Mikrofluidische Synthese von Mikrogelbausteinen für mikroporös geglühte Partikelgerüste

1. MethMAL-Makromersynthese HINWEIS: Dieses Protokoll ist speziell für die Modifizierung von 1 g PEG-Maleimid, kann aber skaliert werden, um größere Chargen herzustellen. 1 g 4-armiges 20 kDa PEG-Maleimid zu 10 mL 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) in ein kleines Glasbecherglas mit Rührstab geben. Rühren Sie die Lösung bei 300 U/min, bis sich das PEG vollständig aufgelöst hat (~30 min). 14,65 mg 2-Aminoethanthiol (0,67:1 Thiol [SH] zu Maleimid [MAL] Molverhältnis) unter Rühren bei 300 U/min in die Reaktion geben.HINWEIS: Die Thiolgruppen auf 2-Aminoethanthiol werden über Michael-Typ-Addition zu etwa drei Armen des PEG-MAL hinzugefügt, wobei Aminendgruppen übrig bleiben.Beachten Sie die folgende Beispielrechnung für die Menge an 2-Aminoethanthiol, die hinzugefügt werden soll:HINWEIS: Um zu vermeiden, dass eine sehr kleine Menge gemessen wird, lösen Sie 100 mg 2-Aminoethanthiol in 1 ml 1x PBS (pH 7,4) und fügen Sie 146,5 μL dieser Lösung zur Reaktion hinzu. Nach Schritt 1.2 1 h und 10 min abwarten, dann 160,1 mg 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholiniumchlorid (DMTMM, 12:1 molares Verhältnis zu PEG) und 32,77 μL Methacrylsäure (8:1 molares Verhältnis zu PEG) in 5 mL 1x PBS (pH 7,4) in einem neuen Glasbecherglas mischen und 50 min unter Rühren bei 300 U/min reagieren.HINWEIS: In diesem Schritt reagiert die Methacrylsäure mit DMTMM zu einem hochreaktiven Ester, der dann an die verfügbaren Amingruppen auf dem PEG gekoppelt werden kann.Beachten Sie die folgende Beispielberechnung zur Berechnung der hinzuzufügenden DMTMM-Menge: Beachten Sie die folgende Beispielrechnung zur Berechnung der hinzuzufügenden Methacrylsäuremenge: Die Methacrylsäure/DMTMM-Lösung mit der 20 kDa PEG-MAL/2-Aminoethanthiollösung in das Becherglas geben. 53,56 μL Triethylamin (1:1 Molverhältnis zu Methacrylsäure) in das Becherglas geben und über Nacht unter Rühren bei 300 U/min reagieren lassen. Decken Sie das Becherglas mit Folie ab, um zu verhindern, dass Staub und andere Verunreinigungen in das Becherglas gelangen.Beachten Sie die folgende Beispielberechnung für die hinzuzufügende Triethylaminmenge: Übertragen Sie die Reaktion auf Schlangenhaut-Dialyseschläuche (Molekulargewichtsgrenze: 3.500 Da). Legen Sie den Dialyseschlauch 3 Tage lang unter Rühren bei 300 U/min in ein großes Becherglas mit 1 M NaCl in entionisiertem (DI) Wasser (Volumen sollte den Schlauch vollständig bedecken). Wechseln Sie die 1 M NaCl-Lösung 2x täglich für insgesamt sechs Wäschen. Dialysieren Sie für 6 h in DI-Wasser. Wechseln Sie das DI-Wasser stündlich für insgesamt sechs Wäschen. Die Reaktion wird in ein 50-ml-konisches Röhrchen übertragen und bei −80 °C eingefroren. Lyophilisieren Sie das Rohr für mindestens 72 h bei einer Starttemperatur von −70 °C und einer Temperaturrampe von 0,01 °C/min bis 0 °C. Die Probe wird für 1H-NMR vorbereitet, indem 25 mg MethMAL in 700 μl Chloroform-d gelöst und in ein NMR-Röhrchen überführt werden. Erfassen Sie die 1H-NMR-Spektren.HINWEIS: Die Spektren in diesem Protokoll wurden mit einem 500-MHz-Spektrometer mit den folgenden Parametern erfasst: Sweep-Breite = 6.467,3 Hz, Zeitverzögerung = 13,1 s, Erfassungszeit = 5,1 s, Pulszeit = 5,1 μs und Anzahl der Scans = 8. Für die Analyse integrieren Sie den Maleimid-Peak als Referenz (~6,76 ppm) und dann die beiden Methacrylamid-Peaks (~5,35 ppm und 5,6 ppm). Teilen Sie das Verhältnis der Methacrylamid-Peakflächen durch die Gesamtfläche aller drei Peaks, um den Prozentsatz der mit Methacrylamid modifizierten Arme zu erhalten.HINWEIS: Eine akzeptable Modifikation ist die Substitution von 67% -75% funktioneller Methacrylamidgruppe. Ein Beispiel für das H-NMR-Spektrum 1 fürMethMAL ist in Abbildung 1 dargestellt.Verwenden Sie Gleichung (1) als Grad der Substitutionsgleichung:(1) Abbildung 1: Chemische Struktur und 1H-NMR-Spektrum von MethMAL. (A) Chemische Struktur: Das MethMAL-Glühmakromer besteht aus 20 kDa 4-armigem Polyethylenglykol, das mit drei Methacrylamidarmen modifiziert ist. (B) Diese Struktur erzeugt Peaks bei 5,36 ppm (3) und 5,76 ppm (2), die in PEG-MAL-Spektren nicht vorhanden sind, und einen Maleimidarm, der einen Peak bei 6,71 ppm erzeugt (1). Das Lösungsmittel Chloroform erzeugte einen Peak bei 7,26 ppm, und Restwasser in dieser Probe erzeugte einen Peak bei 2,2 ppm (markiert auf Spektren). In den MethMAL-Spektren hatte der Maleimid-Peak eine integrierte Fläche von 0,27 und die Summe der Methacrylamid-Peakflächen betrug 0,73 (0,37 + 0,36). Die prozentuale Modifikation von Methacrylamid betrug 73% (0,73/(0,27 + 0,73)). Diese Zahl stammt von Pfaff et al.14. Copyright (2021) American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 2. Mikrogel-Vorläufer-Gelierungskinetik HINWEIS: Die Gelierungszeit kann durch Einstellen des pH-Wertes des Puffers geändert werden, der zum Auflösen der Gelvorläuferkomponenten verwendet wird. Bei PEG-Maleimid-Hydrogelen entspricht ein saurerer pH-Wert typischerweise einer langsameren Gelierzeit, da die Thiolatkonzentration bei niedrigerempH-Wert 15 erniedrigt ist. Bestimmen Sie die gewünschten Konzentrationen von Polymer-, Vernetzer- und anderen Gelvorläuferkomponenten (d. H. Peptide, Glykosaminoglykane). PEG-MAL, RGD und MethMAL (PEG-Backbone) werden in 10x PBS (pH 1,5) und der MMP-2-Vernetzer in 1x PBS (pH 7,4) gelöst.HINWEIS: In diesem Protokoll ist die Gelvorläuferlösung eine veröffentlichte Formulierung3, die aus 45,88 mg/ml 4-armigem PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg/ml RGD, 8,06 mg/ml MethMAL und 4,62 mg/ml MMP-2-Vernetzer (enzymatisch abbaubarer Vernetzer) besteht. Bereiten Sie ein Viskosimeter oder ein gleichwertiges Gerät zur Überwachung von Speicher- und Verlustmodulen mit einer Spaltgröße von 0,4 mm, einer Schubdehnung von 1,0, einer Frequenz von 1,0 Hz und einer Dauer von 10.800 s vor.Befestigen Sie eine 35-mm-Plattenrotorgeometrie (P35/Ti). Verwenden Sie eine befeuchtete Kammer oder einen feuchten Schwamm um die Geometrie, um eine befeuchtete Umgebung zu erhalten. Mischen Sie den PEG-Backbone und den MMP-Vernetzer im Volumenverhältnis 1:1. 400 μL der Gelvorläuferlösung werden auf die Mitte des Viskosimetertisches pipettiert. Senken Sie die Geometrie langsam auf den Tisch, bis sie die vorgegebene Spaltgröße von 0,4 mm erreicht hat, und beginnen Sie sofort mit der Überwachung der Speicher- (G’) und Verlustmodule (G”) für bis zu 6 h bei Raumtemperatur.HINWEIS: Es wird davon ausgegangen, dass die Gelierung beginnt, wenn der Speichermodul größer als der Verlustmodul wird, und die Gelierung gilt als abgeschlossen, wenn der Speichermodul ein Plateau erreicht. Eine repräsentative Gelierungskinetikkurve ist in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 2: Repräsentative Kurve der Gelierungskinetik einer MAP-Gelvorläuferlösung (pH 4,5), bestimmt mit einem Viskosimeter. Die Gelierung beginnt mit dem schnellen Anstieg des Speichermoduls (G’), und die Gelierung ist abgeschlossen, wenn die G’-Kurve Plateaus erreicht. G” gibt den Verlustmodul an. Diese Zahl stammt von Pruett et al.3. Copyright (2021) Wiley-VCH GmBH. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 3. Herstellung mikrofluidischer Bauelemente ANMERKUNG: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines mikrofluidischen Stufenemulgierungsgerätedesigns nach de Rutte et al.13, das in Abbildung 3A zu sehen ist. Dieses Protokoll kann jedoch mit jedem Gerätedesign verwendet werden, das in einen SU-8-Wafer geätzt ist. Es wird empfohlen, die SU-8-Siliziumwafer-Masterfertigung auszulagern, es sei denn, die entsprechenden Reinraumeinrichtungen stehen für die Fertigung zur Verfügung. Erstellen Sie das erste mikrofluidische Gerät für Polydimethylsiloxan (PDMS) aus einer SU-8-Wafer-Fotomaske.Bereiten Sie ~200 g PDMS vor, indem Sie Base und Härter im Verhältnis 10:1 w/w mischen (siehe Materialtabelle). Platzieren Sie den SU-8-Wafer in einer Kulturschale (Klebeband der Ränder des Wafers an der Schale), wobei das mikrofluidische Design nach oben zeigt. Gießen Sie PDMS in die Schale, um eine 1-1,5 cm dicke Schicht über dem Wafer zu erzeugen. Stellen Sie die Schale unter Vakuum, um Blasen zu entfernen. Lassen Sie das PDMS aushärten, bis es erstarrt ist (24 h bei Raumtemperatur oder ~2 h bei 60 °C). Sobald das PDMS ausgehärtet ist, schneiden Sie vorsichtig mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell ein Rechteck durch das PDMS, so dass ein Rand von 0,5-1 cm um das Design auf dem Wafer liegt.HINWEIS: Verwenden Sie nicht zu viel Druck und seien Sie sehr vorsichtig, um eine Beschädigung (z. B. Risse, Kratzer) des Wafers zu vermeiden. Verkeilen Sie einen Spatel in einen der Schnitte und schieben Sie ihn entlang der Schnitte, um das PDMS vom Wafer zu trennen.HINWEIS: Wenn sich das PDMS vom Wafer trennt, beginnt sich unter dem PDMS eine Luftblase zu bilden (siehe Abbildung 3B). Verwenden Sie den Spatel, um das Rechteck des PDMS vorsichtig aus der Schale zu heben.HINWEIS: Die resultierende Lücke im PDMS über dem Wafer ist die Form für die mikrofluidischen Geräte. Erstellen Sie nachfolgende PDMS-Mikrofluidik-Geräte aus der SU-8 Wafer-Fotomaske.Bereiten Sie ~ 15-20 g PDMS pro Form vor, indem Sie die Basis und den Härter im Verhältnis 10: 1 mischen. Gießen Sie PDMS in den rechteckigen Spalt in der Form, um eine 5 mm dicke PDMS-Schicht über dem Wafer zu erzeugen. Stellen Sie die Form unter Vakuum, um Blasen zu entfernen. Das PDMS aushärten lassen, bis es vollständig erstarrt ist (24 h bei Raumtemperatur oder 2 h bei 60 °C). Sobald das PDMS ausgehärtet ist, schneiden Sie das PDMS mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell um die Kanten des Rechtecks.HINWEIS: Verwenden Sie nicht zu viel Druck und seien Sie sehr vorsichtig, um eine Beschädigung (d. H. Rissbildung) des Wafers zu vermeiden. Verkeilen Sie einen Spatel in einen der Schnitte und schieben Sie ihn entlang der Schnitte, um das PDMS vom Wafer zu trennen.HINWEIS: Wenn sich das PDMS vom Wafer trennt, beginnt sich unter dem PDMS eine Luftblase zu bilden. Verwenden Sie einen 1,5-mm-Biopsiestempel, um Löcher durch das PDMS-Rechteck an den beiden Einlässen und am Auslass zu erzeugen (siehe Abbildung 3B). Wenn sich mehrere Geräte auf einem einzelnen Wafer befinden, verwenden Sie einen Spatel oder eine Rasierklinge, um das PDMS leicht zwischen den einzelnen Geräten zu ritzen, und falten Sie dann das PDMS vorsichtig entlang der geritzten Linien, so dass sich das PDMS von selbst sehr sauber trennt. Lagern Sie die PDMS-Geräte in einem staubfreien Behälter. Verkleben Sie die PDMS-Mikrofluidikgeräte auf Glasobjektträgern.Bereiten Sie einen Objektträger pro mikrofluidischem PDMS-Gerät vor. Verwenden Sie Klebeband, gefilterte Luft oder Isopropylalkohol (IPA)-Waschungen, um Staub vom Objektträger zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Objektträger vollständig trocken sind, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Legen Sie einen Objektträger und ein PDMS-Gerät mit der Designseite nach oben nebeneinander auf eine kleine Kunststoffschale (ein 96-Well-Plattendeckel eignet sich gut dafür) und legen Sie sie in einen Plasmareiniger. Schließen Sie die Tür und das Luftstromventil und schalten Sie die Vakuumpumpe ein. Lassen Sie es mindestens 30 s laufen und schalten Sie es dann aus. Verbinden Sie den Sauerstofftankgasschlauch mit dem Luftstromventil. Lassen Sie die Plasmakammer 30 s lang mit Sauerstoff füllen, schalten Sie dann den Sauerstoff aus und schließen Sie das Luftstromventil. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und stellen Sie den Hochfrequenzpegel (RF) auf Hoch ein. Warten Sie, bis die Kammer violett-rosa färbt (siehe Abbildung 3B). Lassen Sie 30 s verstreichen. Wenn der Timer ausgeht, schalten Sie das Plasma aus und saugen Sie. Öffnen Sie dann langsam das Luftstromventil, um das Vakuum freizugeben. Nehmen Sie das Fach aus dem Plasmareiniger. Drehen Sie das PDMS-Gerät vorsichtig auf den Glasobjektträger, um sie zu verkleben. Beachten Sie während der Verklebung den leichten Unterschied in der Transparenz des PDMS.HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, lagern Sie die geklebten Geräte bis unmittelbar vor Gebrauch bei 60 °C. Oberflächenbehandlung der PDMS-Mikrofluidik-GeräteBereiten Sie die Oberflächenbehandlung vor, indem Sie PFOCTS (Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan) in Novec-Öl (1:50) verdünnen. Verwenden Sie 1 ml für 3-4 Geräte. Übertragen Sie das Volumen in eine 1-ml-Spritze und befestigen Sie eine 25-G-Nadel.HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Nadeln sind abgeschrägt, also seien Sie vorsichtig beim Umgang mit scharfen und spitzen Punkten. Auf Wunsch können auch stumpfe Nadeln verwendet werden. Schneiden Sie ein 10-12 cm großes Stück Tygon-Schläuch pro zu behandelndem Gerät ab. Schneiden Sie ein Stück PEEK-Schlauch, ~7 cm lang. Führen Sie einige Millimeter des PEEK-Schlauchs in das Ende des Tygon-Schlauchs ein, wie in Abbildung 4A dargestellt, um zu verhindern, dass die Nadel die Tygon-Schlaucheinlässe durchsticht. Nehmen Sie das/die Gerät(e) aus der beheizten Kammer und führen Sie das Nicht-PEEK-Ende des Tygon-Schlauchs in das wässrige Einlassloch ein. Führen Sie die Nadel der Oberflächenbehandlungsspritze in den PEEK-Schlauch ein und decken Sie die Ölkammerauslassöffnung ab (siehe Abbildung 3B). Injizieren Sie die Behandlung langsam in das Gerät und stellen Sie sicher, dass es das Gerät ohne Blasen füllt. Warten Sie, bis sich zuerst die wässrigen Kammern gefüllt haben, gefolgt von den kleineren Kanälen und dann der Ölkammer. Entfernen Sie den Tygon-Schlauch vom Gerät. Sobald das Gerät gefüllt ist, lassen Sie es 10 min bei Raumtemperatur ruhen. Füllen Sie eine 5-ml-Spritze nur mit Öl (kein Silan) und befestigen Sie eine 25-G-Nadel. Saugen Sie die Oberflächenbehandlung durch die Ein- und Auslässe aus dem Gerät ab. Führen Sie den Tygon-Schlauch in den wässrigen Einlass ein, führen Sie die Spritze mit Öl in den PEEK-Schlauch ein und spülen Sie jedes Gerät mit Öl. Saugen Sie das Öl aus dem Gerät ab. Wiederholen Sie die Ölspülung noch 2x. Entfernen Sie den Tygon-Schlauch.HINWEIS: Das Gerät ist einsatzbereit. Abbildung 3: Mikrofluidisches PDMS-Gerät . (A) AutoCAD-Zeichnung (Computergestütztes Design) des mikrofluidischen Gerätedesigns. Die Bildung von Mikrogeltröpfchen tritt in den Kanälen auf beiden Seiten des Ölkanals auf, wie im vergrößerten Aufschluss zu sehen ist. (B) Überblick über die Herstellung von PDMS-Geräten. Abkürzung: PDMS = Polydimethylsiloxan. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 4. Mikrofluidische Erzeugung von Mikrogelen Bestimmen Sie die gewünschten Konzentrationen von Polymer-, Vernetzer- und anderen Gelvorläuferkomponenten (d. H. Peptide, Glykosaminoglykane). Lösen Sie PEG-MAL, RGD und MethMAL (PEG-Backbone) in 10x PBS (pH 1,5) und den MMP-2-Vernetzer zusammen mit 5 μM Biotin-Maleimid in 1x PBS (pH 7,4).HINWEIS: In diesem Protokoll ist die Gelvorläuferlösung eine veröffentlichte Formulierung3 , bestehend aus 45,88 mg/ml 4-armigem PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg/ml RGD, 8,06 mg/ml MethMAL und 4,62 mg/ml MMP-2-Vernetzer (enzymatisch abbaubarer Vernetzer). Die unten beschriebenen Methoden ergeben ~ 3 ml Mikrogele. Bereiten Sie 6 ml Tensidlösung vor, indem Sie die Brühe 5% Fluortensid auf mindestens 1% in Novec-Öl verdünnen. Fügen Sie diese Lösung zu einer 10-ml-Spritze hinzu.HINWEIS: Fluoriertes Tensid ist nicht mit Wasser mischbar, wodurch es während des Gelübergangs in die wässrige Phase während der PBS-Waschungen im Reinigungsschritt leicht entfernt werden kann. Schneiden Sie drei Stück Tygon-Schläuche ab, die eine für die Höhe der Spritzenpumpe geeignete Länge haben. Schneiden Sie zwei Stück PEEK-Schlauch, ~ 1 Zoll lang. Führen Sie einige Millimeter des PEEK-Schlauchs in das Ende von zwei Tygon-Schläuchen ein, wie in Abbildung 4A dargestellt, um zu verhindern, dass die Nadel die Tygon-Schlaucheinlässe durchsticht. Führen Sie das Nicht-PEEK-Ende des Tygon-Schlauchs in die Einlässe der mikrofluidischen Geräte ein. Führen Sie den verbleibenden Tygon-Schlauch (ohne PEEK-Schlauch am Ende) in den Ausgang des mikrofluidischen Geräts ein, wie in Abbildung 4C dargestellt. Geben Sie mindestens 3 ml Öl in eine 5 ml Kunststoffspritze und befestigen Sie sie an einer 25 G Nadel. Führen Sie die Nadel vorsichtig in den PEEK-Schlauch an einem der Tygon-Einlässe ein. Spülen Sie den Schlauch und das Gerät vorsichtig mit Öl. Sammeln Sie das Öl aus dem Auslass in einem konischen Rohr. Wiederholen Sie die Ölspülung am anderen Tygon-Einlass. Stellen Sie die Spritzenpumpen auf die gewünschten Durchflussraten ein.HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet 3 ml/h für den wässrigen Durchfluss und 6 ml/h für den Öldurchfluss. Es kann erforderlich sein, zwei separate Spritzenpumpen zu verwenden. Verbinden Sie die Spritze mit dem Tensid über eine 25-G-Nadel mit dem Öleinlass (siehe Abbildung 4A) und geben Sie vorsichtig genug Öl ab, um den Schlauch und den Ölkanal des mikrofluidischen Geräts anzusaugen. Sobald das Gerät und die Öleinlässe eingerichtet sind, fügen Sie 0,5 ml Öl zu einer neuen 5-ml-Spritze hinzu, die den Gelvorläufer enthält. Der Zweck dieser kleinen Ölmenge besteht darin, die Vorläuferlösung gegen Ende des Laufs durch die mikrofuilidische Vorrichtung zu spülen. In einem konischen Röhrchen werden 1,5 mL der PEG-Backbone-Lösung und 1,5 mL der Vernetzerlösung vermischt. Vortex für 30 s und schnell die kombinierte Gelvorläuferlösung in die 5 ml Spritze übertragen. Verbinden Sie die Spritze mit der Gelvorläuferlösung über eine 25 G Nadel mit dem wässrigen Einlass. Dosieren Sie vorsichtig genug Lösung, um den Schlauch und den wässrigen Kanal zu grundieren. Klemmen Sie die Spritzen auf die jeweiligen Spritzenpumpen und drücken Sie sie ( siehe Abbildung 4B). Stellen Sie sicher, dass Flüssigkeit sowohl durch den wässrigen als auch durch den Ölkanal fließt.HINWEIS: Es wird empfohlen, ein Mikroskop zu verwenden, um die Mikrogelbildung innerhalb des PDMS-Geräts zu visualisieren. Suchen Sie nach Partikeln einheitlicher Größe aus den Kanälen (siehe Abbildung 4D). Sammeln Sie die Mikrogele aus dem Auslass in einem konischen Röhrchen. Abbildung 4: Mikrofluidischer Aufbau. (A) Darstellung des Verfahrens zum Verbinden von PEEK-Schläuchen (oben) und Tygon-Schläuchen mit einer 25-G-Nadel auf einer Spritze (unten). (B) Mikrofluidischer Aufbau mit Spritzenpumpen, Schläuchen, Gerät und Mikroskop. (C) Bild des mikrofluidischen Geräteaufbaus mit zwei Einlässen (wässrig und Öl) und einem Auslass. (D) Schematische Darstellung der mikrofluidischen Vorrichtung und repräsentatives Hellfeldbild der erwarteten Mikrogelbildung aus den Kanälen in einer Stufenemulgierungsvorrichtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 5. Reinigung und Sterilisation von Mikrogelen Sobald die Gelierung abgeschlossen ist (bestimmt als Zeit-bis-Speicher-Modulplateau bei der Charakterisierung der Gelierungskinetik), entfernen Sie die Ölphase vorsichtig mit einer Pipette vom Boden des Röhrchens (siehe Abbildung 5). Legen Sie diese in einen geeigneten Abfallbehälter für fluorierte Abfälle.HINWEIS: Die Gelierzeit kann durch Zugabe einer organisch löslichen Base zum Sammelrohr (z. B. Triethylamin) beschleunigt werden, aber es ist wichtig zu beachten, dass die Zugabe einer starken Base alle nicht umgesetzten Maleimide hydrolysieren kann. Wenn es gewünscht wird, Mikrogele durch überschüssige Maleimide nach der Gelierung zu funktionalisieren, überspringen Sie die Zugabe von Triethylamin. Fügen Sie mehr Öl im Verhältnis 1:1 in das Mikrogel-Sammelröhrchen hinzu. Mischen Sie, indem Sie das Sammelrohr vorsichtig umdrehen. Nicht wirbeln. Lassen Sie das Sammelrohr ~5 min ruhen, damit sich die Phasen trennen können. Suchen Sie unten nach der Ölphase und oben nach der wässrigen Phase (den Mikrogelen) (siehe Abbildung 5). Wiederholen Sie die Ölwäschen mindestens 2x mehr. Fügen Sie mehr Öl im Verhältnis 1:1 mit dem Gel hinzu und fügen Sie 1x PBS in einem Verhältnis von 4:1 PBS zu Gel hinzu. Mehrmals umkehren, um zu mischen. Um die Schichten zu trennen, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei ~ 2.000 x g für ~ 30 s. Suchen Sie nach der Ölphase am Boden des Röhrchens, dem Gel in der Mitte und PBS oben (siehe Abbildung 5). Entfernen Sie die Ölphase mit einer Pipette und entsorgen Sie sie in einem Abfallbehälter.HINWEIS: Entfernen Sie den PBS nicht. Verwenden Sie ein größeres konisches Röhrchen, um das Waschen fortzusetzen, wenn das ursprüngliche Sammelröhrchen 15 ml betrug. Wiederholen Sie Öl und PBS wäscht 2x mehr. Achten Sie darauf, dass das Gel durch die letzte Wäsche von undurchsichtig zu klar übergeht, wie in Abbildung 5 gezeigt, was darauf hinweist, dass das Tensid entfernt wurde und sich das Gel in der PBS-Phase befindet. Entfernen Sie das gesamte Öl. Entfernen Sie PBS nicht aus dem konischen Rohr. Verwenden Sie in einem chemischen Abzug eine Glaspipette, um dem Rohr Hexane in einem gleichen Volumen wie das PBS hinzuzufügen. Wirbeln Sie das konische Rohr für 30 s oder bis es gründlich gemischt ist. Zentrifugieren bei 4.696 x g für 5 min. Suchen Sie nach der Trennung nach Hexanen in der oberen Schicht, PBS in der Mitte und Gel unten (siehe Abbildung 5). Entfernen Sie die Hexanschicht und entsorgen Sie sie in einem Behälter für organische Abfälle. Saugen Sie die PBS ab. Wiederholen Sie Hexan und PBS mindestens 2x mehr oder bis das Gel nahezu durchscheinend erscheint (siehe Abbildung 5). Waschen Sie das Gel mit PBS 1x mehr, damit alle verbleibenden Hexane entfernt werden. Zentrifugieren bei 4.696 x g für 5 min. Saugen Sie die PBS-Schicht ab. Achten Sie darauf, das Gelpellet nicht zu stören.Um nicht umgesetzte Maleimide in den Mikrogelen zu verschließen oder zu löschen, wird eine 100 mM Lösung von N-Acetyl-L-Cystein in 1x PBS hergestellt und diese Lösung dem Gel hinzugefügt. Über Nacht auf einen Tubenrotator bei 37 °C geben, gefolgt von vielen Wäschen mit PBS, um nicht umgesetztes N-Acetyl-L-Cystein zu entfernen. Für eine Langzeitlagerung (bis zu 1 Jahr) resuspendieren Sie die Mikrogele in 70% IPA und lagern Sie sie bei 4 ° C, um das Wachstum von Bakterien auf den Mikrogelen zu verhindern. Um die Mikrogele zu sterilisieren, fügen Sie dem Gel 70% IPA im Verhältnis 4:1 v/v in einer Biosicherheitshaube hinzu. Das Röhrchen 30 s durchwirbeln, dann bei 4.696 × g für 5 min zentrifugieren. Saugen Sie den IPA-Überstand aus dem Gelpellet in einer Biosicherheitshaube ab. Führen Sie 2x weitere IPA-Wäschen durch, gefolgt von 3x Wäschen mit sterilem 1x PBS.HINWEIS: Alle IPA sollten entfernt werden, bevor das Gel mit Zellen oder Tieren verwendet wird. Abbildung 5: Überblick über das Mikrogel-Reinigungsverfahren. Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; IPA = Isopropylalkohol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 6. Charakterisierung der Mikrogelgröße HINWEIS: Es wird empfohlen, Mikrogelpartikel über Nacht bei 37 °C in 1x PBS ausgleichen zu lassen, um vor der Größenbestimmung auf ihren endgültigen Durchmesser aufzuquellen. Bild Gelpartikel.Drehen Sie das MAP-Gel bei 4.696 × g für 5 min herunter und saugen Sie den Überstand ab. Entfernen Sie mit einer Verdrängerpipette 5 μL Mikrogele aus dem Gelpellet und verdünnen Sie 1 ml PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen (1:200 Verdünnung). Passen Sie diese Verdünnung nach Bedarf an.HINWEIS: Während der Formulierung der Gelvorläuferlösung können 5 μM Biotin-Maleimid zugegeben und als Alternative zur Markierung von Mikrogelen mit einem Fluorophor verwendet werden. In diesem Fall kann ein Streptavidin-Fluorophor in einer Verdünnung von 1:300 (aus 1 mg / ml Vorrat) hinzugefügt werden. Lassen Sie die Inkubation mit Streptavidin für mindestens 15 Minuten vor der Bildgebung. Mit einer Verdrängungspipette werden 100 μL der verdünnten Mikrogele in die Vertiefungen einer klaren 96-Well-Platte überführt. Verwenden Sie ein Weitfeld- oder Konfokalmikroskop, um die Mikrogele mit einem 10x-Objektiv sichtbar zu machen. Nehmen Sie Bilder der Mikrogele für die Analyse auf. Siehe Abbildung 6 für repräsentative konfokale Bilder von Mikrogelen. Dimensionierung von Partikeln mit ImageJÖffnen Sie die Bilddateien aus dem Mikroskop in ImageJ. Wählen Sie | analysieren aus. Stellen Sie die Skalierung ein und stellen Sie die Bildskala entsprechend dem Mikroskopobjektiv ein. Bild auswählen | Typ | 8-Bit. Bild auswählen | Anpassen | Schwellenwert und wählen Sie dann die automatische Schwellenwertoption “Otsu” aus dem Dropdown-Feld. Klicken Sie auf Analyze | Legen Sie Messungen fest und wählen Sie Ferets Durchmesser und begrenzen Sie den Schwellenwert. Klicken Sie auf Analyze | Analysieren Sie Partikel und geben Sie den Flächengrößenbereich (in Pixel ^ 2) ein, der für die Mikrogele erwartet wird (um kleine Trümmer von der Analyse auszuschließen). Ändern Sie die Zirkularität auf 0,75-1,00 und wählen Sie Show | Gliederungen. Aktivieren Sie Ergebnisse anzeigen und an Kanten ausschließen.HINWEIS: Der Zirkularitätsformfilter schließt Mikrogele am Bildrand aus, die zu einer ungenauen Durchmessermessung führen können. Führen Sie das Modul Partikel analysieren aus. Warten Sie auf die Ausgabe, die dem Feret-Durchmesser jedes Partikels entspricht, und exportieren Sie diese Ergebnisse in eine Tabelle. Berechnen Sie in diesem Protokoll den Polydispersitätsindex (PDI), um die Heterogenität der Mikrogelgröße zu bestimmen. Analysieren Sie mindestens 100 Mikrogele, um eine Population zu definieren: Ein PDI-Bereich von 1,00-1,05 definiert eine monodisperse Population und ein PDI größer als 1,05 definiert eine polydisperse Population. Verwenden Sie Gleichung (2), Gleichung (3) und Gleichung (4), um den PDI zu berechnen, wie unten beschrieben. (2) (3) (4) Abbildung 6: Repräsentative Bilder von Mikrogelen. (A) Fluoreszierendes konfokales Bild der Mikrogelpopulation A, (B) Bild von Schwellenwert-Mikrogelen und (C) Partikelumrisse nach ImageJ-Analyse. (D) Fluoreszierendes konfokales Bild der Mikrogelpopulation B und (E) Durchlichtbild von Mikrogelen (Mikrogele sind nahezu durchscheinend). (F) Darstellung repräsentativer Ergebnisse der in diesem Protokoll beschriebenen ImageJ-Analyse. Beide Mikrogelpopulationen haben relativ monodisperse PDIs. Beide Populationen von Mikrogelen wurden mit einer wässrigen Durchflussrate von 3 ml / h und einer Ölflussrate von 6 ml / h synthetisiert. Der Unterschied in der Mikrogelgröße ist jedoch auf Unterschiede in der Schrittweite des mikrofluidischen Geräts zurückzuführen. Zum Beispiel wurde die Mikrogelpopulation A mit einer mikrofluidischen Vorrichtung mit einer Kanalschrittweite von 11 μm synthetisiert, und die Mikrogelpopulation B wurde in einer Vorrichtung mit einer Schrittweite von 40 μm synthetisiert. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzung: PDI = Polydispersity Index. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 7. Gerüstglühen mit mikroporösen geglühten Partikeln (MAP) Man kann eine Stammlösung von 2 mM Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) in 1x PBS (pH 7,4) herstellen. Die LAP-Stammlösung wird auf 0,2 mM in einem Volumen von 1x PBS verdünnt, das dem Gelvolumen entspricht. Wenn Sie den LAP-Photoinitiator für Zellstudien oder Tierversuche verwenden, achten Sie darauf, die Lösung vor der Verwendung zu sterilisieren. Drehen Sie das MAP-Gel bei 4.696 × g für 5 min herunter und saugen Sie den Überstand ab. Übertragen Sie mit einer Verdrängerpipette das gewünschte Gelvolumen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dem Gel 0,2 mM LAP in einem volumetrischen Verhältnis von 1:1 hinzu (die endgültige LAP-Konzentration beträgt 0,1 mM). Wirbeln Sie die Mischung vor und inkubieren Sie sie mindestens 15 Minuten im Dunkeln. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 18.000 × g für 5 min, um das Gel zu pelletieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus dem Gelpellet. Übertragen Sie das MAP-Gel mit einer Verdrängungspipette an die Zielstelle. Tragen Sie fokussiertes Licht (365 nm, 8,66 mW/cm2) 113 s lang auf die Probe auf, um das Gerüst zu glühen.HINWEIS: Die Glühzeit von 113 s wurde wie zuvor veröffentlicht für eine LAP-Konzentration von 0,1 mM14 optimiert, aber möglicherweise ist eine zusätzliche Optimierung für verschiedene Photoinitiatorkonzentrationen erforderlich. Abbildung 7: MAP-Gerüstglühen. (A) Schematische Darstellung des MAP-Gerüstglühens. Bei Bestrahlung mit einem Photoinitiator und Licht durchlaufen die funktionellen Methacrylamidgruppen auf dem MethMAL-Makromer eine Klick-Photopolymerisationsreaktion, die die Oberflächen der Mikrogele miteinander verbindet. (B) Darstellung eines 3D-Renderings (Imaris) eines Zwei-Photonen-Mikroskopbildes von MAP-Mikrogelen (grün), die in einer 3D-Puckform mit Dextran (rot) in den Poren geglüht wurden. (C) Darstellung eines 3D-Renderings (Imaris) eines Zwei-Photonen-Mikroskopbildes, das die Porosität eines MAP-Gerüsts zeigt, das mit fluoreszierendem 70 kDa Dextran (rot) durchblutet wurde. Maßstabsbalken = (B) 100 μm, (C) 70 μm. Abkürzungen: MAP = microporous annealed particle; MethMAL = kundenspezifisches Glühmakromer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.