Synthèse microfluidique de blocs de construction de microgel pour échafaudage de particules microporeuses recuites

1. Synthèse des macromères de recuit MethMAL REMARQUE: Ce protocole est spécifiquement destiné à modifier 1 g de PEG-maléimide, mais peut être mis à l’échelle pour faire des lots plus importants. Ajouter 1 g de 4 bras 20 kDa PEG-maléimide à 10 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) dans un petit bécher en verre muni d’une barre d’agitation. Remuer la solution à 300 tr/min jusqu’à ce que le PEG soit complètement dissous (~30 min). Ajouter 14,65 mg de 2-aminoéthanéthiol (rapport molaire thiol [SH] 0,67:1 à maléimide [MAL]) à la réaction sous agitation à 300 rpm.REMARQUE: Les groupes thiol sur le 2-aminoéthanéthiol seront ajoutés à environ trois bras du PEG-MAM par addition de type Michael, laissant des groupes d’extrémité amine.Observez l’exemple de calcul suivant pour la quantité de 2-aminoéthanéthiol à ajouter:REMARQUE: Pour éviter de mesurer une très petite quantité, dissoudre 100 mg de 2-aminoéthanéthiol dans 1 mL de 1x PBS (pH 7,4) et ajouter 146,5 μL de cette solution à la réaction. Attendre 1 h et 10 minutes après l’étape 1.2., puis mélanger 160,1 mg de chlorure de 4-(4,6-Diméthoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-méthylmorpholinium (DMTMM, rapport molaire 12:1 au PEG) et 32,77 μL d’acide méthacrylique (rapport molaire 8:1 au PEG) dans 5 mL de 1x PBS (pH 7,4) dans un nouveau bécher en verre et réagir pendant 50 min sous agitation à 300 tr/min.REMARQUE: À cette étape, l’acide méthacrylique réagit avec DMTMM pour former un ester hautement réactif qui peut ensuite être couplé aux groupes amines disponibles sur le PEG.Observez l’exemple de calcul suivant pour calculer la quantité de DMTMM à ajouter : Observez l’exemple de calcul suivant pour calculer la quantité d’acide méthacrylique à ajouter : Ajouter la solution d’acide méthacrylique/DMTMM dans le bécher avec la solution de 20 kDa PEG-MAL/2-aminoéthanéthiol. Ajouter 53,56 μL de triéthylamine (rapport molaire 1:1 à l’acide méthacrylique) dans le bécher et laisser réagir pendant la nuit en agitant à 300 tr/min. Couvrir le bécher avec du papier d’aluminium pour empêcher la poussière et les autres contaminants de pénétrer dans le bécher.Observez l’exemple de calcul suivant pour la quantité de triéthylamine à ajouter : Transférer la réaction dans un tube de dialyse en peau de serpent (seuil de poids moléculaire : 3 500 Da). Placer le tube de dialyse dans un grand bécher avec 1 M NaCl dans de l’eau désionisée (DI) (le volume doit couvrir entièrement le tube) pendant 3 jours sous agitation à 300 tr / min. Changez la solution de NaCl 1 M 2x par jour pour un total de six lavages. Dialyser pendant 6 h dans de l’eau DI. Changez l’eau DI toutes les heures pour un total de six lavages. Transférer la réaction dans un tube conique de 50 mL et congeler à −80 °C. Lyophiliser le tube pendant au moins 72 h à une température de départ de −70 °C et à une rampe de température de 0,01 °C/min jusqu’à 0 °C. Préparer l’échantillon pour 1H-RMN en dissolvant 25 mg de MethMAL dans 700 μL de chloroforme-d et transférer dans un tube RMN. Acquérir les spectres RMN 1H.NOTE: Les spectres de ce protocole ont été acquis à l’aide d’un spectromètre de 500 MHz avec les paramètres suivants: largeur de balayage = 6 467,3 Hz, délai = 13,1 s, temps d’acquisition = 5,1 s, temps d’impulsion = 5,1 μs et nombre de balayages = 8. Pour l’analyse, intégrer le pic de maléimide comme référence (~6,76 ppm), puis intégrer les deux pics de méthacrylamide (~5,35 ppm et 5,6 ppm). Diviser le rapport des aires des pics de méthacrylamide par la superficie totale des trois pics pour obtenir le pourcentage de bras modifiés avec du méthacrylamide.REMARQUE : Une modification acceptable est la substitution fonctionnelle de 67 % à 75 % du groupe méthacrylamide. Un exemple de spectre 1H-RMN pour MethMAL est illustré à la figure 1.Utilisez l’équation (1) comme équation du degré de substitution :(1) Figure 1 : Structure chimique et spectre 1H-RMN de MethMAL. (A) Structure chimique : le macromère de recuit MethMAL est composé de 20 kDa de poly(éthylèneglycol) à 4 bras modifié avec trois bras méthacrylamide. (B) Cette structure génère des pics à 5,36 ppm (3) et 5,76 ppm (2) non présents dans les spectres PEG-MAL, et un bras maléimide, qui génère un pic à 6,71 ppm (1). Le solvant, le chloroforme, a généré un pic à 7,26 ppm, et l’eau résiduelle dans cet échantillon a généré un pic à 2,2 ppm (marqué sur les spectres). Dans les spectres MethMAL, le pic de maléimide avait une aire intégrée de 0,27, et la somme des aires des pics de méthacrylamide était de 0,73 (0,37 + 0,36). La modification en pourcentage de méthacrylamide était de 73 % (0,73/(0,27 + 0,73)). Ce chiffre est tiré de Pfaff et al.14. Droits d’auteur (2021) American Chemical Society. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 2. Cinétique de gélification des précurseurs de microgel NOTE: Le temps de gélification peut être modifié en ajustant le pH du tampon utilisé pour dissoudre les composants précurseurs du gel. Pour les hydrogels de PEG-maléimide, un pH plus acide correspond généralement à un temps de gélification plus lent puisque la concentration de thiolate est diminuée à un pH inférieurde 15. Prédéterminer les concentrations souhaitées de polymère, de réticulant et d’autres composants précurseurs de gel (peptides , glycosaminoglycanes). Dissoudre le PEG-MAL, RGD et MethMAL (épine dorsale PEG) dans 10x PBS (pH 1,5) et le réticulateur MMP-2 dans 1x PBS (pH 7,4).REMARQUE : Dans ce protocole, la solution de précurseur du gel est une formulation publiée3, qui comprend 45,88 mg/mL de PEG-MAL à 4 bras (10 kDa), 0,82 mg/mL de RGD, 8,06 mg/mL de MethMAL et 4,62 mg/mL de réticulant MMP-2 (agent de réticulation enzymatiquement dégradable). Préparer un viscosimètre, ou un instrument équivalent, pour surveiller les modules de stockage et de perte en utilisant un espace de 0,4 mm, une déformation de cisaillement de 1,0, une fréquence de 1,0 Hz et une durée de 10 800 s.Fixez une géométrie de rotor à plaques de 35 mm (P35/Ti). Utilisez une chambre humidifiée ou une éponge humide autour de la géométrie pour maintenir un environnement humidifié. Mélangez le squelette PEG et le réticulant MMP dans un rapport volumétrique de 1:1. Pipeter 400 μL de la solution de précurseur du gel au centre de l’étage viscosimétrique. Abaissez lentement la géométrie sur la scène jusqu’à ce qu’elle atteigne la taille d’espace prédéterminée de 0,4 mm et commencez immédiatement à surveiller les modules de stockage (G’) et de perte (G”) jusqu’à 6 heures à température ambiante.REMARQUE : La gélification est considérée comme commençant lorsque le module de stockage devient supérieur au module de perte, et la gélification est considérée comme terminée lorsque le module de stockage plafonne. Une courbe représentative de la cinétique de gélification est représentée à la figure 2. Figure 2 : Courbe représentative de la cinétique de gélification d’une solution de précurseur de gel MAP (pH 4,5) déterminée par un viscosimètre. La gélification commence à l’augmentation rapide du module de stockage (G’), et la gélification se termine lorsque la courbe G’ plafonne. G” indique le module de perte. Ce chiffre est tiré de Pruett et al.3. Droits d’auteur (2021) Wiley-VCH GmBH. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 3. Fabrication de dispositifs microfluidiques REMARQUE : Ce protocole décrit la fabrication d’un dispositif d’émulsification microfluidique adaptée de de Rutte et al.13, qui peut être vu à la figure 3A. Cependant, ce protocole peut être utilisé avec n’importe quelle conception de périphérique gravée dans une plaquette SU-8. Il est recommandé d’externaliser la fabrication principale de plaquettes de silicium SU-8, à moins que les installations de salle blanche appropriées ne soient disponibles pour la fabrication. Créez le premier dispositif microfluidique polydiméthylsiloxane (PDMS) à partir d’un photomasque à plaquette SU-8.Préparer ~200 g de PDMS en mélangeant la base et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1 p/p (voir le tableau des matériaux). Placez la plaquette SU-8 dans un plat de culture (collez les bords de la plaquette à la boîte), avec la conception microfluidique tournée vers le haut. Versez PDMS dans le plat pour créer une couche de 1 à 1,5 cm d’épaisseur sur la plaquette. Placez le plat sous vide pour éliminer les bulles. Laisser durcir le PDMS jusqu’à solidification (24 h à température ambiante ou ~2 h à 60 °C). Une fois que le PDMS a durci, utilisez soigneusement une lame de rasoir ou un scalpel pour couper un rectangle à travers le PDMS, de sorte qu’il y ait une marge de 0,5 à 1 cm autour du dessin sur la plaquette.REMARQUE: N’utilisez pas trop de pression et soyez très doux pour éviter d’endommager (par exemple, craquer, gratter) la plaquette. Coincez une spatule dans l’une des coupes et faites-la glisser le long des coupes pour séparer le PDMS de la plaquette.REMARQUE : Lorsque le PDMS se sépare de la plaquette, une bulle d’air commence à se former sous le PDMS (voir la figure 3B). Utilisez la spatule pour soulever doucement le rectangle de PDMS hors de la boîte.REMARQUE: L’espace résultant dans le PDMS au-dessus de la plaquette sera le moule pour les dispositifs microfluidiques. Créez ensuite des dispositifs microfluidiques PDMS à partir du photomasque de plaquette SU-8.Préparer ~15-20 g de PDMS par moule en mélangeant la base et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Versez PDMS dans l’espace rectangulaire du moule pour créer une couche de 5 mm de PDMS au-dessus de la plaquette. Mettez le moule sous vide pour éliminer les bulles. Laisser durcir le PDMS jusqu’à solidification complète (24 h à température ambiante ou 2 h à 60 °C). Une fois que le PDMS a durci, utilisez une lame de rasoir ou un scalpel pour couper le PDMS autour des bords du rectangle.REMARQUE: N’utilisez pas trop de pression et soyez très doux pour éviter d’endommager (c’est-à-dire de craquer) la plaquette. Coincez une spatule dans l’une des coupes et faites-la glisser le long des coupes pour séparer le PDMS de la plaquette.REMARQUE: Lorsque le PDMS se sépare de la plaquette, une bulle d’air commence à se former sous le PDMS. Utilisez un poinçon de biopsie de 1,5 mm pour créer des trous à travers le rectangle PDMS aux deux entrées et à la sortie (voir la figure 3B). S’il y a plusieurs appareils sur une seule tranche, utilisez une spatule ou une lame de rasoir pour marquer légèrement le PDMS entre chaque appareil, puis pliez doucement le PDMS le long des lignes marquées afin que le PDMS se sépare très proprement. Rangez les appareils PDMS dans un récipient sans poussière. Collez les dispositifs microfluidiques PDMS à des lames de verre.Préparez une lame de verre par dispositif microfluidique PDMS. Utilisez du ruban adhésif, de l’air filtré ou des lavages à l’alcool isopropylique (IPA) pour enlever toute poussière de la lame. Assurez-vous que les lames sont complètement sèches avant de passer à l’étape suivante. Placez une lame de verre et un dispositif PDMS, côté conception vers le haut, l’un à côté de l’autre sur un petit plateau en plastique (un couvercle à plaque de 96 puits fonctionne bien pour cela) et placez-le dans un nettoyant plasma. Fermez la porte et la vanne de débit d’air et allumez la pompe à vide. Laissez-le fonctionner pendant au moins 30 s, puis éteignez-le. Connectez le tube de gaz du réservoir d’oxygène à la vanne de débit d’air. Laissez la chambre à plasma se remplir d’oxygène pendant 30 s, puis éteignez l’oxygène et fermez la vanne de débit d’air. Allumez la pompe à vide et réglez le niveau de radiofréquence (RF) sur élevé. Attendez que la chambre prenne une couleur violet-rose (voir la figure 3B). Laisser passer 30 s. Lorsque la minuterie se déclenche, éteignez le plasma et passez l’aspirateur. Ensuite, ouvrez lentement la vanne de débit d’air pour libérer le vide. Retirez le plateau du nettoyeur plasma. Retournez doucement le périphérique PDMS sur la lame de verre pour les coller. Au fur et à mesure que la liaison se produit, observez la légère différence dans la transparence du PDMS.REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, conservez les appareils collés à 60 ° C jusqu’à ce qu’ils soient immédiatement avant utilisation. Traitement de surface des dispositifs microfluidiques PDMSPréparer le traitement de surface en diluant les PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) dans de l’huile Novec (1:50). Utilisez 1 mL pour 3-4 appareils. Transférer le volume dans une seringue de 1 mL et fixer une aiguille de 25 G.REMARQUE: Les aiguilles utilisées dans ce protocole sont biseautées, alors faites attention lorsque vous manipulez des objets tranchants. Des aiguilles contondantes peuvent également être utilisées si vous le souhaitez. Coupez un morceau de tube Tygon de 10 à 12 cm par appareil qui sera traité. Couper un morceau de tube en PEEK, ~7 cm de longueur. Insérez quelques millimètres du tube en PEEK à l’extrémité du tube Tygon, comme illustré à la figure 4A, pour empêcher l’aiguille de percer les entrées du tube Tygon. Retirez le(s) appareil(s) de la chambre chauffée et insérez l’extrémité non PEEK du tube Tygon dans le trou d’entrée aqueux. Insérez l’aiguille de la seringue de traitement de surface dans le tube en PEEK et recouvrez le trou de sortie de la chambre d’huile (voir Figure 3B). Injectez le traitement dans l’appareil lentement et assurez-vous qu’il remplit l’appareil, sans bulles. Attendez que les chambres aqueuses se remplissent en premier, suivies des canaux plus petits, puis de la chambre à huile. Retirez le tube Tygon de l’appareil. Une fois l’appareil rempli, laissez-le reposer pendant 10 min à température ambiante. Remplissez une seringue de 5 ml avec de l’huile seulement (pas de silane) et fixez une aiguille de 25 g. Aspirez le traitement de surface hors de l’appareil par les entrées et les sorties. Insérez le tube Tygon dans l’entrée aqueuse, insérez la seringue avec de l’huile dans le tube en PEEK et rincez chaque dispositif avec de l’huile. Aspirez l’huile hors de l’appareil. Répétez le rinçage de l’huile 2x plus. Retirez le tube Tygon.REMARQUE: L’appareil est prêt à être utilisé. Figure 3 : Dispositif PDMS microfluidique. (A) Dessin de conception assistée par ordinateur (AutoCAD) de la conception de dispositifs microfluidiques. La formation de gouttelettes de microgel se produit dans les canaux de chaque côté du canal pétrolier, comme on le voit dans l’affleurement amplifié. (B) Vue d’ensemble de la fabrication des dispositifs PDMS. Abréviation : PDMS = polydiméthylsiloxane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 4. Génération microfluidique de microgels Prédéterminer les concentrations souhaitées de polymère, de réticulant et d’autres composants précurseurs de gel (peptides , glycosaminoglycanes). Dissoudre le PEG-MAL, RGD et MethMAL (PEG-squelette) dans 10x PBS (pH 1,5) et le réticulant MMP-2 avec 5 μM de biotine-maléimide dans 1x PBS (pH 7,4).REMARQUE : Dans ce protocole, la solution de précurseur du gel est une formulation publiée3 composée de 45,88 mg/mL de PEG-MAL à 4 bras (10 kDa), de 0,82 mg/mL de RGD, de 8,06 mg/mL de MethMAL et de 4,62 mg/mL de réticulant MMP-2 (agent de réticulation enzymatiquement dégradable). Les méthodes décrites ci-dessous donneront ~3 mL de microgels. Préparer 6 mL de solution de surfactant en diluant le stock de FluoroSurfactant à 5% à au moins 1% dans l’huile Novec. Ajouter cette solution à une seringue de 10 mL.REMARQUE: Le tensioactif fluoré est non miscible avec l’eau, ce qui lui permet d’être facilement éliminé pendant la transition du gel à la phase aqueuse pendant les lavages PBS dans l’étape de purification. Coupez trois morceaux de tube Tygon d’une longueur appropriée pour la hauteur de la pompe de la seringue. Coupez deux morceaux de tube en PEEK, ~ 1 pouce de longueur. Insérez quelques millimètres du tube en PEEK dans l’extrémité de deux morceaux de tube Tygon, comme illustré à la figure 4A, pour empêcher l’aiguille de percer les entrées du tube Tygon. Insérez l’extrémité non PEEK du tube Tygon dans les entrées des dispositifs microfluidiques. Insérez le morceau restant de tube Tygon (sans tube en PEEK à l’extrémité) dans la sortie du dispositif microfluidique, comme illustré à la figure 4C. Ajouter au moins 3 mL d’huile à une seringue en plastique de 5 mL et la fixer à une aiguille de 25 G. Insérez délicatement l’aiguille dans le tube en PEEK de l’une des entrées Tygon. Rincez doucement le tube et l’appareil avec de l’huile. Recueillir l’huile de la sortie dans un tube conique. Répétez le rinçage de l’huile sur l’autre entrée Tygon. Réglez les pompes à seringue sur les débits souhaités.REMARQUE : Ce protocole utilise 3 mL/h pour le débit aqueux et 6 mL/h pour le débit d’huile. Il peut être nécessaire d’utiliser deux pompes à seringue distinctes. Connectez la seringue contenant le surfactant à l’entrée d’huile à l’aide d’une aiguille de 25 G (voir Figure 4A) et distribuez doucement suffisamment d’huile pour amorcer le tube et le canal d’huile du dispositif microfluidique. Une fois l’appareil et les entrées d’huile installés, ajoutez 0,5 mL d’huile à une nouvelle seringue de 5 mL, qui contiendra le précurseur du gel. Le but de cette petite quantité d’huile est d’aider à rincer la solution précurseur à travers le dispositif microfuilidique vers la fin de la course. Dans un tube conique, combiner 1,5 mL de la solution de squelette PEG et 1,5 mL de la solution de réticulation. Vortex pendant 30 s et transférer rapidement la solution de précurseur de gel combiné dans la seringue de 5 mL. Connectez la seringue avec la solution précurseur du gel à l’entrée aqueuse via une aiguille de 25 G. Distribuer doucement suffisamment de solution pour amorcer le tube et le canal aqueux. Fixez les seringues sur les pompes de seringue respectives et appuyez sur la seringues (voir Figure 4B). Assurez-vous qu’il y a du liquide qui s’écoule à travers les canaux aqueux et huileux.REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser un microscope pour visualiser la formation de microgel dans le dispositif PDMS. Recherchez les particules de taille uniforme dans les canaux (voir la figure 4D). Recueillir les microgels de la sortie dans un tube conique. Figure 4 : Configuration microfluidique. (A) Représentation de la méthode de connexion d’un tube en PEEK (en haut) et d’un tube Tygon à une aiguille de 25 G sur une seringue (en bas). (B) Installation microfluidique avec pompes à seringue, tubes, dispositif et microscope. (C) Image de la configuration du dispositif microfluidique, avec deux entrées (aqueuses et huileuses) et une sortie. (D) Schéma du dispositif microfluidique et image représentative en fond clair de la formation attendue de microgel à partir des canaux dans un dispositif d’émulsification par étapes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 5. Purification et stérilisation des microgels Une fois la gélification terminée (déterminée comme le plateau du temps jusqu’au module de stockage dans la caractérisation de la cinétique de gélification), utilisez une pipette pour retirer soigneusement la phase huileuse du fond du tube (voir la figure 5). Déposez-le dans un conteneur à déchets approprié pour les déchets fluorés.REMARQUE : Le temps de gélification peut être accéléré en ajoutant une base organique soluble au tube de collecte (p. ex. triéthylamine), mais il est important de noter que l’ajout d’une base forte peut hydrolyser tout maléimide n’ayant pas réagi. Si l’on souhaite fonctionnaliser les microgels par un excès de maléimides après la gélification, sauter l’ajout de triéthylamine. Ajouter plus d’huile dans le tube de collecte de microgel dans un rapport de 1: 1. Mélanger en retournant doucement le tube de collecte. Ne pas vortex. Laissez le tube de collecte reposer pendant ~5 min pour permettre aux phases de se séparer. Recherchez la phase huileuse en bas et la phase aqueuse (les microgels) en haut (voir Figure 5). Répétez les lavages à l’huile au moins 2x plus. Ajoutez plus d’huile dans un rapport 1: 1 avec le gel et ajoutez 1x PBS dans un rapport PBS / gel de 4: 1. Retourner pour mélanger plusieurs fois. Pour séparer les couches, centrifuger le tube à ~2 000 x g pendant ~30 s. Recherchez la phase huileuse au fond du tube, le gel au milieu et le PBS sur le dessus (voir Figure 5). Retirer la phase huileuse à l’aide d’une pipette et jeter dans un conteneur à déchets.REMARQUE: Ne retirez pas le PBS. Utilisez un tube conique plus grand pour continuer les lavages si le tube de prélèvement original était de 15 mL. Répétez l’huile et le PBS lavage 2x plus. Recherchez le gel pour passer d’opaque à clair lors du lavage final, comme le montre la figure 5, indiquant que le surfactant a été éliminé et que le gel est en phase PBS. Retirez toute l’huile. Ne retirez pas le PBS du tube conique. Dans une hotte chimique, utilisez une pipette en verre pour ajouter des hexanes au tube à un volume égal à celui du PBS. Vortex du tube conique pendant 30 s ou jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé. Centrifuger à 4 696 x g pendant 5 min. Après la séparation, recherchez les hexanes dans la couche supérieure, le PBS au milieu et le gel en bas (voir la figure 5). Retirez la couche d’hexane et jetez-la dans un récipient pour déchets organiques. Aspirez le PBS. Répéter les lavages à l’hexane et au PBS au moins 2 fois de plus ou jusqu’à ce que le gel apparaisse presque translucide (voir la figure 5). Lavez le gel avec du PBS 1x de plus afin que les hexanes restants soient éliminés. Centrifuger à 4 696 x g pendant 5 min. Aspirez la couche PBS. Veillez à ne pas déranger la pastille de gel.Pour coiffer ou éteindre tout maléimide n’ayant pas réagi dans les microgels, préparer une solution de 100 mM de N-acétyl-L-cystéine dans 1x PBS et ajouter cette solution au gel. Placer sur un rotateur tubulaire à 37 °C pendant la nuit, suivi de nombreux lavages avec PBS pour éliminer la N-acétyl-L-cystéine qui n’a pas réagi. Pour un stockage à long terme (jusqu’à 1 an), remettre les microgels en suspension dans de l’IPA à 70% et conserver à 4 °C pour aider à prévenir la croissance des bactéries sur les microgels. Pour stériliser les microgels, ajoutez 70% d’IPA au gel dans un rapport 4:1 v/v dans une hotte de biosécurité. Tourbillonner le tube pendant 30 s, puis centrifuger à 4 696 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant IPA de la pastille de gel dans une hotte de biosécurité. Effectuez 2x plus de lavages IPA suivis de 3x lavages avec 1x PBS stérile.REMARQUE: Toute IPA doit être retirée avant d’utiliser le gel avec des cellules ou des animaux. Figure 5 : Vue d’ensemble de la procédure de purification du microgel. Abréviations : PBS = solution saline tamponnée au phosphate; IPA = alcool isopropylique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 6. Caractérisation de la taille des microgels REMARQUE: Il est recommandé de laisser les particules de microgel s’équilibrer dans 1x PBS pendant une nuit à 37 ° C pour gonfler à leur diamètre final avant le calibrage. Particules de gel image.Faire tourner le gel MAP à 4 696 × g pendant 5 min et aspirer le surnageant. À l’aide d’une pipette volumétrique, retirer 5 μL de microgels de la pastille de gel et diluer dans 1 mL de PBS dans un tube microcentrifuge (dilution 1:200). Ajustez cette dilution au besoin.NOTE: Lors de la formulation de la solution de précurseur du gel, 5 μM de biotine-maléimide peuvent être ajoutés et utilisés comme alternative au marquage des microgels avec un fluorophore. Dans ce cas, un streptavidine-fluorophore peut être ajouté à une dilution de 1:300 (à partir de 1 mg/mL de stock). Laisser incuber la streptavidine pendant au moins 15 minutes avant l’imagerie. À l’aide d’une pipette volumétrique, transférer 100 μL des microgels dilués dans les puits d’une plaque transparente de 96 puits. Utilisez un microscope à grand champ ou confocale pour visualiser les microgels avec un objectif 10x. Acquérir des images des microgels pour analyse. Voir la figure 6 pour des images confocales représentatives des microgels. Dimensionnement des particules avec ImageJOuvrez les fichiers image du microscope dans ImageJ. Sélectionnez Analyser | Réglez l’échelle et réglez l’échelle de l’image en fonction de l’objectif du microscope. Sélectionnez Image | Type | 8 bits. Sélectionnez Image | Ajuster | Seuil , puis sélectionnez l’option de seuil automatique « Otsu » dans la liste déroulante. Cliquez sur Analyser | Définissez les mesures et sélectionnez le diamètre de Feret et limitez-vous au seuil. Cliquez sur Analyser | Analysez les particules et entrez la plage de taille de zone (en pixel ^ 2) attendue pour les microgels (pour exclure les petits débris de l’analyse). Réglez la circularité sur 0,75-1,00 et sélectionnez Afficher | Grandes lignes. Cochez les résultats d’affichage et excluez sur les bords.REMARQUE: Le filtre de forme de circularité exclut les microgels sur la bordure de l’image qui peuvent donner une mesure de diamètre inexacte. Exécutez le module Analyser les particules . Attendez la sortie, qui est le diamètre de Feret de chaque particule, et exportez ces résultats dans une feuille de calcul. Dans ce protocole, calculez l’indice de polydispersité (PDI) pour déterminer l’hétérogénéité de la taille du microgel. Analyser au moins 100 microgels pour définir une population : une plage PDI de 1,00 à 1,05 définit une population monodispersée, et une PDI supérieure à 1,05 définit une population polydispersée. Utilisez l’équation (2), l’équation (3) et l’équation (4) pour calculer le PDI, comme décrit ci-dessous. (2) (3) (4) Figure 6 : Images représentatives de microgels. (A) Image confocale fluorescente de la population de microgels A, (B) image de microgels seuillés, et (C) contours de particules après analyse ImageJ. (D) Image confocale fluorescente de la population de microgels B et (E) image lumineuse transmise des microgels (les microgels sont presque translucides). (F) Représentation des résultats représentatifs de l’analyse ImageJ décrite dans le présent protocole. Les deux populations de microgel ont des PDI relativement monodispersées. Les deux populations de microgels ont été synthétisées avec un débit aqueux de 3 mL/h et un débit d’huile de 6 mL/h. Cependant, la différence de taille de microgel est due à des différences dans la taille des pas du dispositif microfluidique. Par exemple, la population de microgel A a été synthétisée avec un dispositif microfluidique avec une taille de pas de canal de 11 μm, et la population de microgel B a été synthétisée dans un dispositif avec une taille de pas de 40 μm. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviation : PDI = indice de polydispersité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 7. Recuit d’échafaudage de particules microporeuses recuites (MAP) Créer une solution mère de 2 mM de phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium (LAP) dans 1x PBS (pH 7,4). Diluer la solution mère LAP à 0,2 mM dans un volume de 1x PBS équivalent au volume de gel. Si vous utilisez le photoinitiateur LAP pour des études cellulaires ou animales, assurez-vous de stériliser la solution avant utilisation. Faire tourner le gel MAP à 4 696 × g pendant 5 min et aspirer le surnageant. À l’aide d’une pipette volumétrique, transférer le volume de gel souhaité dans un tube microcentrifugeux. Ajouter 0,2 mM LAP au gel dans un rapport volumétrique de 1:1 (la concentration finale de LAP est de 0,1 mM). Tourbillonner le mélange et incuber pendant au moins 15 minutes dans l’obscurité. Centrifuger le mélange à 18 000 × g pendant 5 min pour granuler le gel. Retirez délicatement le surnageant de la pastille de gel. Transférer le gel MAP à l’emplacement cible à l’aide d’une pipette à déplacement positif. Appliquer une lumière focalisée (365 nm, 8,66 mW/cm2) sur l’échantillon pendant 113 s pour recuire l’échafaudage.NOTE: Le temps de recuit de 113 s a été optimisé comme publié précédemment pour une concentration LAP de 0,1 mM14, mais une optimisation supplémentaire pour différentes concentrations de photoinitiateurs peut être nécessaire. Figure 7 : Recuit d’échafaudage MAP. (A) Schéma du recuit d’échafaudage MAP. Lorsqu’ils sont exposés à un photoinitiateur et à la lumière, les groupes fonctionnels méthacrylamide sur le macromère MethMAL subissent une réaction de photopolymérisation par clic, qui lie les surfaces des microgels ensemble. (B) Représentation d’un rendu 3D (Imaris) d’une image au microscope à deux photons de microgels MAP (vert) recuits ensemble en forme de rondelle 3D, avec du dextrane (rouge) dans les pores. (C) Représentation d’un rendu 3D (Imaris) d’une image de microscope à deux photons montrant la porosité d’un échafaudage MAP perfusé avec du dextrane fluorescent de 70 kDa (rouge). Barres d’échelle = (B) 100 μm, (C) 70 μm. Abréviations : MAP = particule microporeuse recuite; MethMAL = macromère de recuit personnalisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.