Observación de fluorescencia profunda en brotes de arroz mediante tecnología de limpieza
Summary
El presente protocolo describe una técnica de limpieza para los brotes de arroz, que son difíciles de preparar para las observaciones estructurales internas debido a la naturaleza dura, gruesa o en capas de los tejidos. Este método facilita las observaciones de fluorescencia continua y profunda, incluso en plantas de arroz adultas.
Abstract
La tecnología de limpieza recientemente desarrollada que elimina los desajustes del índice de refracción y disminuye el material autofluorescente ha permitido observar los tejidos vegetales en tres dimensiones (3D) preservando sus estructuras internas. En el arroz (Oryza sativa L.), una planta modelo monocotiledónea y un cultivo de importancia mundial, se ha informado de tecnología de limpieza en órganos que son relativamente fáciles de observar, como las raíces y las hojas. También se han reportado aplicaciones de la tecnología de limpieza en el meristemo apical de brotes (SAM) y los tallos, pero solo en un grado limitado debido a la mala penetración de la solución de limpieza (CS) en estos tejidos. La eficiencia limitada de las soluciones de limpieza en estos tejidos se ha atribuido a la autofluorescencia, engrosamiento y endurecimiento de los tejidos en el tallo a medida que se desarrollan los haces vasculares y la epidermis y la estratificación de la SAM con hojas repelentes al agua. El presente protocolo informa la optimización de un enfoque de aclaramiento para la observación continua y 3D de la expresión génica desde la panícula SAM / joven hasta la base de los brotes durante el desarrollo. Las muestras de tejido fijo que expresaban un reportero de proteínas fluorescentes se recortaron en secciones utilizando una microcortadora vibratoria. Cuando se logró un espesor apropiado, se aplicó el CS. Al dirigirse específicamente al tejido central, la tasa de penetración y la uniformidad del SC aumentaron, y el tiempo requerido para hacer que el tejido sea transparente disminuyó. Además, la limpieza de las secciones recortadas permitió la observación de la estructura interna de todo el rodaje desde una perspectiva macro. Este método tiene aplicaciones potenciales en imágenes profundas de tejidos de otras especies de plantas que son difíciles de limpiar.
Introduction
La tecnología de limpieza recientemente desarrollada ha permitido observar los tejidos profundos de las plantas preservando su estructura interna 1,2,3. En la planta modelo dicotiledónea Arabidopsis, se han realizado muchos estudios sobre imágenes de proteínas fluorescentes utilizando tecnología de limpieza para eliminar los desajustes del índice de refracción y eliminar los materiales autofluorescentes 4,5,6. Aunque se ha informado del uso de la tecnología de limpieza7,8 y las imágenes 3D a resolución celular9 en arroz (Oryza sativa L.), una planta modelo monocotiledónea y un cultivo de importancia mundial, estos se limitan a órganos relativamente delgados y blandos, como raíces, hojas y meristemo apical de brotes (SAM), que son fáciles de observar.
El brote es el órgano principal que constituye las partes aéreas de las plantas vasculares. En el arroz, los brotes se componen de una serie de “fitómeros” apilados verticalmente, que comprenden brotes axilares, hojas y el tallo10. En la punta del brote, el SAM está compuesto de células madre indiferenciadas en el centro. Los fitómeros se forman por la diferenciación de células derivadas del SAM. Después de que las plantas pasan de la fase vegetativa a la reproductiva, los tallos del arroz se alargan y el SAM se diferencia en panículas jóvenes10. Este cambio en el desarrollo se acompaña de fluctuaciones en la expresión de varios genes en los tallos y SAM / panículas jóvenes. Para comprender los mecanismos subyacentes a la diferenciación celular en varios tejidos, es importante observar estructuralmente la morfología celular y la expresión génica en los tejidos internos de los brotes. Sin embargo, la imagen profunda de los tallos (nodos y entrenudos) en el brote presenta un desafío debido a la ineficiencia de las soluciones de limpieza para penetrar en el tejido. Los tallos experimentan inmediatamente un rápido aumento de volumen a partir del crecimiento lateral después de la diferenciación del SAM. El endurecimiento de los tejidos del nodo del arroz debido al engrosamiento de los haces vasculares y el enlace complejo horizontal de la anastomosis vascular ganglionar, además de la alta repelencia de los brotes de arroz, contribuyen a limitar la penetración del SC en los tallos10.
Este estudio tuvo como objetivo observar los cambios en la expresión génica en los tejidos de los brotes de arroz utilizando una técnica de fluorescencia profunda estructural. Este trabajo optimiza un protocolo de limpieza para que el arroz observe continuamente la expresión génica desde la panícula SAM / joven hasta la base en una estructura 3D, en lugar de en una superficie plana, utilizando un microscopio láser confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos del protocolo
Los pasos críticos en este protocolo son la fijación y el recorte. Los brotes de arroz tienen tejidos duros, gruesos o en capas que limitan la penetración de la solución fijadora. Para mejorar la permeabilidad de la solución fijadora, un lado del tejido se afeitó finamente en el muestreo, como se muestra en la Figura 1E-F. Además, los tratamientos de vacío se repitieron dos veces utilizando una presión más alta. Además, las muestras se fijaron durante la noche a 4 °C en lugar de la fijación habitual de 2 h a 4 °C.
El punto clave en el paso de recorte es determinar el grosor de los tejidos que deben prepararse para observar las proteínas fluorescentes mientras se preserva su estructura interna después de un corto período de tratamiento con CS. Como se muestra en la Figura 2C, las muestras de 1 mm de espesor, recortadas a mano lo más delgadas posible, se volvieron transparentes solo en un número limitado de tejidos, incluso después de 3 meses de tratamiento con CS. Por lo tanto, el paso de recorte es esencial para la observación de fluorescencia profunda de brotes de arroz adultos. En este estudio, las muestras se recortaron a un espesor de 130 μm, como se muestra en la Figura 2D. El grosor de 130 μm permitió limpiar las hojas después de 1 semana de tratamiento con SC y toda la muestra después de 2 semanas. En este estudio se utilizaron brotes de arroz adultos en el LS 9-10. Los tejidos gruesos pero más blandos de los brotes de arroz más jóvenes se pueden eliminar más rápido con el tratamiento con SC. El grosor de las muestras y la duración del tratamiento con CS deben ajustarse de acuerdo con el tipo de tejido, la condición y el grosor de la estructura 3D a observar.
Modificaciones y métodos de solución de problemas
El CS precipitó fácilmente a bajas temperaturas. El SC precipitado no puede preservar las proteínas fluorescentes; Por lo tanto, se debe tener cuidado al almacenar las muestras a la temperatura adecuada. Además, tanto el CS como la solución fijadora no tienen efecto antiséptico; Por lo tanto, las proteínas fluorescentes se degradarán si están contaminadas. El arroz cultivado en el suelo es propenso al crecimiento de hongos; Por lo tanto, el muestreo y la manipulación de las muestras deben realizarse con cuidado para evitar la contaminación.
El exceso de colorantes fluorescentes en el tampón puede emitir fluorescencia de fondo e interferir con las observaciones microscópicas. Por ejemplo, anteriormente se utilizó una solución blanca de calcofluor que contenía colorante azul Evans. Después de la tinción durante 1 h y el lavado durante 1 h, las proteínas fluorescentes de OsMADS15-mOrange se observaron utilizando un láser de 555 nm. Sin embargo, no se pudieron observar proteínas fluorescentes debido a la fluorescencia de fondo derivada del colorante azul de Evans. Esta fluorescencia de fondo casi se eliminó lavando las muestras durante 2 h. Además, las proteínas fluorescentes eran más claras si las muestras se dejaban durante la noche. Por lo tanto, se utilizó una solución blanca de calcofluor puro en este estudio. La fluorescencia de fondo derivada del colorante fluorescente debe verificarse utilizando diferentes longitudes de onda láser antes de las observaciones.
Limitaciones del método
Como se muestra en la Figura 3, se observaron proteínas fluorescentes profundas en las muestras que tenían 130 μm de espesor después de 2 semanas de tratamiento con SC. Esto es consistente con los resultados mostrados en la Figura 2D, donde la muestra de 130 μm de espesor se volvió transparente después de 2 semanas de tratamiento con CS. Sin embargo, como se muestra en la Figura 3A, la autofluorescencia del citoplasma todavía era notable en los ganglios después de 2 semanas y solo se eliminó por completo después de 4 semanas de tratamiento con SC. Los nodos tienen una alta densidad celular y, por lo tanto, requieren más tiempo para eliminar los materiales autofluorescentes.
Como se muestra en la Figura 3C, se observaron proteínas fluorescentes profundas en las hojas sin tratamiento con SC, pero el brillo fue más débil que en los nodos e internodos a la misma profundidad de 20 μm. Después de 1 semana de tratamiento con CS, las proteínas fluorescentes fueron más brillantes. La clorofila es abundante en las hojas y absorbe 488 nm de luz de excitación. También tienen autofluorescencia naranja / roja, que puede interferir con la observación de proteínas fluorescentes utilizando un láser de 555 nm. Después de 1 semana de tratamiento con CS, se eliminaron la clorofila y otros materiales autofluorescentes, lo que resultó en imágenes de alta relación señal-ruido.
Las profundidades que se pudieron observar en los tejidos después de 2 semanas y 4 semanas de tratamiento con SC no fueron significativamente diferentes, aunque las proteínas fluorescentes parecían más débiles después de 4 semanas (Figura 3). Normalmente, el brillo de las proteínas fluorescentes y la autofluorescencia se debilita con el tiempo, lo que resulta en una mayor relación señal-ruido. Por lo tanto, las proteínas fluorescentes se pueden observar más claramente ajustando las condiciones microscópicas y el procesamiento de imágenes. Con base en estos resultados, se concluyó que 2 semanas de tratamiento con SC podrían facilitar la observación de proteínas fluorescentes profundas, dadas nuestras condiciones de muestra. Sin embargo, se necesitan 4 semanas para observar imágenes más claras que excluyan completamente los materiales autofluorescentes.
Las estructuras con autofluorescencia fuerte, como los haces vasculares y las células de múltiples brazos, no se pueden eliminar en el SC. Para observar estas estructuras sin autofluorescencia, es necesario utilizar un método de activación temporal12 u obtener imágenes por espectroscopia del espectro de fluorescencia. Un microscopio de dos fotones puede ser más adecuado para observar tejidos más profundos si se observan tejidos más gruesos.
Importancia del método con respecto a los métodos existentes y alternativos
En general, las estructuras internas de las plantas de arroz se han observado utilizando criostato o sección de vibratomo. Un criostato es adecuado para preparar secciones delgadas, lo que permite una observación más fácil, pero la preparación de las muestras y el funcionamiento del equipo requieren mucho tiempo. Reconstruir la estructura 3D original a partir de secciones delgadas también es difícil. El vibratomo es relativamente fácil de operar y adecuado para producir secciones gruesas. Sin embargo, las secciones gruesas de los tejidos diana solo permiten observar la superficie cortada y no los tejidos profundos que la luz no puede alcanzar. Por estas razones, ninguno de los métodos es adecuado para observaciones de fluorescencia profunda.
Este estudio abordó los desafíos en la observación de fluorescencia profunda en brotes de arroz, como la penetración tisular limitada del CS y la mala resolución de objetos bajo un microscopio confocal, combinando los métodos existentes. Como se muestra en la Figura 4, observamos proteínas fluorescentes (OsMADS15-mOrange) expresadas en los tejidos profundos de brotes de arroz adultos desde la panícula joven hasta la base. La figura 4D se centra en el florete y muestra proteínas fluorescentes profundas a intervalos de 3 μm. Se observaron tejidos de más de -130 μm de profundidad después de 2 semanas de tratamiento con SC, pero solo se observaron los tejidos dentro de -27 μm de profundidad (datos no mostrados) en el florete con el mismo tamaño y etapa de crecimiento sin tratamiento de SC. El protocolo mejorado actual permitió la observación no solo de la sobreexpresión de genes, sino también de la expresión génica natural en los tejidos profundos de los brotes de arroz adultos.
Importancia y aplicaciones potenciales del método en áreas de investigación específicas
Este protocolo, que optimiza la observación de fluorescencia profunda de brotes de arroz adultos, permite la limpieza eficiente de tejidos duros, gruesos o en capas al recortar tejidos innecesarios y aumentar la permeabilidad del CS. Además, el espesor de las muestras para el análisis se optimizó para permitir la observación continua y estructural de fluorescencia profunda utilizando un microscopio láser confocal, que normalmente no puede resolver tejidos gruesos u opacos.
Es difícil comparar muestras de arroz en diferentes etapas de crecimiento porque las proteínas fluorescentes se degradan con el tiempo en las soluciones fijadoras y PBS. Sin embargo, las proteínas fluorescentes en el SC pueden almacenarse durante más de 5 meses1. La larga vida útil del CS es una gran ventaja para la observación de fluorescencia profunda en el arroz.
Recientemente, se han desarrollado muchas tecnologías de limpieza, lo que permite observar tejidos profundos en 3D mientras se preservan sus estructuras internas. Estas tecnologías han seguido evolucionando y se han desarrollado nuevas soluciones de compensación. Un buen ejemplo es iTOMEI14, que permite la eliminación eficiente de clorofila y una detección de fluorescencia más brillante. Otro ejemplo es ClearSeeAlpha15, que evita el oscurecimiento de los tejidos durante el tratamiento de limpieza y los hace parecer transparentes. La combinación de estas soluciones de compensación con el método actual puede permitir una limpieza más eficiente y efectiva.
Se espera que el método actual ayude a obtener nuevos conocimientos a través de imágenes profundas no solo del arroz sino también de otras plantas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. R. Terada, al Dr. Z. Shimatani y al Dr. H. Tsuji por proporcionarnos las semillas OsMADS15-mOrange; Dr. D. Kurihara por proporcionarnos la construcción de NGCN; y al Dr. R. Shim por editar nuestro manuscrito. Este trabajo fue financiado por JSPS KAKENHI (números de subvención JP20H05912, 20H05778, 20H05779) y por el programa SATREPS (no. JPMJSA1706) del JST y JICA.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
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