan içermez) ve 25 G’lik bir iğne takın. Yüzey işlemini cihazdan giriş ve çıkıştan aspire edin. Tygon borusunu sulu girişe yerleştirin, şırıngayı PEEK borusuna yağ ile yerleştirin ve her cihazı yağ ile yıkayın. Yağı cihazdan aspire edin. Yağı yıkayın. 2 kat daha tekrarlayın. Tygon borusunu çıkarın.NOT: Cihaz kullanıma hazırdır. Resim 3: Mikroakışkan PDMS cihazı. (A) Mikroakışkan cihaz tasarımının bilgisayar destekli tasarım (AutoCAD) çizimi. Mikrojel damlacık oluşumu, büyütülmüş çıkıntıda görüldüğü gibi, yağ kanalının her iki tarafındaki kanallarda meydana gelir. (B) PDMS cihaz üretimine genel bakış. Kısaltma: PDMS = polidimetilsiloksan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 4. Mikrojellerin mikroakışkan üretimi İstenilen polimer, çapraz bağlayıcı ve diğer jel öncü bileşenlerinin (yani peptitler, glikozaminoglikanlar) konsantrasyonlarını önceden belirleyin. PEG-MAL, RGD ve MethMAL’ı (PEG-omurga) 10x PBS’de (pH 1.5) ve MMP-2 çapraz bağlayıcıyı 5 μM biyotin-maleimid ile birlikte 1x PBS’de (pH 7.4) çözün.NOT: Bu protokolde, jel öncü çözeltisi, 45.88 mg / mL 4 kollu PEG-MAL (10 kDa), 0.82 mg / mL RGD, 8.06 mg / mL MethMAL ve 4.62 mg / mL MMP-2 çapraz bağlayıcıdan (enzimatik olarak parçalanabilir çapraz bağlayıcı) oluşan yayınlanmış bir formülasyon3’tür . Aşağıda özetlenen yöntemler ~ 3 mL mikrojel verecektir. Novec yağında stok% 5 FloroSürfaktan en az% 1’e seyrelterek 6 mL yüzey aktif madde çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi 10 mL’lik bir şırıngaya ekleyin.NOT: Florlu yüzey aktif madde su ile karışmaz, bu da saflaştırma adımındaki PBS yıkamaları sırasında jelin sulu faza geçişi sırasında kolayca çıkarılmasını sağlar. Şırınga pompası yüksekliği için uygun uzunlukta üç parça Tygon borusu kesin. İki parça PEEK borusunu ~ 1 inç uzunluğunda kesin. İğnenin Tygon boru girişlerini delmesini önlemeye yardımcı olmak için, Şekil 4A’da gösterildiği gibi iki parça Tygon borusunun ucuna birkaç milimetrelik PEEK borusu yerleştirin. Tygon borusunun PEEK olmayan ucunu mikroakışkan cihazların girişlerine yerleştirin. Kalan Tygon boru parçasını (ucunda PEEK borusu olmadan) Şekil 4C’de gösterildiği gibi mikroakışkan cihaz çıkışına yerleştirin. 5 mL’lik plastik bir şırıngaya en az 3 mL yağ ekleyin ve 25 G’lik bir iğneye takın. İğneyi Tygon girişlerinden birindeki PEEK borusuna dikkatlice yerleştirin. Boruyu ve cihazı yavaşça yağla yıkayın. Yağı çıkıştan konik bir tüp içinde toplayın. Diğer Tygon girişindeki yağ yıkama işlemini tekrarlayın. Şırınga pompalarını istenen akış hızlarına ayarlayın.NOT: Bu protokol, sulu akış hızı için 3 mL/s ve yağ akış hızı için 6 mL/s kullanır. İki ayrı şırınga pompası kullanılması gerekebilir. Yüzey aktif maddeyi içeren şırıngayı 25 G’lik bir iğne ile yağ girişine bağlayın ( Şekil 4A’ya bakınız) ve mikroakışkan cihazın borusunu ve yağ kanalını astarlamak için yeterli yağı yavaşça dağıtın. Cihaz ve yağ girişleri ayarlandıktan sonra, jel öncüsünü içerecek yeni bir 5 mL şırıngaya 0,5 mL yağ ekleyin. Bu az miktarda yağın amacı, öncü çözeltinin mikrofuilidik cihazdan koşunun sonuna doğru yıkanmasına yardımcı olmaktır. Konik bir tüpte, 1,5 mL PEG-omurga çözeltisini ve 1,5 mL’lik çapraz bağlayıcı çözeltisini birleştirin. 30 s için vorteks yapın ve kombine jel öncü çözeltisini 5 mL şırıngaya hızlı bir şekilde aktarın. Şırıngayı jel öncü çözeltisi ile 25 G’lik bir iğne ile sulu girişe bağlayın. Boruyu ve sulu kanalı astarlamak için yeterli çözeltiyi yavaşça dağıtın. Şırıngaları ilgili şırınga pompalarına kelepçeleyin ve çalıştırmaya basın ( Şekil 4B’ye bakınız). Hem sulu hem de yağ kanallarından sıvı aktığından emin olun.NOT: PDMS cihazında mikrojel oluşumunu görselleştirmek için mikroskop kullanılması önerilir. Kanallardan düzgün boyutta parçacıklar arayın ( Şekil 4D’ye bakınız). Mikrojelleri prizden konik bir tüp içinde toplayın. Şekil 4: Mikroakışkan kurulum . (A) PEEK borusunu (üstte) ve Tygon borusunu bir şırınga (altta) üzerindeki 25 G’lik bir iğneye bağlama yönteminin tasviri. (B) Şırınga pompaları, borular, cihaz ve mikroskop ile mikroakışkan kurulum. (C) İki giriş (sulu ve yağlı) ve bir çıkışlı mikroakışkan cihaz kurulumunun görüntüsü. (D) Mikroakışkan cihazın şeması ve bir adım emülsifikasyon cihazındaki kanallardan beklenen mikrojel oluşumunun temsili parlak alan görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 5. Mikrojellerin saflaştırılması ve sterilizasyonu Jelasyon tamamlandıktan sonra (jelasyon kinetiği karakterizasyonunda modül platosunun depolanma süresi olarak belirlenir), yağ fazını tüpün tabanından dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın ( Şekil 5’e bakınız). Bunu florlu atıklar için uygun bir atık kabına koyun.NOT: Jelleşme süresi, toplama tüpüne organik çözünür bir baz eklenerek hızlandırılabilir (örneğin, trietilamin), ancak güçlü bir bazın eklenmesinin reaksiyona girmemiş herhangi bir maleimidleri hidrolize edebileceğine dikkat etmek önemlidir. Mikrojellerin jelleşme sonrası aşırı maleimidler yoluyla işlevselleştirilmesi isteniyorsa, trietilamin ilavesini atlayın. Mikrojel toplama tüpüne 1: 1 oranında daha fazla yağ ekleyin. Toplama tüpünü hafifçe ters çevirerek karıştırın. Girdap yapmayın. Fazların ayrılmasına izin vermek için toplama tüpünün ~ 5 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Alttaki yağ fazını ve üstteki sulu fazı (mikrojeller) arayın ( Şekil 5’e bakınız). Yağı tekrarlayın en az 2 kat daha fazla yıkayın. Jel ile 1:1 oranında daha fazla yağ ekleyin ve 4:1 PBS-jel oranına 1x PBS ekleyin. Birkaç kez karıştırmak için ters çevirin. Katmanları ayırmak için, tüpü ~ 30 s için ~ 2.000 x g’de santrifüj yapın. Tüpün altındaki yağ fazını, ortadaki jeli ve üstteki PBS’yi arayın ( Şekil 5’e bakınız). Yağ fazını bir pipetle çıkarın ve bir atık kabına atın.NOT: PBS’yi çıkarmayın. Orijinal toplama tüpü 15 mL ise yıkamaya devam etmek için daha büyük bir konik tüp kullanın. Yağı tekrarlayın ve PBS 2 kat daha fazla yıkar. Jelin, Şekil 5’te gösterildiği gibi, yüzey aktif maddenin çıkarıldığını ve jelin PBS fazında olduğunu gösteren son yıkamada opaktan temizlemeye geçmesini bekleyin. Tüm yağı çıkarın. PBS’yi konik tüpten çıkarmayın. Kimyasal bir davlumbazda, PBS’ye eşit hacimde tüpe hekzan eklemek için bir cam pipet kullanın. Konik tüpü 30 s veya iyice karışana kadar vorteksleyin. 5 dakika boyunca 4.696 x g’de santrifüj. Ayırmadan sonra, üst katmanda altıgenler, ortada PBS ve altta jel arayın ( Şekil 5’e bakınız). Hekzan tabakayı çıkarın ve organik atık için bir kaba atın. PBS’yi aspire edin. Hekzan tekrarlayın ve PBS en az 2 kat daha fazla veya jel neredeyse yarı saydam görünene kadar yıkar ( Şekil 5’e bakınız). Jeli PBS 1x ile daha fazla yıkayın, böylece kalan altıgenler çıkarılır. 5 dakika boyunca 4.696 x g’de santrifüj. PBS katmanını aspire edin. Jel peleti rahatsız etmemeye dikkat edin.Mikrojellerdeki reaksiyona girmemiş herhangi bir maleimidin kapatılması veya söndürülmesi için, 1x PBS’de 100 mM’lik bir N-asetil-L-sistein çözeltisi hazırlayın ve bu çözeltiyi jele ekleyin. Gece boyunca 37 ° C’de bir tüp rotatöre yerleştirin, ardından reaksiyona girmemiş N-asetil-L-sistein’i çıkarmak için PBS ile birçok yıkama yapın. Uzun süreli depolama için (1 yıla kadar), mikrojelleri% 70 IPA’da yeniden askıya alın ve mikrojeller üzerinde bakteri üremesini önlemeye yardımcı olmak için 4 ° C’de saklayın. Mikrojelleri sterilize etmek için, bir biyogüvenlik başlığında jele 4: 1 v / v oranında% 70 IPA ekleyin. Tüpü 30 sn boyunca vorteksleyin, ardından 5 dakika boyunca 4.696 × g’de santrifüj yapın. IPA süpernatantını bir biyogüvenlik başlığındaki jel peletten aspire edin. 2 kat daha fazla IPA yıkama ve ardından steril 1x PBS ile 3 kat yıkama gerçekleştirin.NOT: Jeli hücrelerle veya hayvanlarla kullanmadan önce tüm IPA’lar çıkarılmalıdır. Şekil 5: Mikrojel saflaştırma prosedürüne genel bakış. Kısaltmalar: PBS = fosfat tamponlu salin; IPA = izopropil alkol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 6. Mikrojel boyutu karakterizasyonu NOT: Mikrojel parçacıklarının, boyutlandırmadan önce son çaplarına şişmeleri için 37 ° C’de gece boyunca 1x PBS’de dengelenmesine izin verilmesi önerilir. Görüntü jel parçacıkları.MAP jelini 5 dakika boyunca 4.696 × g’de döndürün ve süpernatanı aspire edin. Pozitif yer değiştirmeli pipet kullanarak, jel peletinden 5 μL mikrojel çıkarın ve bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL PBS içinde seyreltin (1:200 seyreltme). Bu seyreltmeyi gerektiği gibi ayarlayın.NOT: Jel öncü çözeltisinin formülasyonu sırasında, 5 μM biyotin-maleimid eklenebilir ve mikrojellerin bir florofor ile etiketlenmesine alternatif olarak kullanılabilir. Bu durumda, 1:300 seyreltmede (1 mg / mL stoktan) bir streptavidin-florofor eklenebilir. Görüntülemeden önce streptavidin ile inkübasyona en az 15 dakika izin verin. Pozitif yer değiştirmeli pipet kullanarak, seyreltilmiş mikrojellerin 100 μL’sini şeffaf bir 96 delikli plakanın kuyucuklarına aktarın. Mikrojelleri 10x hedefle görselleştirmek için geniş alan veya konfokal mikroskop kullanın. Analiz için mikrojellerin görüntülerini elde edin. Mikrojellerin temsili konfokal görüntüleri için Şekil 6’ya bakınız. ImageJ ile parçacıkları boyutlandırmaGörüntü dosyalarını mikroskoptan ImageJ’de açın. | Analiz Et’i seçin Ölçekle’yi ayarlayın ve görüntü ölçeğini mikroskop hedefine göre ayarlayın. Görüntü | Tip | 8 bit. Görüntü | | ayarlama Eşik değerini belirleyin ve ardından açılır kutudan “Otsu” otomatik eşik seçeneğini belirleyin. | Analiz Et’e tıklayın Ölçümler’i ayarlayın ve Feret’in Çapı’nı seçin ve eşikle sınırlayın. | Analiz Et’e tıklayın Parçacıkları analiz edin ve mikrojeller için beklenen alan boyutu aralığını (piksel ^ 2 cinsinden) girin (küçük kalıntıların analiz edilmesini engellemek için). Döngüselliği 0,75-1,00 olarak değiştirin ve | göster’i seçin Ana hatlar. Ekran sonuçlarını işaretleyin ve kenarlarda hariç tutun.NOT: Dairesellik şekli filtresi, görüntü kenarlığında yanlış çap ölçümü yapılmasına neden olabilecek mikrojelleri hariç tutar. Parçacıkları Analiz Et modülünü çalıştırın. Her parçacığın Feret’in çapı olan çıktıyı bekleyin ve bu sonuçları bir elektronik tabloya aktarın. Bu protokolde, mikrojel boyutundaki heterojenliği belirlemek için polidispersite indeksini (PDI) hesaplayın. Bir popülasyonu tanımlamak için en az 100 mikrojeli analiz edin: 1.00-1.05’lik bir PDI aralığı monodispers bir popülasyonu tanımlar ve 1.05’ten büyük bir PDI polidispers popülasyonu tanımlar. Aşağıda açıklandığı gibi PDI’yı hesaplamak için denklem (2), denklem (3) ve denklem (4) kullanın. (2) (3) (4) Şekil 6: Mikrojellerin temsili görüntüleri. (A) Mikrojel popülasyonu A’nın floresan konfokal görüntüsü, (B) eşikli mikrojellerin görüntüsü ve (C) ImageJ analizinden sonra parçacık ana hatları. (D) Mikrojel popülasyonu B’nin floresan konfokal görüntüsü ve (E) mikrojellerin iletilen ışık görüntüsü (mikrojeller neredeyse yarı saydamdır). (F) Bu protokolde özetlenen ImageJ analizinden elde edilen temsili sonuçların tasviri. Her iki mikrojel popülasyonu da nispeten monodispers PDI’lara sahiptir. Her iki mikrojel popülasyonu da 3 mL / s sulu akış hızı ve 6 mL / s yağ akış hızı ile sentezlendi. Bununla birlikte, mikrojel boyutundaki fark, mikroakışkan cihaz adım boyutundaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Örneğin, mikrojel popülasyonu A, kanal adım boyutu 11 μm olan mikroakışkan bir cihazla sentezlendi ve mikrojel popülasyonu B, 40 μm adım boyutuna sahip bir cihazda sentezlendi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltma: PDI = polidispersite indeksi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 7. Mikro gözenekli tavlanmış parçacık (MAP) iskele tavlama 1x PBS’de (pH 7.4) 2 mM lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP) stok çözeltisi oluşturun. LAP stok çözeltisini, jel hacmine eşdeğer 1x PBS hacminde 0,2 mM’ye kadar seyreltin. LAP fotobaşlatıcıyı hücre çalışmaları veya hayvan çalışmaları için kullanıyorsanız, kullanmadan önce çözeltiyi sterilize ettiğinizden emin olun. MAP jelini 5 dakika boyunca 4.696 × g’da döndürün ve süpernatanı aspire edin. Pozitif deplasmanlı pipet kullanarak, istenen miktarda jeli bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Jele 1:1 hacimsel oranda 0,2 mM LAP ekleyin (nihai LAP konsantrasyonu 0,1 mM’dir). Karışımı vorteks edin ve karanlıkta en az 15 dakika kuluçkaya yatırın. Jeli peletlemek için karışımı 18.000 × g’da 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı jel peletinden dikkatlice çıkarın. MAP jelini pozitif deplasmanlı pipetle hedef konuma aktarın. İskeleyi tavlamak için numuneye 113 sn boyunca odaklanmış ışık (365 nm, 8,66mW/cm2) uygulayın.NOT: 113 sn’lik tavlama süresi, daha önce yayınlandığı gibi 0,1 mM14’lük LAP konsantrasyonu için optimize edilmiştir, ancak farklı fotobaşlatıcı konsantrasyonları için ek optimizasyon gerekebilir. Resim 7: MAP iskele tavlama. (A) MAP iskele tavlama şeması. Bir fotobaşlatıcıya ve ışığa maruz kaldığında, MethMAL makromeri üzerindeki metakrilatid fonksiyonel grupları, mikrojellerin yüzeylerini birbirine bağlayan bir tıklama fotopolimerizasyon reaksiyonuna uğrar. (B) Gözeneklerde dextran (kırmızı) ile 3D kalıp şeklinde bir araya getirilmiş MAP mikrojellerinin (yeşil) iki fotonlu mikroskop görüntüsünün 3D render’ının (Imaris) tasviri. (C) Floresan 70 kDa dekstran (kırmızı) ile perfüze edilmiş bir MAP iskelesinin gözenekliliğini gösteren iki fotonlu mikroskop görüntüsünün 3D görüntüsünün (Imaris) tasviri. Ölçek çubukları = (B) 100 μm, (C) 70 μm. Kısaltmalar: MAP = mikro gözenekli tavlanmış parçacık; MethMAL = özel tavlama makromeri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.