Microfluïdische synthese van microgel-bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjessteiger

1. MethMAL gloeiende macromeersynthese OPMERKING: Dit protocol is specifiek voor het wijzigen van 1 g PEG-maleimide, maar kan worden opgeschaald om grotere batches te maken. Voeg 1 g 4-armige 20 kDa PEG-maleimide toe aan 10 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) in een klein glazen bekerglas met een roerstaaf. Roer de oplossing op 300 rpm totdat de PEG volledig is opgelost (~30 min). Voeg 14,65 mg 2-aminoethaanthiol (0,67:1 thiol [SH] tot maleimide [MAL] molaire verhouding) toe aan de reactie met roeren bij 300 tpm.OPMERKING: De thiolgroepen op 2-aminoethaanthiol worden toegevoegd aan ongeveer drie armen van de PEG-MAL via Michael-type toevoeging, waardoor amine-eindgroepen overblijven.Let op de volgende voorbeeldberekening voor de hoeveelheid 2-amino-ethaanthiol die moet worden toegevoegd:OPMERKING: Om te voorkomen dat een zeer kleine hoeveelheid wordt gemeten, lost u 100 mg 2-amino-ethaanthiol op in 1 ml 1x PBS (pH 7,4) en voegt u 146,5 μL van die oplossing toe aan de reactie. Wacht 1 uur en 10 min na stap 1.2., meng vervolgens 160,1 mg 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorfoliniumchloride (DMTMM, 12:1 molaire verhouding tot PEG) en 32,77 μL methacrylzuur (8:1 molaire verhouding tot PEG) in 5 ml 1x PBS (pH 7,4) in een nieuw glazen bekerglas en reageer gedurende 50 minuten met roeren bij 300 tpm.OPMERKING: Bij deze stap reageert het methacrylzuur met DMTMM om een zeer reactieve ester te vormen die vervolgens kan worden gekoppeld aan de beschikbare aminegroepen op de PEG.Let op de volgende voorbeeldberekening voor het berekenen van de hoeveelheid DMTMM die moet worden toegevoegd: Let op de volgende voorbeeldberekening voor het berekenen van de hoeveelheid methacrylzuur die moet worden toegevoegd: Voeg de methacrylzuur/DMTMM-oplossing toe aan het bekerglas met de 20 kDa PEG-MAL/2-aminoethaanthioloplossing. Voeg 53,56 μL triethylamine (1:1 molaire verhouding tot methacrylzuur) toe aan het bekerglas en laat een nacht reageren met roeren bij 300 tpm. Bedek het bekerglas met folie om te voorkomen dat stof en andere verontreinigingen het bekerglas binnendringen.Let op de volgende voorbeeldberekening voor de hoeveelheid triethylamine die moet worden toegevoegd: Breng de reactie over op slangenhuiddialysebuizen (moleculaire gewichtsafsnijding: 3.500 Da). Plaats de dialysebuis in een groot bekerglas met 1 M NaCl in gedeïoniseerd (DI) water (volume moet de slang volledig bedekken) gedurende 3 dagen met roeren bij 300 tpm. Vervang de 1 M NaCl-oplossing 2x per dag voor een totaal van zes wasbeurten. Dialyseer gedurende 6 uur in DI-water. Ververs het DI-water elk uur voor een totaal van zes wasbeurten. Breng de reactie over in een conische buis van 50 ml en vries in bij −80 °C. Lyofiliseer de buis gedurende ten minste 72 uur bij een starttemperatuur van −70 °C en een temperatuurstijging van 0,01 °C/min tot 0 °C. Bereid het monster voor op 1H-NMR door 25 mg MethMAL op te lossen in 700 μL chloroform-d en over te brengen naar een NMR-buis. Verkrijg de 1H-NMR spectra.OPMERKING: De spectra in dit protocol zijn verkregen met behulp van een 500 MHz-spectrometer met de volgende parameters: veegbreedte = 6.467,3 Hz, tijdvertraging = 13,1 s, acquisitietijd = 5,1 s, pulstijd = 5,1 μs en aantal scans = 8. Integreer voor analyse de maleimidepiek als referentie (~ 6,76 ppm) en integreer vervolgens de twee methacrylamidepieken (~ 5,35 ppm en 5,6 ppm). Deel de verhouding van de piekgebieden van methacrylamide door de totale oppervlakte van alle drie de pieken om het percentage armen te verkrijgen dat is gemodificeerd met methacrylamide.OPMERKING: Een aanvaardbare wijziging is 67% -75% methacrylamide functionele groepssubstitutie. Een voorbeeld 1H-NMR spectrum voor MethMAL is weergegeven in figuur 1.Gebruik vergelijking (1) als de mate van substitutievergelijking:(1) Figuur 1: Chemische structuur en 1H-NMR spectrum van MethMAL. (A) Chemische structuur: het MethMAL gloeiende macromeer bestaat uit 20 kDa 4-arm poly (ethyleenglycol) gemodificeerd met drie methacrylamidearmen. (B) Deze structuur genereert pieken bij 5,36 ppm (3) en 5,76 ppm (2) die niet aanwezig zijn in PEG-MAL-spectra, en één maleimide-arm, die een piek genereert bij 6,71 ppm (1). Het oplosmiddel, chloroform, genereerde een piek bij 7,26 ppm en restwater in dit monster genereerde een piek bij 2,2 ppm (gelabeld op spectra). In de MethMAL-spectra had de maleimidepiek een geïntegreerd gebied van 0,27 en de som van de methacrylamide-piekgebieden was 0,73 (0,37 + 0,36). De methacrylamide procentuele modificatie was 73% (0,73/(0,27 + 0,73)). Dit cijfer is van Pfaff et al.14. Auteursrecht (2021) American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. Microgel precursor gelation kinetica OPMERKING: De gelatatietijd kan worden gewijzigd door de pH van de buffer aan te passen die wordt gebruikt om de componenten van de gelprecursor op te lossen. Voor PEG-maleimidehydrogels komt een meer zure pH doorgaans overeen met een langzamere gelatatietijd, omdat de thiolaatconcentratie is verlaagd bij een lagere pH15. Bepaal vooraf de gewenste concentraties van polymeer, crosslinker en andere gelprecursorencomponenten (d.w.z. peptiden, glycosaminoglycanen). Los de PEG-MAL, RGD en MethMAL (PEG-backbone) op in 10x PBS (pH 1,5) en de MMP-2 crosslinker in 1x PBS (pH 7,4).OPMERKING: In dit protocol is de gelprecursoroplossing een gepubliceerde formulering3, die bestaat uit 45,88 mg / ml 4-arm PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg / ml RGD, 8,06 mg / ml MethMAL en 4, 62 mg / ml MMP-2 crosslinker (enzymatisch afbreekbare crosslinker). Bereid een viscometer of een gelijkwaardig instrument voor om opslag- en verliesmodulatie te bewaken met een spleetgrootte van 0,4 mm, een afschuifspanning van 1,0, een frequentie van 1,0 Hz en een duur van 10.800 s.Bevestig een 35 mm plaatrotor (P35/Ti) geometrie. Gebruik een bevochtigde kamer of een vochtige spons rond de geometrie om een bevochtigde omgeving te behouden. Meng de PEG-backbone en MMP-crosslinker in een volumetrische verhouding van 1:1. Pipetteer 400 μL van de gelprecursoroplossing op het midden van de viscometertrap. Verlaag de geometrie langzaam op het podium totdat deze de vooraf bepaalde spleetgrootte van 0,4 mm bereikt en begin onmiddellijk met het bewaken van opslag ( G’) en verlies (G”) moduli gedurende maximaal 6 uur bij kamertemperatuur.OPMERKING: Gelation wordt geacht te beginnen wanneer de opslagmodulus groter wordt dan de verliesmodulus en gelation wordt als voltooid beschouwd wanneer de opslagmodulus plateaus bereikt. Een representatieve gelation kinetics curve is weergegeven in figuur 2. Figuur 2: Representatieve curve van de gelation kinetica van een MAP gel precursor oplossing (pH 4,5) bepaald door een viscometer. Gelation begint bij de snelle toename van opslag (G’) modulus, en gelation voltooit wanneer de G’-curve plateaus bereikt. G” geeft de verliesmodulus aan. Dit cijfer is van Pruett et al.3. Copyright (2021) Wiley-VCH GmBH. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 3. Fabricage van microfluïdische apparaten OPMERKING: Dit protocol beschrijft de fabricage van een microfluïdisch stap-emulgeringsapparaatontwerp aangepast van de Rutte et al.13, dat te zien is in figuur 3A. Dit protocol kan echter worden gebruikt met elk apparaatontwerp dat in een SU-8-wafer is geëtst. Het wordt aanbevolen om de SU-8 silicium wafer master fabricage uit te besteden, tenzij de juiste cleanroom faciliteiten beschikbaar zijn voor fabricage. Maak het eerste polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische apparaat van een SU-8 wafer fotomasker.Bereid ~200 g PDMS door de basis en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 w/w te mengen (zie de tabel met materialen). Plaats de SU-8 wafer in een kweekschaal (plak de randen van de wafel op de schaal), met het microfluïdische ontwerp naar boven gericht. Giet PDMS in de schaal om een 1-1,5 cm dikke laag over de wafel te maken. Plaats de schaal onder vacuüm om eventuele bubbels te verwijderen. Laat het PDMS uitharden tot het gestold is (24 uur bij kamertemperatuur of ~2 uur bij 60 °C). Zodra het PDMS is uitgehard, gebruik je voorzichtig een scheermesje of een scalpel om een rechthoek door het PDMS te snijden, zodat er een marge van 0,5-1 cm rond het ontwerp op de wafer is.OPMERKING: Gebruik niet te veel druk en wees zeer voorzichtig om beschadiging (bijv. barsten, krassen) van de wafer te voorkomen. Wig een spatel in een van de sneden en schuif deze langs de sneden om het PDMS van de wafer te scheiden.OPMERKING: Als het PDMS zich van de wafer scheidt, begint zich een luchtbel te vormen onder het PDMS (zie figuur 3B). Gebruik de spatel om de rechthoek van PDMS voorzichtig uit de schaal te tillen.OPMERKING: De resulterende opening in het PDMS boven de wafer is de mal voor de microfluïdische apparaten. Maak volgende PDMS microfluïdische apparaten van het SU-8 wafer fotomasker.Bereid ~ 15-20 g PDMS per mal door de basis en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10: 1 te mengen. Giet PDMS in de rechthoekige opening in de mal om een 5 mm laag PDMS boven de wafer te creëren. Plaats de vorm onder vacuüm om eventuele bubbels te verwijderen. Laat het PDMS uitharden tot het volledig gestold is (24 uur bij kamertemperatuur of 2 uur bij 60 °C). Zodra het PDMS is uitgehard, gebruikt u een scheermesje of een scalpel om het PDMS rond de randen van de rechthoek te snijden.OPMERKING: Gebruik niet te veel druk en wees heel voorzichtig om beschadiging (d.w.z. scheuren) van de wafer te voorkomen. Wig een spatel in een van de sneden en schuif deze langs de sneden om het PDMS van de wafer te scheiden.OPMERKING: Als het PDMS zich van de wafer scheidt, begint zich een luchtbel te vormen onder het PDMS. Gebruik een biopsiepons van 1,5 mm om gaten te maken door de PDMS-rechthoek bij de twee inlaten en uitlaat (zie figuur 3B). Als er meerdere apparaten op een enkele wafer zijn, gebruik dan een spatel of scheermesje om het PDMS lichtjes tussen elk apparaat te scoren en vouw het PDMS vervolgens voorzichtig langs de gescoorde lijnen, zodat het PDMS vanzelf heel netjes scheidt. Bewaar de PDMS-apparaten in een stofvrije container. Bevestig de PDMS microfluïdische apparaten aan glazen dia’s.Bereid één glazen dia voor per PDMS-microfluïdisch apparaat. Gebruik tape, gefilterde lucht of wasbeurten (isopropylalcohol) om stof van de dia te verwijderen. Zorg ervoor dat de dia’s volledig droog zijn voordat u doorgaat naar de volgende stap. Plaats een glazen schuif en een PDMS-apparaat, ontwerpzijde naar boven, naast elkaar op een klein plastic bakje (een 96-well plaatdeksel werkt hiervoor goed) en plaats het in een plasmareiniger. Sluit de deur en de luchtstroomklep en zet de vacuümpomp aan. Laat het minstens 30 s lopen en schakel het dan uit. Sluit de gasbuis van de zuurstoftank aan op de luchtstroomklep. Laat de plasmakamer zich gedurende 30 s vullen met zuurstof, schakel vervolgens de zuurstof uit en sluit de luchtstroomklep. Zet de vacuümpomp aan en stel het niveau van de radiofrequentie (RF) in op hoog. Wacht tot de kamer een violetroze kleur krijgt (zie figuur 3B). Laat 30 s passeren. Wanneer de timer afgaat, schakelt u het plasma uit en stofzuigt u. Open vervolgens langzaam de luchtstroomklep om het vacuüm vrij te maken. Verwijder de lade uit de plasmareiniger. Draai het PDMS-apparaat voorzichtig op de glazen schuif om ze te verbinden. Let bij het verlijmen van het kleine verschil in de transparantie van het PDMS.OPMERKING: Voor het beste resultaat bewaart u de verlijmde apparaten bij 60 °C tot vlak voor gebruik. Oppervlaktebehandeling van de PDMS-microfluïdische apparatenBereid de oppervlaktebehandeling voor door PFOCTS (trichlooriso(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaan) te verdunnen in Novec-olie (1:50). Gebruik 1 ml voor 3-4 apparaten. Breng het volume over op een spuit van 1 ml en bevestig een naald van 25 g.OPMERKING: De naalden die in dit protocol worden gebruikt, zijn afgeschuind, dus wees voorzichtig bij het hanteren van scherpe voorwerpen. Stompe naalden kunnen ook worden gebruikt indien gewenst. Snijd een stuk Tygon-slang van 10-12 cm per apparaat dat wordt behandeld. Snijd een stuk PEEK-buis, ~7 cm lang. Steek een paar millimeter van de PEEK-buis in het uiteinde van de Tygon-buis, zoals weergegeven in figuur 4A, om te voorkomen dat de naald de Tygon-buisinlaten doorboort. Haal het(de) apparaat(en) uit de verwarmde kamer en steek het niet-PEEK-uiteinde van de Tygon-buis in het waterige inlaatgat. Steek de naald van de oppervlaktebehandelingsspuit in de PEEK-slang en bedek het uitlaatgat van de oliekamer (zie figuur 3B). Injecteer de behandeling langzaam in het apparaat en zorg ervoor dat het het apparaat vult, zonder bubbels. Wacht tot eerst de waterige kamers zijn gevuld, gevolgd door de kleinere kanalen en vervolgens de oliekamer. Verwijder de Tygon-buis van het apparaat. Zodra het apparaat is gevuld, laat u het 10 minuten rusten op kamertemperatuur. Vul een spuit van 5 ml alleen met olie (geen silaan) en bevestig een naald van 25 g. Haal de oppervlaktebehandeling uit het apparaat via de in- en uitlaat. Steek tygonbuizen in de waterige inlaat, steek de spuit met olie in de PEEK-slang en spoel elk apparaat met olie. Haal de olie uit het apparaat. Herhaal de oliespoeling nog 2x. Verwijder de Tygon-buis.OPMERKING: Het apparaat is klaar voor gebruik. Figuur 3: Microfluïdisch PDMS-apparaat. (A) AutoCAD-tekening (Computer-assisted design) van het ontwerp van microfluïdische apparaten. Microgelduppletvorming vindt plaats in de kanalen aan weerszijden van het oliekanaal, zoals te zien is in de vergrote uitstulping. (B) Overzicht van de fabricage van PDMS-apparaten. Afkorting: PDMS = polydimethylsiloxaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 4. Microfluïdische generatie van microgels Bepaal vooraf de gewenste concentraties van polymeer, crosslinker en andere gelprecursorencomponenten (d.w.z. peptiden, glycosaminoglycanen). Los de PEG-MAL, RGD en MethMAL (PEG-backbone) op in 10x PBS (pH 1,5) en de MMP-2 crosslinker samen met 5 μM biotine-maleimide in 1x PBS (pH 7,4).OPMERKING: In dit protocol is de gelprecursoroplossing een gepubliceerde formulering3 bestaande uit 45,88 mg / ml 4-arm PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg / ml RGD, 8,06 mg / ml MethMAL en 4, 62 mg / ml MMP-2 crosslinker (enzymatisch afbreekbare crosslinker). De onderstaande methoden leveren ~ 3 ml microgels op. Bereid 6 ml oppervlakteactieve oplossing door de bouillon 5% FluoroSurfactant te verdunnen tot ten minste 1% in Novec-olie. Voeg deze oplossing toe aan een spuit van 10 ml.OPMERKING: Gefluoreerde oppervlakteactieve stof is niet mengbaar met water, waardoor het gemakkelijk kan worden verwijderd tijdens de gelovergang naar de waterige fase tijdens de PBS-wasbeurten in de zuiveringsstap. Snijd drie stukken Tygon-slangen die een geschikte lengte hebben voor de pomphoogte van de spuit. Snijd twee stukken PEEK-buizen, ~ 1 inch lang. Steek een paar millimeter van de PEEK-buis in het uiteinde van twee stukken Tygon-buis, zoals weergegeven in figuur 4A, om te voorkomen dat de naald de Tygon-buisinlaten doorboort. Steek het niet-PEEK-uiteinde van de Tygon-buis in de inlaten van de microfluïdische apparaten. Steek het resterende stuk Tygon-buis (zonder PEEK-buis aan het uiteinde) in de uitgang van het microfluïdische apparaat, zoals weergegeven in figuur 4C. Voeg ten minste 3 ml olie toe aan een plastic spuit van 5 ml en bevestig deze aan een naald van 25 g. Steek de naald voorzichtig in de PEEK-buis op een van de Tygon-inlaten. Spoel de slang en het apparaat voorzichtig door met olie. Verzamel de olie uit de uitlaat in een conische buis. Herhaal de oliespoeling op de andere Tygon-inlaat. Stel de spuitpompen in op de gewenste stroomsnelheden.OPMERKING: Dit protocol gebruikt 3 ml / h voor het waterige debiet en 6 ml / h voor het oliedebiet. Het kan nodig zijn om twee afzonderlijke spuitpompen te gebruiken. Sluit de spuit met de oppervlakteactieve stof aan op de olie-inlaat via een naald van 25 G (zie figuur 4A) en doseer voorzichtig voldoende olie om de slang en het oliekanaal van het microfluïdische apparaat te primen. Zodra het apparaat en de olie-inlaten zijn ingesteld, voegt u 0,5 ml olie toe aan een nieuwe spuit van 5 ml, die de gelvoorloper zal bevatten. Het doel van deze kleine hoeveelheid olie is om de precursoroplossing tegen het einde van de run door het microfuilidische apparaat te spoelen. Combineer in een conische buis 1,5 ml van de PEG-backbone-oplossing en 1,5 ml van de crosslinker-oplossing. Vortex gedurende 30 s en breng de gecombineerde gelprecursoroplossing snel over naar de spuit van 5 ml. Verbind de spuit met de gelprecursoroplossing met de waterige inlaat via een naald van 25 G. Doseer voorzichtig voldoende oplossing om de slang en het waterige kanaal te primen. Klem de spuiten op de respectievelijke spuitpompen en druk op run (zie figuur 4B). Zorg ervoor dat er vloeistof door zowel de waterige als de oliekanalen stroomt.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een microscoop te gebruiken om microgelvorming in het PDMS-apparaat te visualiseren. Zoek naar deeltjes van uniforme grootte uit de kanalen (zie figuur 4D). Verzamel de microgels uit de uitlaat in een conische buis. Figuur 4: Microfluïdische opstelling. (A) Weergave van de methode voor het aansluiten van PEEK-buizen (boven) en Tygon-buizen op een naald van 25 G op een spuit (onder). (B) Microfluïdische opstelling met spuitpompen, slangen, apparaat en microscoop. (C) Afbeelding van microfluïdische apparaatopstelling, met twee inlaten (waterig en olie) en één uitlaat. (D) Schematische weergave van het microfluïdische apparaat en representatief brightfield-beeld van de verwachte microgelvorming uit de kanalen in een stapemulgeringsapparaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 5. Zuivering en sterilisatie van microgels Zodra de gelation is voltooid (bepaald als tijd tot opslag modulus plateau in gelation kinetics karakterisatie), gebruik een pipet om de oliefase voorzichtig van de bodem van de buis te verwijderen (zie figuur 5). Deponeer dit in een geschikte afvalcontainer voor gefluoreerd afval.OPMERKING: De gelatatietijd kan worden versneld door een organisch oplosbare base aan de verzamelbuis toe te voegen (bijv. Triethylamine), maar het is belangrijk op te merken dat de toevoeging van een sterke base niet-gereageerde maleimides kan hydrolyseren. Als het gewenst is om microgels te functionaliseren door overtollige maleimides post gelation, sla dan de toevoeging van triethylamine over. Voeg meer olie toe aan de microgel-opvangbuis in een verhouding van 1:1. Meng door de opvangbuis voorzichtig om te keren. Draai niet vortex. Laat de opvangbuis ~5 min bezinken om de fasen te laten scheiden. Zoek naar de oliefase aan de onderkant en de waterige fase (de microgels) aan de bovenkant (zie figuur 5). Herhaal de oliewasbeurten minstens 2x meer. Voeg meer olie toe in een verhouding van 1:1 met de gel en voeg 1x PBS toe in een 4:1 PBS/gel verhouding. Keer om om meerdere keren te mixen. Om de lagen te scheiden, centrifugeert u de buis op ~ 2.000 x g gedurende ~ 30 s. Zoek naar de oliefase aan de onderkant van de buis, gel in het midden en PBS bovenaan (zie figuur 5). Verwijder de oliefase met een pipet en gooi deze weg in een afvalcontainer.OPMERKING: Verwijder de PBS niet. Gebruik een grotere conische buis om door te gaan met wassen als de oorspronkelijke verzamelbuis 15 ml was. Herhaal olie en PBS wast 2x meer. Zoek naar de gel om over te gaan van ondoorzichtig naar helder door de laatste wasbeurt, zoals weergegeven in figuur 5, wat aangeeft dat de oppervlakteactieve stof is verwijderd en de gel zich in de PBS-fase bevindt. Verwijder alle olie. Verwijder PBS niet uit de conische buis. Gebruik in een chemische zuurkast een glazen pipet om hexanen aan de buis toe te voegen op een gelijk volume als de PBS. Vortex de conische buis gedurende 30 s of totdat grondig gemengd. Centrifugeer bij 4.696 x g gedurende 5 min. Zoek na scheiding naar hexanen in de bovenste laag, PBS in het midden en gel aan de onderkant (zie figuur 5). Verwijder de hexaanlaag en gooi deze weg in een container voor organisch afval. Aspirateer de PBS. Herhaal hexaan en PBS wast minstens 2x meer of totdat de gel bijna doorschijnend lijkt (zie figuur 5). Was de gel met PBS 1x meer zodat eventuele resterende hexanen worden verwijderd. Centrifugeer bij 4.696 x g gedurende 5 min. Aspirateer de PBS-laag. Zorg ervoor dat u de gelkorrel niet verstoort.Om niet-gereageerde maleimiden in de microgels te doppen of te doven, bereidt u een 100 mM-oplossing van N-acetyl-L-cysteïne in 1x PBS en voegt u deze oplossing toe aan de gel. Plaats op een buisrotator bij 37 °C ‘s nachts, gevolgd door vele wasbeurten met PBS om niet-gereageerde N-acetyl-L-cysteïne te verwijderen. Voor langdurige opslag (tot 1 jaar), resuspenseer de microgels in 70% IPA en bewaar bij 4 °C om de groei van bacteriën op de microgels te helpen voorkomen. Om de microgels te steriliseren, voegt u 70% IPA toe aan de gel in een verhouding van 4:1 v/v in een bioveiligheidskap. Vortex de buis gedurende 30 s, centrifugeer vervolgens bij 4.696 × g gedurende 5 minuten. Aspirateer het IPA-supernatant uit de gelkorrel in een bioveiligheidskap. Voer 2x meer IPA wasbeurten uit gevolgd door 3x wasbeurten met steriele 1x PBS.OPMERKING: Alle IPA moet worden verwijderd voordat u de gel met cellen of dieren gebruikt. Figuur 5: Overzicht van de microgel zuiveringsprocedure. Afkortingen: PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; IPA = isopropylalcohol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 6. Microgel grootte karakterisering OPMERKING: Het wordt aanbevolen om microgeldeeltjes ‘s nachts in 1x PBS bij 37 °C te laten opzwellen tot hun uiteindelijke diameter voordat ze worden gedimensioneerd. Beeldgeldeeltjes.Draai de MAP-gel op 4.696 × g gedurende 5 minuten en adem het supernatant op. Verwijder met behulp van een verdringerpipet 5 μL microgels uit de gelkorrel en verdun in 1 ml PBS in een microcentrifugebuis (1:200 verdunning). Pas deze verdunning indien nodig aan.OPMERKING: Tijdens de formulering van de gelprecursoroplossing kan 5 μM biotine-maleimide worden toegevoegd en gebruikt als alternatief voor het labelen van microgels met een fluorofoor. In dit geval kan een streptavidin-fluorofoor worden toegevoegd bij een verdunning van 1:300 (van 1 mg / ml bouillon). Laat incubatie met streptavidin gedurende ten minste 15 minuten voorafgaand aan de beeldvorming. Breng met behulp van een pipet met positieve verplaatsing 100 μL van de verdunde microgels over naar de putjes van een heldere 96-wellsplaat. Gebruik een widefield of confocale microscoop om de microgels te visualiseren met een 10x objectief. Verkrijg afbeeldingen van de microgels voor analyse. Zie figuur 6 voor representatieve confocale afbeeldingen van microgels. Deeltjes dimensioneren met ImageJOpen de afbeeldingsbestanden van de microscoop in ImageJ. Selecteer | analyseren Stel Schaal in en stel de afbeeldingsschaal in volgens het microscoopdoel. Selecteer afbeelding | Type | 8-bits. Selecteer afbeeldings- | | aanpassen Drempel en selecteer vervolgens de optie “Otsu” automatische drempel in de vervolgkeuzelijst. Klik op | analyseren Stel metingen in en selecteer Feret’s Diameter en beperk tot drempel. Klik op | analyseren Analyseer deeltjes en voer het gebiedsgroottebereik (in pixel ^ 2) in dat wordt verwacht voor de microgels (om kleine resten uit te sluiten van analyse). Wijzig circulariteit in 0,75-1,00 en selecteer | weergeven Contouren. Controleer Weergaveresultaten en Uitsluiten op randen.OPMERKING: Het circulariteitsvormfilter sluit microgels op de afbeeldingsrand uit die een onnauwkeurige diametermeting kunnen opleveren. Voer de module Deeltjes analyseren uit . Wacht op de uitvoer, de diameter van de Feret van elk deeltje, en exporteer deze resultaten naar een spreadsheet. Bereken in dit protocol de polydispersiteitsindex (PDI) om de heterogeniteit in microgelgrootte te bepalen. Analyseer ten minste 100 microgels om een populatie te definiëren: een PDI-bereik van 1,00-1,05 definieert een monodisperse populatie en een PDI groter dan 1,05 definieert een polydisperse populatie. Gebruik vergelijking (2), vergelijking (3) en vergelijking (4) om de PDI te berekenen, zoals hieronder beschreven. (2) (3) (4) Figuur 6: Representatieve beelden van microgels. (A) Fluorescerend confocaal beeld van microgelpopulatie A, (B) afbeelding van gedrempelde microgels en (C) deeltjescontouren na ImageJ-analyse. (D) Fluorescerend confocale afbeelding van microgelpopulatie B en (E) doorgelaten lichtbeeld van microgels (microgels zijn bijna doorschijnend). (F) Weergave van representatieve resultaten van de ImageJ-analyse die in dit protocol wordt beschreven. Beide microgelpopulaties hebben relatief monodisperse PDI’s. Beide populaties microgels werden gesynthetiseerd met een waterig debiet van 3 ml / h en een oliedebiet van 6 ml / h. Het verschil in microgelgrootte is echter te wijten aan verschillen in de stapgrootte van het microfluïdische apparaat. Microgelpopulatie A werd bijvoorbeeld gesynthetiseerd met een microfluïdisch apparaat met een kanaalstapgrootte van 11 μm, en microgelpopulatie B werd gesynthetiseerd in een apparaat met een stapgrootte van 40 μm. Schaalstaven = 100 μm. Afkorting: PDI = polydispersity index. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 7. Microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) steigergloeien Maak een stamoplossing van 2 mM lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) in 1x PBS (pH 7,4). Verdun de LAP-stamoplossing tot 0,2 mM in een volume van 1x PBS gelijk aan het gelvolume. Als u de LAP-foto-initiator gebruikt voor celstudies of dierstudies, zorg er dan voor dat u de oplossing voor gebruik steriliseert. Draai de MAP-gel op 4.696 × g gedurende 5 minuten en adem het supernatant op. Breng met behulp van een verdringerpipet het gewenste volume gel over in een microcentrifugebuis. Voeg 0,2 mM LAP toe aan de gel in een volumetrische verhouding van 1:1 (de uiteindelijke LAP-concentratie is 0,1 mM). Vortex het mengsel en incubeer gedurende ten minste 15 minuten in het donker. Centrifugeer het mengsel op 18.000 × g gedurende 5 minuten om de gel te pelleteren. Verwijder het supernatant voorzichtig uit de gelkorrel. Breng de MAP-gel over naar de doellocatie met een pipet met positieve verplaatsing. Breng gericht licht (365 nm, 8,66 mW/cm2) aan op het monster gedurende 113 s om de steiger te gloeien.OPMERKING: De gloeitijd van 113 s is geoptimaliseerd zoals eerder gepubliceerd voor LAP-concentratie van 0,1 mM14, maar aanvullende optimalisatie voor verschillende foto-initiatorconcentraties kan nodig zijn. Figuur 7: MAP steigergloeien. (A) Schema van MAP steigergloeien. Bij blootstelling aan een foto-initiator en licht ondergaan de functionele groepen van methacrylamide op het MethMAL-macromeer een klikfotopolymerisatiereactie, die de oppervlakken van de microgels aan elkaar bindt. (B) Weergave van een 3D-rendering (Imaris) van een microscoopafbeelding met twee fotonen van MAP-microgels (groen) samen gegloeid in een 3D-puckvorm, met dextran (rood) in de poriën. (C) Weergave van een 3D-rendering (Imaris) van een microscoopafbeelding met twee fotonen die de porositeit toont van een MAP-steiger die is doordrenkt met fluorescerende 70 kDa dextran (rood). Schaalstaven = (B) 100 μm, (C) 70 μm. Afkortingen: MAP = microporeus gegloeid deeltje; MethMAL = aangepast gloeien macromeer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.