Síntese Microfluiídica de Blocos de Construção de Microgel para andaime de partículas recíprocas microporosas

1. síntese de macromer de relagem methMAL NOTA: Este protocolo é especificamente para modificar 1 g de PEG-maleimide, mas pode ser dimensionado para fazer lotes maiores. Adicione 1 g de 4 braços 20 kDa PEG-maleimide a 10 mL de salina tamponada de fosfato de 1x (PBS, pH 7.4) em um pequeno copo de vidro com uma barra de mexida. Mexa a solução a 300 rpm até que o PEG esteja totalmente dissolvido (~30 min). Adicione 14,65 mg de 2-aminoetanotanol (0,67:1 thiol [SH] à relação molar maleimida [MAL] à reação com agitação a 300 rpm.NOTA: Os grupos de thiol em 2-aminoetanotanol serão adicionados a aproximadamente três braços do PEG-MAL via adição tipo Michael, deixando grupos finais de amina.Observe o seguinte cálculo de exemplo para a quantidade de 2-aminoetanotanol para adicionar:NOTA: Para evitar medir uma quantidade muito pequena, dissolva 100 mg de 2-aminoetanotanol em 1 mL de 1x PBS (pH 7.4) e adicione 146,5 μL dessa solução à reação. Aguarde 1h e 10 min após o passo 1.2., depois misture 160,1 mg de 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-cloreto de metilmorfódio (DMTMM, 12:1 molar razão para PEG) e 32,77 μL de ácido metacrílico (8:1 molar razão para PEG) em 5 mL de 1x PBS (pH 7.4) em um novo copo de vidro e reagem por 50 min com agitação a 300 rpm.NOTA: Nesta etapa, o ácido metacrílico reage com DMTMM para formar um éster altamente reativo que pode então ser acoplado aos grupos de amina disponíveis no PEG.Observe o seguinte cálculo de exemplo para calcular a quantidade de DMTMM a adicionar: Observe o seguinte cálculo de exemplo para calcular a quantidade de ácido metacríclico a acrescentar: Adicione a solução de ácido metacríclico/DMTMM ao béquer com a solução PEG-MAL/2-aminoetanol de 20 kDa. Adicione 53,56 μL de trietilamina (proporção molar 1:1 ao ácido metacrílico) ao béquer e deixe reagir durante a noite com agitação a 300 rpm. Cubra o béquer com papel alumínio para evitar que a poeira e outros contaminantes entrem no béquer.Observe o seguinte cálculo de exemplo para a quantidade de trietilamina a adicionar: Transfira a reação para tubos de diálise de pele de cobra (corte de peso molecular: 3.500 Da). Coloque a tubulação de diálise em um grande béquer com 1 M NaCl em água deionizada (DI) (volume deve cobrir a tubulação inteiramente) por 3 dias com agitação a 300 rpm. Altere a solução 1 M NaCl 2x diária para um total de seis lavagens. Dialisar por 6 h em água DI. Troque a água DI a cada hora para um total de seis lavagens. Transfira a reação para um tubo cônico de 50 mL e congele a −80 °C. Lyophilize o tubo por pelo menos 72 h a uma temperatura inicial de −70 °C e uma rampa de temperatura de 0,01 °C/min até 0 °C. Prepare a amostra para 1H-NMR dissolvendo 25 mg de MethMAL em 700 μL de clorofórmio-d e transfira para um tubo NMR. Adquira o espectro 1H-NMR.NOTA: Os espectros deste protocolo foram adquiridos utilizando um espectrômetro de 500 MHz com os seguintes parâmetros: largura de varredura = 6.467,3 Hz, tempo de atraso = 13,1 s, tempo de aquisição = 5,1 s, tempo de pulso = 5,1 μs e número de varreduras = 8. Para análise, integre o pico de maleimida como referência (~6,76 ppm) e, em seguida, integre os dois picos de metanfetamina (~5,35 ppm e 5,6 ppm). Divida a proporção das áreas de pico de metanfetamina pela área total dos três picos para obter a porcentagem de braços modificados com metanfetamina.NOTA: Uma modificação aceitável é a substituição do grupo funcional de 67%-75% de methacrilamida. Um exemplo deespectro H-NMR para MethMAL é mostrado na Figura 1.Use a equação (1) como o grau da equação de substituição:(1) Figura 1: Estrutura química e espectro 1H-NMR de MethMAL. (A) Estrutura química: o macromer de realagem MethMAL é composto de policol de 4 braços de 20 kDa (etileno glicol) modificado com três braços de metacrilamida. (B) Esta estrutura gera picos de 5,36 ppm (3) e 5,76 ppm (2) não presentes no espectro PEG-MAL, e um braço maleimide, que gera um pico de 6,71 ppm (1). O solvente, clorofórmio, gerou um pico de 7,26 ppm, e a água residual nesta amostra gerou um pico de 2,2 ppm (rotulado em espectro). Nos espectros methMAL, o pico de maleimídeos teve uma área integrada de 0,27, e a soma das áreas de picos de metanfetamina foi de 0,73 (0,37 + 0,36). A modificação percentual de metanfetamina foi de 73% (0,73/(0,27 + 0,73)). Este número é de Pfaff et al.14. Copyright (2021) American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 2. Cinética de gelação precursora de microgel NOTA: O tempo de gelação pode ser modificado ajustando o pH do buffer usado para dissolver os componentes precursores do gel. Para os hidgel-maleimídeos PEG-maleimida, um pH mais ácido normalmente corresponde ao tempo de gelação mais lento, uma vez que a concentração de tiaolato é diminuída em pH15 mais baixo. Predetermine as concentrações desejadas de polímeros, crosslinker e outros componentes precursores de gel (ou seja, peptídeos, glicóglicanos). Dissolva o PEG-MAL, RGD e MethMAL (PEG-backbone) em PBS 10x (pH 1.5) e o crosslinker MMP-2 em 1x PBS (pH 7.4).NOTA: Neste protocolo, a solução precursora do gel é uma formulaçãopublicada 3, que consiste em 45,88 mg/mL peg-MAL de 4 braços (10 kDa), 0,82 mg/mL RGD, 8,06 mg/mL MethMAL e 4,62 mg/mL MMP-2 crosslinker (enzimaticamente degradável crosslinker). Prepare um viscometro, ou um instrumento equivalente, para monitorar o armazenamento e perda moduli usando um tamanho de lacuna de 0,4 mm, uma cepa de cisalhamento de 1,0, uma frequência de 1,0 Hz e uma duração de 10.800 s.Fixar uma geometria de rotor de placa de 35 mm (P35/Ti). Use uma câmara umidificada ou uma esponja úmida ao redor da geometria para manter um ambiente umidificado. Misture a espinha dorsal PEG e o MMP-crosslinker em uma proporção volumosa de 1:1. Pipeta 400 μL da solução precursora de gel no centro do estágio viscométrico. Abaixe lentamente a geometria para o palco até atingir o tamanho de lacuna predeterminada de 0,4 mm e comece imediatamente a monitorar o armazenamento (G’) e a perda (G”) moduli por até 6 horas à temperatura ambiente.NOTA: A gelação é considerada para começar quando o módulo de armazenamento se torna maior do que o módulo de perda, e a gelação é considerada completa quando o módulo de armazenamento platô. Uma curva de cinética de gelação representativa é mostrada na Figura 2. Figura 2: Curva representativa da cinética de gelação de uma solução precursora de gel MAP (pH 4.5) determinada por um viscometro. A gelação começa com o rápido aumento do módulo de armazenamento (G’) e a gelação se completa quando o planalto da curva G. G” indica o módulo de perda. Este número é de Pruett et al.3. Copyright (2021) Wiley-VCH GmBH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 3. Fabricação de dispositivos microfluidos NOTA: Este protocolo descreve a fabricação do dispositivo de um design microfluidic step-emulsification dispositivo adaptado de de Rutte et al.13, que pode ser visto na Figura 3A. No entanto, este protocolo pode ser usado com qualquer design de dispositivo que seja gravado em um wafer SU-8. Recomenda-se terceirizar a fabricação mestre do wafer de silício SU-8, a menos que as instalações de limpeza apropriadas estejam disponíveis para fabricação. Crie o primeiro dispositivo microfluido de polidimtilsiloxano (PDMS) a partir de um fotomask de wafer SU-8.Prepare ~200 g de PDMS misturando a base e o agente de cura em uma proporção de 10:1 w/w (ver a Tabela de Materiais). Coloque o wafer SU-8 em um prato de cultura (fita as bordas do wafer para o prato), com o design microfluido voltado para cima. Despeje PDMS no prato para criar uma camada de 1-1,5 cm de espessura sobre o wafer. Coloque o prato sob vácuo para remover quaisquer bolhas. Deixe o PDMS curar até solidificar (24 h em temperatura ambiente ou ~2 h a 60 °C). Uma vez que o PDMS tenha curado, use cuidadosamente uma lâmina de barbear ou um bisturi para cortar um retângulo através do PDMS, de tal forma que haja uma margem de 0,5-1 cm em torno do design no wafer.NOTA: Não use muita pressão e seja muito gentil para evitar danificar (por exemplo, quebrar, arranhar) o wafer. Coloque uma espátula em um dos cortes e deslize-a ao longo dos cortes para separar o PDMS do wafer.NOTA: À medida que o PDMS se separa do wafer, uma bolha de ar começará a se formar sob o PDMS (consulte a Figura 3B). Use a espátula para tirar suavemente o retângulo de PDMS do prato.NOTA: A lacuna resultante no PDMS acima do wafer será o molde para os dispositivos microfluidos. Crie dispositivos microfluidos PDMS subsequentes a partir da fotomasmak de wafer SU-8.Prepare ~15-20 g de PDMS por molde misturando a base e o agente de cura em uma proporção de 10:1. Despeje pdms na abertura retangular no molde para criar uma camada de PDMS de 5 mm acima do wafer. Coloque o molde sob vácuo para remover quaisquer bolhas. Deixe o PDMS curar até solidificar totalmente (24 h em temperatura ambiente ou 2h a 60 °C). Uma vez que o PDMS tenha curado, use uma lâmina de barbear ou um bisturi para cortar o PDMS ao redor das bordas do retângulo.NOTA: Não use muita pressão e seja muito gentil para evitar danificar (ou seja, rachar) o wafer. Coloque uma espátula em um dos cortes e deslize-a ao longo dos cortes para separar o PDMS do wafer.NOTA: À medida que o PDMS se separa do wafer, uma bolha de ar começará a se formar sob o PDMS. Use um perfurado de biópsia de 1,5 mm para criar furos através do retângulo PDMS nas duas entradas e saída (consulte a Figura 3B). Se houver vários dispositivos em um único wafer, use uma espátula ou lâmina de barbear para marcar levemente o PDMS entre cada dispositivo e dobre suavemente o PDMS ao longo das linhas pontuadas para que o PDMS se separe muito limpo por conta própria. Armazene os dispositivos PDMS em um recipiente sem poeira. Conecte os dispositivos microfluidos PDMS a lâminas de vidro.Prepare um slide de vidro por dispositivo microfluido PDMS. Use fita, ar filtrado ou lavações de álcool isopropílico (IPA) para remover qualquer poeira do slide. Certifique-se de que os slides estão completamente secos antes de passar para o próximo passo. Coloque um slide de vidro e um dispositivo PDMS, lado a design para cima, ao lado um do outro em uma pequena bandeja de plástico (uma tampa de placa de 96 poços funciona bem para isso) e coloque-o em um limpador de plasma. Feche a porta e a válvula de fluxo de ar e ligue a bomba de vácuo. Deixe-o correr por pelo menos 30 s, em seguida, desligá-lo. Conecte o tubo de gás do tanque de oxigênio à válvula de fluxo de ar. Deixe a câmara de plasma encher com oxigênio por 30 s, depois desligue o oxigênio e feche a válvula de fluxo de ar. Ligue a bomba de vácuo e coloque o nível de radiofrequência (RF) alto. Espere até que a câmara vire uma cor violeta-rosa (consulte a Figura 3B). Deixe passar 30 s. Quando o temporizador se apagar, desligue o plasma e o vácuo. Em seguida, abra lentamente a válvula de fluxo de ar para liberar o vácuo. Remova a bandeja do limpador de plasma. Vire suavemente o dispositivo PDMS sobre a lâmina de vidro para relacioná-los. À medida que a ligação acontece, observe a pequena diferença na transparência do PDMS.NOTA: Para obter os melhores resultados, armazene os dispositivos ligados a 60 °C até imediatamente antes de usar. Tratamento superficial dos dispositivos microfluidos PDMSPrepare o tratamento superficial diluindo PFOCTS (tricloro (1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silane) em óleo Novec (1:50). Use 1 mL para dispositivos 3-4. Transfira o volume para uma seringa de 1 mL e conecte uma agulha de 25 G.NOTA: As agulhas utilizadas neste protocolo são chanfradas, por isso tome cuidado ao manusear os sharps. Agulhas cegas também podem ser usadas se desejarem. Corte um pedaço de tubo Tygon de 10-12 cm por dispositivo que será tratado. Corte um pedaço de tubo PEEK, ~7 cm de comprimento. Insira um par de milímetros da tubulação PEEK na extremidade da tubulação de Tygon, como mostrado na Figura 4A, para ajudar a evitar que a agulha puncte as entradas de tubos de Tygon. Tire o(s) dispositivo da câmara aquecida e insira a extremidade não PEEK da tubulação Tygon no orifício aquoso da entrada. Insira a agulha da seringa de tratamento de superfície na tubulação PEEK e cubra o orifício de saída da câmara de óleo (consulte a Figura 3B). Injete o tratamento no dispositivo lentamente e certifique-se de que ele encha o dispositivo, sem bolhas. Aguarde as câmaras aquosas para encher primeiro, seguido pelos canais menores, e depois pela câmara de óleo. Remova a tubulação Tygon do dispositivo. Uma vez que o dispositivo tenha sido preenchido, deixe descansar por 10 minutos em temperatura ambiente. Encha uma seringa de 5 mL apenas com óleo (sem silano) e conecte uma agulha de 25 G. Aspire o tratamento superficial para fora do dispositivo através das entradas e saída. Insira a tubulação Tygon na entrada aquosa, insira a seringa com óleo na tubulação PEEK e lave cada dispositivo com óleo. Aspire o óleo do dispositivo. Repita a descarga de óleo 2x a mais. Remova a tubulação Tygon.NOTA: O dispositivo está pronto para ser usado. Figura 3: Dispositivo PDMS microfluido. (A) Desenho assistido por computador (AutoCAD) do design do dispositivo microfluido. A formação de gotículas de microgel ocorre nos canais de ambos os lados do canal de óleo, como visto no afloramento ampliado. (B) Visão geral da fabricação do dispositivo PDMS. Abreviação: PDMS = polidimtilsiloxano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 4. Geração microfluídica de microgésis Predetermine as concentrações desejadas de polímeros, crosslinker e outros componentes precursores de gel (ou seja, peptídeos, glicóglicanos). Dissolva o PEG-MAL, RGD e MethMAL (PEG-backbone) em PBS 10x (pH 1.5) e o crosslinker MMP-2 juntamente com 5 μM de biotin-maleimida em 1x PBS (pH 7.4).NOTA: Neste protocolo, a solução precursora de gel é uma formulação publicada3 composta por 45,88 mg/mL PEG-MAL de 4 braços (10 kDa), 0,82 mg/mL RGD, 8,06 mg/mL MethMAL e 4,62 mg/mL MMP-2 crosslinker (crosslinker enzimaticamente degradante). Os métodos descritos abaixo produzirão ~3 mL de microgésis. Prepare 6 mL de solução surfactante diluindo o estoque de 5% FluoroSurfactante para pelo menos 1% no óleo novec. Adicione esta solução a uma seringa de 10 mL.NOTA: O surfactante fluorado é imiscível com água, o que permite que ele seja facilmente removido durante a transição do gel para a fase aquosa durante as lavagens pbs na etapa de purificação. Corte três pedaços de tubos Tygon que são um comprimento apropriado para a altura da bomba de seringa. Corte dois pedaços de tubo PEEK, ~1 polegada de comprimento. Insira um par de milímetros da tubulação PEEK na extremidade de dois pedaços de tubos de Tygon, como mostrado na Figura 4A, para ajudar a evitar que a agulha punca as entradas de tubos de Tygon. Insira a extremidade não-PEEK da tubulação Tygon nas entradas dos dispositivos microfluidos. Insira a peça restante da tubulação Tygon (sem tubo PEEK na extremidade) na saída do dispositivo microfluido, como mostrado na Figura 4C. Adicione pelo menos 3 mL de óleo a uma seringa de plástico de 5 mL e fixe-a a uma agulha de 25 G. Insira cuidadosamente a agulha na tubulação PEEK em uma das entradas tygon. Lave suavemente a tubulação e o dispositivo com óleo. Recolhe o óleo da tomada em um tubo cônico. Repita a descarga de óleo na outra entrada Tygon. Coloque as bombas de seringa nas taxas de fluxo desejadas.NOTA: Este protocolo utiliza 3 mL/h para a vazão aquosa e 6 mL/h para a vazão do óleo. Pode ser necessário usar duas bombas de seringa separadas. Conecte a seringa contendo o surfactante à entrada de óleo através de uma agulha de 25 G (consulte a Figura 4A) e distribua suavemente óleo suficiente para preparar a tubulação e o canal de óleo do dispositivo microfluido. Uma vez configuradas as entradas do dispositivo e do óleo, adicione 0,5 mL de óleo a uma nova seringa de 5 mL, que conterá o precursor do gel. O objetivo desta pequena quantidade de óleo é ajudar a lavar a solução precursora através do dispositivo microfísico no final da corrida. Em um tubo cônico, combine 1,5 mL da solução peg-backbone e 1,5 mL da solução crosslinker. Vórtice para 30 s e transfira rapidamente a solução precursora de gel combinado para a seringa de 5 mL. Conecte a seringa com a solução precursora do gel à entrada aquosa através de uma agulha de 25 G. Dispense suavemente solução suficiente para preparar a tubulação e o canal aquoso. Fixar as seringas nas respectivas bombas de seringa e pressionar a execução (consulte a Figura 4B). Certifique-se de que há líquido fluindo pelos canais aquosos e de óleo.NOTA: Recomenda-se usar um microscópio para visualizar a formação de microgel dentro do dispositivo PDMS. Procure partículas de tamanho uniforme dos canais (consulte a Figura 4D). Colete os microgéis da tomada em um tubo cônico. Figura 4: Configuração microfluida. (A) Representação do método de conexão de tubos PEEK (superior) e tubos Tygon a uma agulha de 25 G em uma seringa (inferior). (B) Configuração microfluidica com bombas de seringa, tubulação, dispositivo e microscópio. (C) Imagem de configuração do dispositivo microfluido, com duas entradas (aquosas e óleo) e uma tomada. (D) Esquema do dispositivo microfluido e imagem de campo brilhante representativa da formação esperada de microgel dos canais em um dispositivo de emulsificação de etapas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 5. Purificação e esterilização de microgésis Uma vez que a gelação esteja completa (determinada como tempo para armazenar o módulo platô na caracterização da cinética de gírtica de gelação), use uma pipeta para remover cuidadosamente a fase de óleo da parte inferior do tubo (consulte a Figura 5). Deposite isso em um recipiente de resíduos apropriado para resíduos fluorados.NOTA: O tempo de gelação pode ser acelerado adicionando uma base solúvel orgânica ao tubo de coleta (por exemplo, trietilamina), mas é importante notar que a adição de uma base forte pode hidrolisar quaisquer malemídeos não redigidos. Se desejar funcionalizar microgels através do excesso de maleimídeos pós-gelação, pule a adição de trietilamina. Adicione mais óleo no tubo de coleta de microgel em uma proporção de 1:1. Misture invertendo suavemente o tubo de coleta. Não vórtice. Deixe o tubo de coleta se contentar com ~5 min para permitir que as fases se separem. Procure a fase do óleo na parte inferior e a fase aquosa (os microgels) na parte superior (consulte a Figura 5). Repita as lavagens de óleo pelo menos 2x a mais. Adicione mais óleo em uma relação 1:1 com o gel e adicione 1x PBS em uma relação PBS 4:1 para gel. Inverta para misturar várias vezes. Para separar as camadas, centrifugar o tubo a ~2.000 x g por ~30 s. Procure a fase de óleo na parte inferior do tubo, gel no meio e PBS na parte superior (consulte a Figura 5). Remova a fase do óleo com uma pipeta e descarte em um recipiente de resíduos.NOTA: Não remova o PBS. Use um tubo cônico maior para continuar as lavagens se o tubo de coleta original fosse de 15 mL. Repita o óleo e o PBS lave 2x a mais. Procure o gel para transição de opaco para claro pela lavagem final, como mostrado na Figura 5, indicando que o surfactante foi removido e o gel está na fase PBS. Remova todo o óleo. Não remova o PBS do tubo cônico. Em uma capa de fumaça química, use uma pipeta de vidro para adicionar hexanos ao tubo em um volume igual ao PBS. Vórtice o tubo cônico para 30 s ou até misturar completamente. Centrifugar a 4.696 x g por 5 min. Após a separação, procure hexanes na camada superior, PBS no meio e gel na parte inferior (consulte a Figura 5). Remova a camada de hexano e descarte-a em um recipiente para resíduos orgânicos. Aspire a PBS. Repetir hexano e PBS lava pelo menos 2x a mais ou até que o gel pareça quase translúcido (consulte a Figura 5). Lave o gel com PBS 1x mais para que todos os hexanos restantes sejam removidos. Centrifugar a 4.696 x g por 5 min. Aspire a camada PBS. Tome cuidado para não perturbar a pelota de gel.Para tampar, ou saciar, qualquer maleimídeo não redigido nos microgelos, preparar uma solução de 100 mM de N-acetil-L-cisteína em 1x PBS e adicionar esta solução ao gel. Coloque em um rotador de tubo a 37 °C durante a noite, seguido por muitas lavagens com PBS para remover n-acetil-L-cisteína não redigida. Para armazenamento de longo prazo (até 1 ano), resuspenque os microgels em 70% IPA e armazene a 4 °C para ajudar a prevenir o crescimento de bactérias nos microgels. Para esterilizar os microgésis, adicione 70% de IPA ao gel em uma proporção de 4:1 v/v em uma capa de biossegurança. Vórtice do tubo para 30 s, em seguida, centrífuga a 4.696 × g por 5 min. Aspire o supernatante IPA da pelota de gel em um capuz de biossegurança. Realize 2x mais lavagens de IPA seguidas de lavagens 3x com PBS 1x estéril.NOTA: Todo o IPA deve ser removido antes de usar o gel com células ou animais. Figura 5: Visão geral do procedimento de purificação do microgel. Abreviaturas: PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato; IPA = álcool isopropílico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 6. Caracterização do tamanho do microgel NOTA: Recomenda-se permitir que partículas de microgel se equilibrem em 1x PBS durante a noite a 37 °C para inchar até o diâmetro final antes do dimensionamento. Partículas de gel de imagem.Gire o gel MAP a 4.696 × g por 5 min e aspire o supernaste. Utilizando uma pipeta de deslocamento positiva, remova 5 μL de microgel da pelota de gel e dilua em 1 mL de PBS em um tubo de microcentrifuge (diluição de 1:200). Ajuste esta diluição conforme necessário.NOTA: Durante a formulação da solução precursora do gel, 5 μM de biotin-maleimida podem ser adicionados e usados como alternativa à rotulagem de microgéis com fluorophore. Neste caso, um streptavidin-fluorforhore pode ser adicionado a uma diluição de 1:300 (a partir de 1 mg/mL de estoque). Permita a incubação com streptavidin por pelo menos 15 minutos antes da imagem. Usando uma pipeta de deslocamento positiva, transfira 100 μL dos microgéis diluídos para os poços de uma placa clara de 96 poços. Use um microscópio widefield ou confocal para visualizar os microgésis com um objetivo de 10x. Adquira imagens dos microgéis para análise. Consulte a Figura 6 para obter imagens confocal representativas de microgésis. Dimensionamento de partículas com ImageJAbra os arquivos de imagem do microscópio no ImageJ. Selecione Analisar | Defina escala e defina a escala de imagem de acordo com o objetivo do microscópio. Selecione | de imagem Tipo | 8 bits. Selecione | de imagem Ajuste | Limite e selecione a opção “Otsu” de limiar automático da caixa suspensa. Clique em Analisar | Defina medidas e selecione o diâmetro de Feret e limite para limiar. Clique em Analisar | Analise partículas e entre na faixa de tamanho da área (em pixel^2) esperada para os microgel (para excluir pequenos detritos de serem analisados). Alterar a circularidade para 0.75-1.00 e selecione Mostrar | Contornos. Verifique os resultados do visor e exclua em bordas.NOTA: O filtro de forma de circularidade exclui microgéis na borda da imagem que podem produzir uma medição de diâmetro imprecisa. Execute o módulo Analisar partículas . Aguarde a saída, que é o diâmetro do Feret de cada partícula, e exporte esses resultados para uma planilha. Neste protocolo, calcule o índice de polidispersidade (IDP) para determinar a heterogeneidade no tamanho do microgel. Analisar pelo menos 100 microgéis para definir uma população: uma faixa de PDI de 1,00-1,05 define uma população monodisperse, e um PDI maior que 1,05 define uma população polidisperse. Use equação (2), equação (3) e equação (4) para calcular o PDI, conforme descrito abaixo. (2) (3) (4) Figura 6: Imagens representativas de microgels. (A) Imagem confocal fluorescente da população de microgel A, (B) imagem de microgésis limiares e (C) contornos de partículas após análise do ImageJ. (D) Imagem confocal fluorescente da população de microgel B e (E) imagem de luz transmitida de microgels (microgels são quase translúcidas). (F) Representação dos resultados representativos da análise ImageJ descrita neste protocolo. Ambas as populações de microgel têm PDIs relativamente monodisperse. Ambas as populações de microgésis foram sintetizadas com uma vazão aquosa de 3 mL/h e uma vazão de óleo de 6 mL/h. No entanto, a diferença no tamanho do microgel deve-se a diferenças no tamanho do passo do dispositivo microfluido. Por exemplo, a população de microgel A foi sintetizada com um dispositivo microfluido com um tamanho de etapa de canal de 11 μm, e a população de microgel B foi sintetizada em um dispositivo com um tamanho de passo de 40 μm. Barras de escala = 100 μm. Abreviação: PDI = índice de polidispersidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 7. Partícula desobedimento microporoso (MAP) de ressarcer andaime Crie uma solução de estoque de fenil de lítio de 2 mM-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) em 1x PBS (pH 7.4). Diluir a solução de estoque LAP para 0,2 mM em um volume de 1x PBS equivalente ao volume do gel. Se usar o fotoinitiador LAP para estudos de células ou estudos em animais, certifique-se de esterilizar a solução antes do uso. Gire o gel MAP a 4.696 × g por 5 min e aspire o supernaste. Usando uma pipeta de deslocamento positiva, transfira o volume desejado de gel para um tubo de microcentrifuuagem. Adicione 0,2 mM LAP ao gel em uma relação volumosa de 1:1 (a concentração final de LAP é de 0,1 mM). Vórtice a mistura e incubar por pelo menos 15 minutos no escuro. Centrifugar a mistura a 18.000 × g por 5 min para pelotar o gel. Remova cuidadosamente o sobrenante da pelota de gel. Transfira o gel MAP para o local alvo com uma pipeta de deslocamento positiva. Aplique luz focada (365 nm, 8,66mW/cm2) na amostra por 113 s para ressar o andaime.NOTA: O tempo de ressarcialização de 113 s foi otimizado como publicado anteriormente para concentração de LAP de 0,1 mM14, mas pode ser necessária otimização adicional para diferentes concentrações fotoiniciais. Figura 7: Ressarcimento de andaimes MAP. (A) Esquema de remato de andaime MAP. Quando expostos a um fotoiniciador e à luz, os grupos funcionais de metanfetamina no macromer MethMAL sofrem uma reação de fotopolimerização de cliques, que une as superfícies dos microgel. (B) Representação de uma renderização 3D (Imaris) de uma imagem de microscópio de dois fótons de microgésis MAP (verde) enroscotados em forma de disco 3D, com dextran (vermelho) nos poros. (C) Representação de uma renderização 3D (Imaris) de uma imagem de microscópio de dois fótons mostrando a porosidade de um andaime MAP que foi perfundido com dextran fluorescente de 70 kDa (vermelho). Barras de escala = (B) 100 μm, (C) 70 μm. Abreviaturas: MAP = partícula de bálsamo de ivado micropondos; MethMAL = macromer de ressarcimento personalizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.