Mevcut protokol, dokuların sert, kalın veya katmanlı doğası nedeniyle iç yapısal gözlemlere hazırlanması zor olan pirinç sürgünleri için bir temizleme tekniğini tanımlamaktadır. Bu yöntem, yetişkin pirinç bitkilerinde bile sürekli ve derin floresan gözlemlerini kolaylaştırır.
Kırılma indisi uyumsuzluklarını ortadan kaldıran ve otomatik floresan malzemeyi azaltan yakın zamanda geliştirilen temizleme teknolojisi, bitki dokularının iç yapılarını korurken üç boyutlu (3D) olarak gözlemlenmesini mümkün kılmıştır. Monokot model bir bitki ve küresel olarak önemli bir ürün olan pirinçte (Oryza sativa L.), kökler ve yapraklar gibi gözlemlenmesi nispeten kolay organlarda temizleme teknolojisi bildirilmiştir. Sürgün apikal meristemi (SAM) ve saplarında temizleme teknolojisinin uygulamaları da bildirilmiştir, ancak bu dokulardaki temizleme çözeltisinin (CS) zayıf penetrasyonu nedeniyle yalnızca sınırlı bir dereceye kadar. Bu dokulardaki temizleme çözeltilerinin sınırlı etkinliği, vasküler demetler ve epidermis geliştikçe ve SAM’ın su itici yapraklarla katmanlaşmasıyla gövdedeki dokuların otomatik floresansı, kalınlaşması ve sertleşmesine bağlanmıştır. Mevcut protokol, SAM / genç salkımdan gelişim sırasında sürgünlerin tabanına kadar gen ekspresyonunun sürekli ve 3D gözlemi için bir temizleme yaklaşımının optimizasyonunu bildirmektedir. Bir floresan protein raporlayıcısını ifade eden sabit doku örnekleri, titreşimli bir mikro dilimleyici kullanılarak bölümlere ayrıldı. Uygun bir kalınlık elde edildiğinde CS uygulandı. Özellikle merkezi dokuyu hedef alarak, CS’nin penetrasyon hızı ve homojenliği arttı ve dokuyu şeffaf hale getirmek için gereken süre azaldı. Ek olarak, kesilmiş bölümlerin temizlenmesi, tüm çekimin iç yapısının makro bir perspektiften gözlemlenmesini sağladı. Bu yöntem, temizlenmesi zor olan diğer bitki türlerinin dokularının derin görüntülenmesinde potansiyel uygulamalara sahiptir.
Son zamanlarda geliştirilen temizleme teknolojisi, bitkilerin iç yapılarını korurken derin dokularını gözlemlemeyi mümkün kılmıştır 1,2,3. Dikot model bitki Arabidopsis’te, kırılma indisi uyumsuzluklarını ortadan kaldırmak ve otomatik floresan malzemeleri gidermek için temizleme teknolojisi kullanılarak floresan protein görüntüleme üzerine birçok çalışma yapılmıştır 4,5,6. Hücresel çözünürlük 9’da temizleme teknolojisi7,8 ve 3D görüntülemenin kullanımı, monokot model bir bitki ve küresel olarak önemli bir ürün olan pirinçte (Oryza sativa L.) bildirilmiş olmasına rağmen, bunlar gözlemlenmesi kolay olan kökler, yapraklar ve sürgün apikal meristemi (SAM) gibi nispeten ince ve yumuşak organlarla sınırlıdır.
Sürgün, vasküler bitkilerin yer üstü kısımlarını oluşturan ana organdır. Pirinçte, sürgünler aksiller tomurcuklar, yapraklar ve gövde10’dan oluşan bir dizi dikey olarak istiflenmiş “fitomer” den oluşur. Çekimin ucunda, SAM merkezdeki farklılaşmamış kök hücrelerden oluşur. Fitomerler, SAM’den türetilen hücrelerin farklılaşmasıyla oluşur. Bitkiler vejetatiften üreme fazına geçtikten sonra, pirinç sapları uzar ve SAM genç salkımlara farklılaşır10. Bu gelişimsel değişime, saplardaki çeşitli genlerin ekspresyonunda ve SAM / genç salkımlarda dalgalanmalar eşlik eder. Çeşitli dokularda hücre farklılaşmasının altında yatan mekanizmaları anlamak için, iç sürgün dokularındaki hücre morfolojisini ve gen ekspresyonunu yapısal olarak gözlemlemek önemlidir. Bununla birlikte, sürgündeki sapların (düğümler ve internodlar) derin görüntülenmesi, dokuya nüfuz etmek için temizleme çözeltilerinin verimsizliği nedeniyle bir zorluk teşkil etmektedir. Saplar, SAM’dan farklılaştıktan sonra yanal büyümeden hemen hızlı bir hacim artışına uğrar. Vasküler demetlerin kalınlaşması ve nodal vasküler anastomozun yatay kompleks bağlantısı nedeniyle pirinç düğümü dokularının sertleşmesi, pirinç sürgünlerinin yüksek iticiliğine ek olarak, CS’nin sap10’daki penetrasyonunu sınırlamaya katkıda bulunur.
Bu çalışmada pirinç filizi dokularındaki gen ekspresyonundaki değişiklikleri yapısal derin floresan tekniği kullanılarak gözlemlemek amaçlanmıştır. Bu çalışma, pirincin konfokal lazer mikroskobu kullanarak SAM / genç salkımdan tabana gen ekspresyonunu düz bir yüzey yerine 3D bir yapıda sürekli olarak gözlemlemesi için bir temizleme protokolünü optimize eder.
Protokolün kritik adımları
Bu protokoldeki kritik adımlar sabitleme ve kırpmadır. Pirinç sürgünleri, fiksatif çözeltinin penetrasyonunu sınırlayan sert, kalın veya katmanlı dokulara sahiptir. Fiksatif çözeltinin geçirgenliğini arttırmak için, Şekil 1E-F’de gösterildiği gibi, dokuların bir tarafı örneklemede ince bir şekilde tıraş edildi. Ek olarak, vakum işlemleri daha yüksek basınç kullanılarak iki kez tekrarlandı. Ayrıca, numuneler 4 ° C’de normal 2 saatlik fiksasyon yerine gece boyunca 4 ° C’de sabitlendi.
Kırpma adımındaki kilit nokta, kısa bir CS tedavisinin ardından iç yapılarını korurken floresan proteinleri gözlemlemek için hazırlanacak dokuların kalınlığını belirlemektir. Şekil 2C’de gösterildiği gibi, mümkün olduğunca ince elle kesilmiş 1 mm kalınlığındaki numuneler, 3 aylık CS tedavisinden sonra bile sadece sınırlı sayıda dokuda saydam hale geldi. Bu nedenle, kırpma adımı, yetişkin pirinç sürgünlerinin derin floresan gözlemi için gereklidir. Bu çalışmada, örnekler Şekil 2D’de gösterildiği gibi 130 μm kalınlığa kesilmiştir. 130 μm kalınlığı, 1 haftalık CS tedavisinden sonra yaprakların ve 2 hafta sonra tüm numunenin temizlenmesine izin verdi. Bu çalışmada 9-10 LS’de yetişkin pirinç sürgünleri kullanılmıştır. Genç pirinç sürgünlerinden gelen kalın fakat daha yumuşak dokular, CS tedavisi ile daha hızlı temizlenebilir. Numunelerin kalınlığı ve CS tedavisinin süresi, gözlemlenecek 3D yapının doku tipine, durumuna ve kalınlığına göre ayarlanmalıdır.
Değişiklikler ve sorun giderme yöntemleri
CS düşük sıcaklıklarda kolayca çökeldi. Çökelmiş CS, floresan proteinleri koruyamaz; Bu nedenle, numuneler uygun sıcaklıkta saklanırken dikkatli olunmalıdır. Ek olarak, hem CS hem de fiksatif çözeltinin antiseptik etkisi yoktur; bu nedenle, floresan proteinler kontamine olursa parçalanacaktır. Toprakta yetişen pirinç mantar büyümesine eğilimlidir; Bu nedenle, numunelerin örneklenmesi ve işlenmesi, kontaminasyonu önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
Tampondaki aşırı floresan boyalar arka plan floresansı verebilir ve mikroskobik gözlemlere müdahale edebilir. Örneğin, daha önce Evans mavi boyası içeren bir calcofluor beyaz çözeltisi kullanılmıştır. 1 saat boyama ve 1 saat yıkama işleminden sonra, OsMADS15-mOrange’ın floresan proteinleri 555 nm lazer kullanılarak gözlemlendi. Bununla birlikte, Evans mavi boyasından türetilen arka plan floresansı nedeniyle floresan proteinleri gözlenememiştir. Bu arka plan floresansı, numunelerin 2 saat boyunca yıkanmasıyla neredeyse ortadan kaldırıldı. Dahası, örnekler gece boyunca bırakılırsa floresan proteinler daha netti. Bu nedenle, bu çalışmada saf bir calcofluor beyaz çözeltisi kullanılmıştır. Floresan boyadan elde edilen arka plan floresansı, gözlemlerden önce farklı lazer dalga boyları kullanılarak kontrol edilmelidir.
Yöntemin sınırlamaları
Şekil 3’te gösterildiği gibi, 2 haftalık CS tedavisinden sonra 130 μm kalınlığındaki örneklerde derin floresan proteinler gözlenmiştir. Bu, 130 μm kalınlığındaki numunenin 2 haftalık CS tedavisinden sonra saydam hale geldiği Şekil 2D’de gösterilen sonuçlarla tutarlıdır. Bununla birlikte, Şekil 3A’da gösterildiği gibi, sitoplazmanın oto-floresansı 2 hafta sonra düğümlerde hala fark edildi ve sadece 4 haftalık CS tedavisinden sonra tamamen çıkarıldı. Düğümler yüksek hücre yoğunluğuna sahiptir ve bu nedenle otomatik floresan malzemelerin çıkarılması için daha uzun bir zaman gerektirir.
Şekil 3C’de gösterildiği gibi, CS tedavisi olmayan yapraklarda derin floresan proteinler gözlenmiştir, ancak parlaklık, 20 μm’lik aynı derinlikteki düğümlerde ve internodlardakinden daha zayıftı. 1 haftalık CS tedavisinden sonra, floresan proteinleri daha parlaktı. Klorofil yapraklarda bol miktarda bulunur ve 488 nm uyarma ışığını emer. Ayrıca, 555 nm lazer kullanılarak floresan proteinlerin gözlemlenmesine müdahale edebilen turuncu / kırmızı otomatik floresana sahiptirler. 1 haftalık CS tedavisinden sonra, klorofil ve diğer otomatik floresan malzemeler çıkarıldı ve yüksek sinyal-gürültü oranlı görüntüler elde edildi.
2 hafta ve 4 haftalık CS tedavisinden sonra dokularda gözlenebilen derinlikler, floresan proteinleri 4 hafta sonra daha zayıf görünmesine rağmen, anlamlı olarak farklı değildi (Şekil 3). Normalde, floresan proteinlerinin ve otomatik floresanın parlaklığı zamanla zayıflar ve bu da daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı ile sonuçlanır. Bu nedenle, floresan proteinler mikroskobik koşullar ve görüntü işleme ayarlanarak daha net gözlemlenebilir. Bu sonuçlara dayanarak, 2 haftalık CS tedavisinin, numune koşullarımız göz önüne alındığında, derin floresan proteinlerinin gözlemlenmesini kolaylaştırabileceği sonucuna varılmıştır. Bununla birlikte, otomatik floresan malzemeleri tamamen dışlayan daha net görüntüler gözlemlemek için 4 haftaya ihtiyaç vardır.
Vasküler demetler ve çok kollu hücreler gibi güçlü otofloresansı olan yapılar CS’de temizlenemez. Bu yapıları otofloresan olmadan gözlemlemek için, bir zaman geçidi yöntemi12 kullanmak veya floresan spektrumunun spektroskopisi ile görüntü elde etmek gerekir. İki fotonlu mikroskop, daha kalın dokular gözlenirse daha derin dokuları gözlemlemek için daha uygun olabilir.
Yöntemin mevcut ve alternatif yöntemler açısından önemi
Genel olarak, pirinç bitkilerinin iç yapıları kriyostat veya vibratom kesitleme kullanılarak gözlemlenmiştir. Bir kriyostat, daha kolay gözlem sağlayan ince kesitlerin hazırlanması için uygundur, ancak numunelerin hazırlanması ve ekipmanın çalışması zaman alıcıdır. Orijinal 3B yapıyı ince kesitlerden yeniden yapılandırmak da zordur. Vibratomun kullanımı nispeten kolaydır ve kalın bölümler üretmek için uygundur. Bununla birlikte, hedef dokuların kalın bölümleri, ışığın ulaşamayacağı derin dokuların değil, yalnızca kesilmiş yüzeyin gözlemlerine izin verir. Bu nedenlerden dolayı, her iki yöntem de derin floresan gözlemleri için uygun değildir.
Bu çalışma, mevcut yöntemleri birleştirerek CS’nin sınırlı doku penetrasyonu ve konfokal mikroskop altında zayıf nesne çözünürlüğü gibi pirinç sürgünlerinde derin floresan gözlemindeki zorlukları ele almıştır. Şekil 4’te gösterildiği gibi, genç salkımdan tabana kadar yetişkin pirinç sürgünlerinin derin dokularında eksprese edilen floresan proteinleri (OsMADS15-mOrange) gözlemledik. Şekil 4D, çiçeğe odaklanır ve 3 μm aralıklarla derin floresan proteinleri gösterir. 2 haftalık CS tedavisinden sonra -130 μm derinliğin üzerindeki dokular gözlendi, ancak CS tedavisi olmadan aynı büyüklükte ve büyüme aşamasında çiçekte sadece -27 μm derinlik içindeki dokular gözlendi (veriler gösterilmedi). Mevcut geliştirilmiş protokol, sadece genlerin aşırı ekspresyonunun değil, aynı zamanda yetişkin pirinç sürgünlerinin derin dokularındaki doğal gen ekspresyonunun da gözlemlenmesine izin verdi.
Yöntemin belirli araştırma alanlarındaki önemi ve potansiyel uygulamaları
Yetişkin pirinç sürgünlerinin derin floresan gözlemini optimize eden bu protokol, gereksiz dokuları keserek ve CS’nin geçirgenliğini artırarak sert, kalın veya katmanlı dokuların verimli bir şekilde temizlenmesini sağlar. Ek olarak, analiz için numunelerin kalınlığı, normalde kalın veya opak dokuları çözemeyen bir konfokal lazer mikroskobu kullanılarak sürekli ve yapısal derin floresan gözlemine izin verecek şekilde optimize edilmiştir.
Pirinç örneklerini farklı büyüme aşamalarında karşılaştırmak zordur, çünkü floresan proteinler fiksatif ve PBS çözeltilerinde zamanla bozulur. Bununla birlikte, CS’deki floresan proteinler 5 aydan fazla saklanabilir1. CS’nin uzun raf ömrü, pirinçte derin floresan gözlemi için büyük bir avantajdır.
Son zamanlarda, iç yapılarını korurken derin dokuları 3D olarak gözlemlemeyi mümkün kılan birçok temizleme teknolojisi geliştirilmiştir. Bu teknolojiler gelişmeye devam etti ve yeni takas çözümleri geliştirildi. İyi bir örnek, etkili klorofil giderimi ve daha parlak floresan tespiti sağlayan iTOMEI14’tür. Başka bir örnek, temizleme tedavisi sırasında dokuların kahverengileşmesini önleyen ve şeffaf görünmelerini sağlayan ClearSeeAlpha15’tir. Bu takas çözümlerinin mevcut yöntemle birleştirilmesi, daha verimli ve etkili takasın yapılmasına olanak sağlayabilir.
Mevcut yöntemin sadece pirincin değil, diğer bitkilerin de derinlemesine görüntülenmesiyle yeni bilgiler edinilmesine yardımcı olması bekleniyor.
The authors have nothing to disclose.
Dr. R. Terada, Dr. Z. Shimatani ve Dr. H. Tsuji’ye bize OsMADS15-mOrange tohumlarını sağladıkları için teşekkür ederiz; Dr. D. Kurihara, bize NGCN yapısını sağladığı için; ve Dr. R. Shim, makalemizi düzenlediği için. Bu çalışma JSPS KAKENHI (hibe numaraları JP20H05912, 20H05778, 20H05779) ve SATREPS programı (hayır. JPMJSA1706) JST ve JICA’nın.
1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |