توليف الموائع الدقيقة لكتل بناء Microgel لسقالة الجسيمات الملدنة المسامية الدقيقة
Summary
يصف هذا البروتوكول مجموعة من الطرق لتوليف لبنات بناء microgel لسقالات الجسيمات الملدنة المسامية الدقيقة ، والتي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من تطبيقات الطب التجديدي.
Abstract
منصة سقالة الجسيمات المصلبة المسامية الدقيقة (MAP) هي فئة فرعية من الهلاميات المائية الحبيبية. وهو يتألف من ملاط قابل للحقن من المواد الهلامية الدقيقة التي يمكن أن تشكل سقالة مستقرة هيكليا مع مسامية على نطاق الخلية في الموقع بعد خطوة ربط كيميائية ثانوية قائمة على الضوء (أي التلدين). أظهرت سقالة MAP نجاحا في مجموعة متنوعة من تطبيقات الطب التجديدي ، بما في ذلك التئام الجروح الجلدية ، وتكبير الطية الصوتية ، وتوصيل الخلايا الجذعية. تصف هذه الورقة طرق توليف وتوصيف المواد الهلامية الدقيقة متعددة (الإيثيلين جلايكول) (PEG) باعتبارها اللبنات الأساسية لتشكيل سقالة MAP. وتشمل هذه الطرق تخليق ماكرومر التلدين المخصص (MethMAL) ، وتحديد حركيات هلام السلائف الدقيقة ، وتصنيع جهاز الموائع الدقيقة ، وتوليد الموائع الدقيقة من microgels ، وتنقية microgel ، وتوصيف السقالة الأساسية ، بما في ذلك تحجيم microgel وتلدين السقالة. على وجه التحديد ، يمكن لطرق الموائع الدقيقة عالية الإنتاجية الموضحة هنا إنتاج كميات كبيرة من المواد الهلامية الدقيقة التي يمكن استخدامها لتوليد سقالات MAP لأي تطبيق مرغوب فيه ، خاصة في مجال الطب التجديدي.
Introduction
منصة سقالة MAP هي مادة حيوية قابلة للحقن تتكون بالكامل من جسيمات هيدروجيل دقيقة (microgels) توفر المسامية الدقيقة على نطاق الخلية عند تقاطعها معا ، مما يسمح بهجرة الخلايا المستقلة عن التدهور وتكامل الأنسجة السائبة1. نظرا لقدرتها على الاندماج بسرعة مع الأنسجة المضيفة وانخفاض المناعة بطبيعتها ، فقد أثبتت منصة سقالة MAP قابلية التطبيق قبل السريري لمجموعة واسعة من علاجات الطب التجديدي2،3،4،5،6،7،8،9،10 ، بما في ذلك تسريع التئام الجروح الجلدية 1،3 ، 11 ، إعادة توعي تجويف السكتة الدماغيةالدماغية 7 ، وتقديم الخلايا الجذعية الوسيطة2 ، وتوفير تضخيم الأنسجة لعلاج القصور6. وقد ثبت أيضا أن MAP ينقل التأثيرات المضادة للالتهابات إلى الأنسجة المضيفة من خلال توظيف البلاعم M23 ويمكن حتى ضبطها لتعزيز الاستجابة المناعية ل Th2 “إصلاح الأنسجة”8. هذه الخصائص المواتية لمنصة سقالة MAP تسمح بتوسيعها إلى مجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية.
شملت الطرق المنشورة سابقا لتوليد الهلاميات الدقيقة لتشكيل سقالة MAP قطرات التركيز على التدفق1،4،7،9 ، والرش الكهربائي5،12 ، والغزل العلوي مع مستحلب دفعة6،10. يمكن أن تنتج طريقة الموائع الدقيقة للقطرات جزيئات ذات تشتت أحادي مرتفع ولكنها تستخدم معدلات تدفق بطيئة للغاية تنتج غلات منخفضة من الجسيمات (μL / h). بدلا من ذلك ، يمكن أن تنتج طرق الرش الكهربائي ومستحلب الدفعات كمية كبيرة من الجسيمات ، ولكن مع تعدد الجسيمات العالي. يستخدم هذا البروتوكول طريقة الموائع الدقيقة عالية الإنتاجية لإنتاج المواد الهلامية الدقيقة مع مجموعة أحادية التشتت ، استنادا إلى عمل de Rutte et al13. تستخدم هذه الطريقة تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة لصنع جهاز الموائع الدقيقة متعدد الميثيل سيلوكسان (PDMS) من قناع ضوئي ، والذي يتم ربطه بعد ذلك بشريحة زجاجية. يعتمد تصميم الجهاز على الاستحلاب التدريجي لتوليد كمية كبيرة من جزيئات الميكروجيل (مل / ساعة). يوفر التشتت الأحادي الذي يمكن تحقيقه باستخدام هذه الطريقة تحكما فائقا في المسامية مقارنة بالتقنيات الأخرى ، حيث يمكن أن تشكل الهلاميات الدقيقة أحادية التشتت سقالات بأحجام مسام أكثر اتساقا2.
تم تحديد طرق توليف وتوصيف الهلاميات الدقيقة الفردية التي يمكن أن تكون بمثابة لبنات بناء لسقالات MAP في هذه المخطوطة ، وتحديدا من حيث إنشاء microgels التي تتكون من العمود الفقري PEG مع مجموعة ماليميد (MAL) ، والتي تشارك بسهولة في إضافة فعالة من نوع مايكل مع روابط متقاطعة وظيفية من الثيول لجيلات الدقيقة. لفصل هلام الميكروجيل عن تلدين سقالة MAP ، تصف هذه المخطوطة أيضا كيفية توليف14 ماكرومر تلدين مخصص منشور ، MethMAL ، وهو ميثاكريلاميد / ماليميد غير متجانس الوظائف 4-arm PEG macromer. وتشارك المجموعات الوظيفية للميثاكريلاميد بسهولة في البلمرة الضوئية القائمة على الجذور الحرة (للتلدين الهلامي الدقيق)، بينما تظل خاملة نسبيا للظروف التي تشجع على إضافة نوع مايكل للمجموعات الوظيفية لجيش تحرير ليبريا.
بالإضافة إلى ذلك ، تحدد هذه المخطوطة بروتوكولات إنشاء أجهزة الموائع الدقيقة PDMS ، وتحديد حركيات الهلام المجهري ، وتوصيف حجم microgel. يفصل الجزء الأخير من المخطوطة تلدين سقالة MAP ، وهو عندما يتم نقل الهلاميات الدقيقة في الموقع إلى سقالة سائبة من خلال خطوة ربط متقاطعة ثانوية بدأتها الصور تربط تساهميا أسطح الهلاميات الدقيقة معا. من المهم ملاحظة أن هناك طرق تلدين أخرى يمكن تنفيذها في أنظمة سقالات MAP التي لا تعتمد على الكيميائيات القائمة على الضوء ، مثل التلدين بوساطة الإنزيم ، كما هو موضح سابقا1. بشكل عام ، يمكن استخدام هذه الطرق مباشرة أو استخدامها مع كيمياء صياغة هيدروجيل مختلفة (على سبيل المثال ، تعتمد على حمض الهيالورونيك) لإنشاء سقالات MAP لأي تطبيق.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طرق توليف وتوصيف المواد الهلامية الدقيقة ، والتي تعمل بمثابة لبنات بناء لسقالات الجسيمات الملدنة المسامية الدقيقة (MAP). يستخدم هذا البروتوكول نهج الموائع الدقيقة عالي الإنتاجية لتوليد كميات كبيرة من الهلاميات الدقيقة الموحدة ، والتي لا يمكن تحقيقها بطرق أخرى مثل الموائع الدقيقة التي تركز على التدفق1،4،7،9 (أحادية عالية ، منخفضة الغلة) ، مستحلب دفعة6،10 ، والرش الكهربائي5،12 (انخفاض أحادية التشتت ، غلة عالية). باستخدام الطرق الموضحة هنا ، يمكن صنع microgels monodisperse للاستخدام في سقالات MAP التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من تطبيقات الطب التجديدي (على سبيل المثال ، توصيل الخلايا ، التئام الجروح).
الخطوة الحاسمة لهذا البروتوكول هي إنشاء أجهزة PDMS microfluidic. إذا لم يتم تصنيع الأجهزة بشكل صحيح ، فقد يكون لذلك آثار سلبية في اتجاه مجرى النهر على تكوين microgel والتشتت الأحادي. من المهم منع إدخال القطع الأثرية (أي الفقاعات والغبار) في PDMS قبل أن يشفى ، لأن هذا يمكن أن يسد القنوات ويؤثر بشكل كبير على تكوين microgel. للتخفيف من هذا قدر الإمكان ، يجب على المرء استخدام الشريط لإزالة أي غبار ، وتخزين الأجهزة في حاوية خالية من الغبار ، والعمل في غطاء خال من الغبار ، إن أمكن. يوصى أيضا بتخزين الأجهزة عند 60 درجة مئوية للحصول على أفضل النتائج مع المعالجة السطحية.
عند صب أجهزة PDMS ، من المهم الحفاظ على سمك موحد يساوي أو يقل عن طول لكمة الخزعة. إذا كان الجهاز سميكا جدا ، فلن تتمكن لكمة الخزعة من الاختراق طوال الطريق. من المهم أيضا عدم تمزيق مداخل / مخرج جهاز PDMS أثناء اللكم باستخدام لكمة الخزعة و / أو إدخال الأنابيب. سيؤدي تمزق جهاز PDMS إلى تسرب من المداخل / المخرج ، مما قد يتسبب في فقدان محلول السلائف الهلامية. إذا كان هناك تسرب في جهاز PDMS ، فإن أفضل حل هو استبداله بجهاز جديد في أسرع وقت ممكن.
عند معالجة الجهاز بالبلازما ، أدى استخدام الأكسجين النقي ومعالجة البلازما لمدة 30 ثانية إلى أفضل النتائج للصق PDMS بالشريحة الزجاجية. إذا لم يرتبط الجهاز بشكل صحيح (أي أنه لا يزال من الممكن رفع PDMS من الشريحة الزجاجية بعد معالجة البلازما) ، فيجب على المرء التحقق مرة أخرى من أن معالج البلازما يعمل بشكل صحيح وأن الجهاز والشرائح قد تم تنظيفها جيدا. من المهم أيضا استخدام المعالجة السطحية السيلان الصحيحة ، وللحصول على أفضل النتائج ، يجب معالجة أجهزة PDMS السطحية مباشرة قبل الاستخدام. ويمكن أيضا استخدام طرق أخرى للمعالجة السطحية، مثل ترسب البخار الكيميائي.
خطوة أخرى حاسمة هي استخدام أجهزة PDMS microfluidic بشكل صحيح لتشكيل microgel. يوصى باستخدام نسبة معدل تدفق لا تقل عن 2: 1 (يستخدم هذا البروتوكول معدل تدفق زيت 6 مل / ساعة ومعدل تدفق مائي 3 مل / ساعة) ، ولكن يمكن ضبط ذلك لتحقيق حجم microgel المطلوب. الرقم الهيدروجيني لمحلول سلائف microgel هو أيضا مقياس مهم لتحسين لمنع انسداد الجهاز. تعمل المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) على تسريع تكوين الثيولات في كيمياء الإضافة من نوع مايكل ، وتؤدي تركيزات PBS المستخدمة في هذا البروتوكول إلى أفضل النتائج لجل الميكروجيل في أجهزة الموائع الدقيقة. بمجرد بدء تشغيل مضخات المحاقن ، قد يكون هناك بعض الفقاعات في قنوات الموائع الدقيقة ، ولكن يجب أن يتوازن هذا بعد بضع دقائق. يوصى بمراقبة تكوين microgel باستخدام المجهر. إذا كان التدفق لا يبدو مشابها كما في هذا الفيديو و / أو كان هناك عدد قليل من القنوات التي تنتج جزيئات كبيرة ، فمن المحتمل أن يكون هذا بسبب مشكلات في خطوة المعالجة السطحية. أفضل حل هو استبدال الجهاز بجهاز تمت معالجته حديثا على السطح.
إذا بدا أن المواد الهلامية الدقيقة تتلاحم ، فقد يرجع ذلك إلى عدم كفاية تركيز FluoroSurfactant. الحل الموصى به هو زيادة الوزن ٪ من الفاعل بالسطح في مرحلة النفط. ومع ذلك ، فإن أحد القيود المفروضة على استخدام تركيزات عالية من الفاعل بالسطح هو أنه قد يكون من الصعب إزالته أثناء خطوة التنقية. يوصى باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة مرة واحدة فقط ، ولكن يمكن إعادة استخدام الأجهزة إذا تم غسلها بزيت Novec مباشرة بعد الاستخدام لإزالة أي محلول مائي يمكن أن يهلام في الجهاز ويسد القنوات. في حين أن أحد أجهزة الموائع الدقيقة يمكن أن ينتج حجما عالي الإنتاجية من المواد الهلامية الدقيقة (مل / ساعة) ، يمكن قياس معدل الإنتاج هذا باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة المتعددة بالتوازي.
تعتمد خطوة التلدين لتجميع سقالة MAP على استخدام بادئ ضوئي منشط بالضوء للبلمرة الجذرية ، ويمكن اختيار البادئ الضوئي بناء على التطبيق المطلوب. على سبيل المثال ، لدى LAP photoinitiator أوقات تلدين سريعة (<30 ثانية) عند استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية طويل الموجة ، والذي له تأثير ضئيل على صلاحية الخلية في المختبر14. ومع ذلك ، يتم امتصاص هذا الطول الموجي بشكل كبير بواسطة الأنسجة16 وقد لا يكون له فعالية تلدين عالية في الجسم الحي كما هو الحال في المختبر.
Eosin Y هو بادئ ضوئي آخر يتم تنشيطه بواسطة أطوال موجية مرئية (505 نانومتر) وله اختراق أعمق في الأنسجة ، مما يعزز قدرة سقالة MAP على التلدين تحت الأنسجة. ومع ذلك ، فإن أوقات التعرض الطويلة للضوء اللازمة لتلدين Eosin Y قد تطيل من تعرض الخلايا للجذور الحرة وتؤثر على بقاء الخلايا في المختبر14. إن استخدام هذه الأساليب لتوليد عالي الإنتاجية من لبنات بناء microgel موحدة للغاية سيسرع البحث الذي يركز على سقالات MAP ويتقدم المعرفة في مجال المواد المسامية القابلة للحقن للطب التجديدي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم لجو دي روته ومختبر دي كارلو في جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، لمساعدتهم في تصميم جهاز الموائع الدقيقة الأصلي الذي تم تطوير الجهاز المبلغ عنه منه ، بالإضافة إلى إرشادهم المبكر في تصنيع جهاز PDMS واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. تم إنشاء مخططات الشكل باستخدام Biorender.com.
Materials
| 2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
| 35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
| 4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
| 4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
| Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
| Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
| Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
| Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
| DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
| Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
| FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
| HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
| ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
| KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
| LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
| Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
| Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
| MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
| Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
| Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
| Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
| Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
| PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
| Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
| Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
| Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
| Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
| Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
| Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
| Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |
References
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1801046 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Pruett, L., et al. Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation. Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advanced Materials. 29 (32), (2017).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Schaeffer, C., et al. Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration. Annals of Plastic Surgery. 84, 446-450 (2020).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Jivan, F., Alge, D. L. Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering. Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148 (2020).
- de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomaterials. 101, 199-206 (2016).
- Sandell, J. L., Zhu, T. C. A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT. Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).
