Глубокое флуоресцентное наблюдение в побегах риса с помощью технологии очистки
Summary
В настоящем протоколе описывается метод очистки побегов риса, которые трудно подготовить для внутренних структурных наблюдений из-за твердого, толстого или слоистого характера тканей. Этот метод облегчает непрерывные и глубокие флуоресцентные наблюдения даже у взрослых рисовых растений.
Abstract
Недавно разработанная технология очистки, которая устраняет несоответствия показателей преломления и уменьшает автофлуоресцентный материал, позволила наблюдать ткани растений в трех измерениях (3D) при сохранении их внутренних структур. В рисе (Oryza sativa L.), однодольном модельном растении и глобально важной культуре, технология очистки была зарегистрирована в органах, которые относительно легко наблюдать, таких как корни и листья. Также сообщалось о применении технологии очистки в побеговой апикальной меристеме (SAM) и стеблях, но только в ограниченной степени из-за плохого проникновения очищающего раствора (CS) в эти ткани. Ограниченная эффективность очищающих растворов в этих тканях объясняется автофлуоресценцией, утолщением и затвердеванием тканей в стволе по мере развития сосудистых пучков и эпидермиса и наслоения SAM водоотталкивающими листьями. В настоящем протоколе сообщается об оптимизации клирингового подхода для непрерывного и 3D-наблюдения экспрессии генов от SAM/молодой метелки до основания побегов во время развития. Фиксированные образцы тканей, экспрессирующие флуоресцентный репортер белка, были разрезаны на участки с использованием вибрационного микросайсера. Когда была достигнута соответствующая толщина, применялся CS. При целенаправленном нацеливании на центральную ткань скорость проникновения и однородность КС увеличивались, а время, необходимое для того, чтобы сделать ткань прозрачной, уменьшалось. Кроме того, очистка обрезанных участков позволила наблюдать внутреннюю структуру всей съемки с макроперспекции. Этот метод имеет потенциальное применение в глубокой визуализации тканей других видов растений, которые трудно очистить.
Introduction
Недавно разработанная технология очистки позволила наблюдать глубокие ткани растений при сохранении их внутренней структуры 1,2,3. В дикот-модельном растении Arabidopsis многие исследования по флуоресцентной визуализации белка были проведены с использованием технологии очистки для устранения несоответствий показателей преломления и удаления автофлуоресцентных материалов 4,5,6. Хотя использование технологии очистки 7,8 и 3D-визуализации с клеточным разрешением9 было зарегистрировано в рисе (Oryza sativa L.), однодольном модельном растении и глобально важной культуре, они ограничены относительно тонкими и мягкими органами, такими как корни, листья и побег апикальной меристемы (SAM), которые легко наблюдать.
Побег является главным органом, составляющим надземные части сосудистых растений. В рисе побеги состоят из ряда вертикально сложенных «фитомеров», включающих подмышечные почки, листья и стебель10. На кончике побега SAM состоит из недифференцированных стволовых клеток в центре. Фитомеры образуются путем дифференцировки клеток, полученных из SAM. После того, как растения переходят из вегетативной в репродуктивную фазу, стебли риса удлиняются и SAM дифференцируется в молодые метелки10. Это изменение развития сопровождается колебаниями экспрессии различных генов в стеблях и SAM/молодых метелках. Чтобы понять механизмы, лежащие в основе дифференцировки клеток в различные ткани, важно структурно наблюдать морфологию клеток и экспрессию генов во внутренних тканях побега. Однако глубокая визуализация стеблей (узлов и междоузлий) в побеге представляет собой проблему из-за неэффективности очищающих растворов для проникновения в ткань. Стебли сразу же подвергаются быстрому увеличению объема от бокового роста после дифференциации от SAM. Затвердевание тканей рисового узла из-за утолщения сосудистых пучков и горизонтального сложного звена узлового сосудистого анастомоза, помимо высокой репеллентности побегов риса, все это способствует ограничению проникновения КС в стебли10.
Это исследование было направлено на наблюдение за изменениями экспрессии генов в тканях рисовых побегов с использованием метода структурной глубокой флуоресценции. Эта работа оптимизирует протокол очистки риса, чтобы непрерывно наблюдать экспрессию генов от SAM / молодой метелки до основания в 3D-структуре, а не на плоской поверхности, используя конфокальный лазерный микроскоп.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические этапы протокола
Критическими шагами в этом протоколе являются фиксация и обрезка. Побеги риса имеют твердые, толстые или слоистые ткани, которые ограничивают проникновение фиксирующего раствора. Для улучшения проницаемости фиксирующего раствора одну сторону ткани тонко выбривали при отборе проб, как показано на рисунке 1E-F. Кроме того, вакуумные обработки повторялись дважды с использованием более высокого давления. Кроме того, образцы фиксировались в течение ночи при 4 °C вместо обычной фиксации в течение 2 часов при 4 °C.
Ключевым моментом на этапе обрезки является определение толщины тканей, которые должны быть подготовлены к наблюдению флуоресцентных белков при сохранении их внутренней структуры после короткого периода лечения CS. Как показано на рисунке 2C, образцы толщиной 1 мм, обрезанные вручную как можно тоньше, стали прозрачными только в ограниченном количестве тканей даже после 3 месяцев лечения CS. Поэтому этап обрезки необходим для глубокого флуоресцентного наблюдения взрослых побегов риса. В этом исследовании образцы были обрезаны до толщины 130 мкм, как показано на рисунке 2D. Толщина 130 мкм позволила очистить листья после 1 недели обработки CS и весь образец через 2 недели. Взрослые побеги риса при 9-10 LS были использованы в этом исследовании. Толстые, но более мягкие ткани из более молодых побегов риса могут быть очищены быстрее с помощью лечения CS. Толщина образцов и продолжительность обработки CS должны быть скорректированы в соответствии с типом ткани, состоянием и толщиной 3D-структуры, которую необходимо наблюдать.
Изменения и методы устранения неполадок
CS легко выпадает в осадок при низких температурах. Осажденный CS не может сохранить флуоресцентные белки; следовательно, необходимо соблюдать осторожность при хранении образцов при надлежащей температуре. Кроме того, как КС, так и фиксирующий раствор не оказывают антисептического действия; поэтому флуоресцентные белки будут разлагаться при загрязнении. Выращенный в почве рис склонен к грибковому росту; следовательно, отбор проб и обработка образцов должны осуществляться с осторожностью, чтобы избежать загрязнения.
Избыток флуоресцентных красителей в буфере может испускать фоновую флуоресценцию и мешать микроскопическим наблюдениям. Например, ранее использовался белый раствор калькофтора, содержащий синий краситель Эванса. После окрашивания в течение 1 ч и промывки в течение 1 ч флуоресцентные белки OsMADS15-mOrange наблюдали с помощью лазера 555 нм. Однако флуоресцентные белки не могли наблюдаться из-за фоновой флуоресценции, полученной из синего красителя Эванса. Эта фоновая флуоресценция была почти устранена путем промывки образцов в течение 2 ч. Более того, флуоресцентные белки были более чистыми, если образцы оставляли на ночь. Поэтому в этом исследовании был использован чистый белый раствор калькофтора. Фоновая флуоресценция, полученная из флуоресцентного красителя, должна быть проверена с использованием различных длин волн лазера перед наблюдениями.
Ограничения метода
Как показано на рисунке 3, глубокие флуоресцентные белки наблюдались в образцах толщиной 130 мкм после 2 недель лечения CS. Это согласуется с результатами, показанными на рисунке 2D, где образец толщиной 130 мкм стал прозрачным после 2 недель лечения CS. Однако, как показано на рисунке 3А, аутофлуоресценция цитоплазмы все еще была заметна в узлах через 2 недели и была полностью удалена только после 4 недель лечения CS. Узлы имеют высокую плотность ячеек и, следовательно, требуют более длительного времени для удаления автофлуоресцентных материалов.
Как показано на рисунке 3C, глубокие флуоресцентные белки наблюдались в листьях без обработки CS, но яркость была слабее, чем в узлах и междоузлиях на той же глубине 20 мкм. После 1 недели лечения CS флуоресцентные белки стали ярче. Хлорофилл в изобилии содержится в листьях и поглощает 488 нм света возбуждения. Они также имеют оранжево-красную автофлуоресценцию, которая может мешать наблюдению флуоресцентных белков с помощью лазера 555 нм. После 1 недели обработки CS хлорофилл и другие автофлуоресцентные материалы были удалены, что привело к получению изображений с высоким соотношением сигнал/шум.
Глубины, которые можно было наблюдать в тканях после 2 недель и 4 недель лечения CS, существенно не отличались, хотя флуоресцентные белки казались слабее через 4 недели (рисунок 3). Обычно яркость флуоресцентных белков и автофлуоресценция со временем ослабевают, что приводит к более высокому соотношению сигнал/шум. Поэтому флуоресцентные белки можно наблюдать более четко, регулируя микроскопические условия и обработку изображений. На основе этих результатов был сделан вывод, что 2 недели лечения CS могут облегчить наблюдение за глубокими флуоресцентными белками, учитывая наши условия выборки. Однако для наблюдения за более четкими изображениями, которые полностью исключают автофлуоресцентные материалы, необходимы 4 недели.
Структуры с сильной аутофлуоресценцией, такие как сосудистые пучки и клетки с несколькими руками, не могут быть очищены в CS. Чтобы наблюдать эти структуры без автофлуоресценции, необходимо использовать метод12 замедления времени или получить изображения методом спектроскопии флуоресцентного спектра. Двухфотонный микроскоп может быть более подходящим для наблюдения более глубоких тканей, если наблюдаются более толстые ткани.
Значение метода по отношению к существующим и альтернативным методам
Как правило, внутренние структуры рисовых растений наблюдались с использованием криостата или вибратомного сечения. Криостат подходит для подготовки тонких срезов, которые позволяют легче наблюдать, но подготовка образцов и работа оборудования отнимают много времени. Реконструкция оригинальной 3D-структуры из тонких участков также затруднена. Вибратом относительно прост в эксплуатации и подходит для производства толстых сечений. Однако толстые участки тканей-мишеней позволяют наблюдать только поверхность разреза, а не глубокие ткани, до которых не может добраться свет. По этим причинам ни один из методов не подходит для наблюдений глубокой флуоресценции.
В этом исследовании рассматривались проблемы глубокого флуоресцентного наблюдения в побегах риса, такие как ограниченное проникновение в ткани CS и плохое разрешение объектов под конфокальным микроскопом, путем объединения существующих методов. Как показано на рисунке 4, мы наблюдали флуоресцентные белки (OsMADS15-mOrange), экспрессируемые в глубоких тканях взрослых побегов риса от молодой метелки до основания. Рисунок 4D фокусируется на цветке и показывает глубокие флуоресцентные белки с интервалом 3 мкм. Ткани глубиной более −130 мкм наблюдались после 2 недель лечения CS, но наблюдались только ткани в пределах глубины −27 мкм (данные не показаны) во флорете при том же размере и стадии роста без лечения CS. Текущий улучшенный протокол позволил наблюдать не только сверхэкспрессию генов, но и естественную экспрессию генов в глубоких тканях взрослых побегов риса.
Важность и потенциал применения метода в конкретных областях исследований
Этот протокол, который оптимизирует глубокое флуоресцентное наблюдение взрослых побегов риса, позволяет эффективно очищать твердые, толстые или слоистые ткани путем обрезки ненужных тканей и повышения проницаемости CS. Кроме того, толщина образцов для анализа была оптимизирована, чтобы обеспечить непрерывное и структурное глубокое флуоресцентное наблюдение с использованием конфокального лазерного микроскопа, который обычно не может разрешать толстые или непрозрачные ткани.
Трудно сравнивать образцы риса на разных стадиях роста, потому что флуоресцентные белки со временем разлагаются в фиксаторных и PBS растворах. Однако флуоресцентные белки в КС могут храниться более 5 месяцев1. Длительный срок хранения CS является основным преимуществом для наблюдения глубокой флуоресценции в рисе.
В последнее время разработано множество клиринговых технологий, позволяющих наблюдать глубокие ткани в 3D при сохранении их внутренних структур. Эти технологии продолжают развиваться, и были разработаны новые клиринговые решения. Хорошим примером является iTOMEI14, который обеспечивает эффективное удаление хлорофилла и более яркое обнаружение флуоресценции. Другим примером является ClearSeeAlpha15, который предотвращает потемнение тканей во время очистки и делает их прозрачными. Сочетание этих клиринговых решений с настоящим методом может обеспечить более эффективную и действенную очистку.
Ожидается, что нынешний метод поможет получить новое понимание за счет глубокой визуализации не только риса, но и других растений.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Р. Терада, д-ра З. Шиматани и д-ра Х. Цудзи за предоставление нам семян OsMADS15-mOrange; Д-р Д. Курихара за предоставление нам конструкции NGCN; и д-р Р. Шим за редактирование нашей рукописи. Эта работа финансировалась JSPS KAKENHI (номера грантов JP20H05912, 20H05778, 20H05779) и программой SATREPS (no. JPMJSA1706) JST и JICA.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11 (8), 0161107 (2016).
- Pandey, K. B., et al. Plant roots sense soil compaction through restricted ethylene diffusion. Science. 371 (6526), 276-280 (2021).
- Ejaza, M., Bencivenga, S., Tavaresa, R., Busha, M., Sablowski, R. ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX GENE 1 controls plant architecture by locally restricting environmental responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (17), (2021).
- Smetana, O., et al. High levels of auxin signalling define the stem-cell organizer of the vascular cambium. Nature. 565 (7740), 485-489 (2019).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11 (1), 23 (2018).
- Nagaki, K., Yamaji, N., Murata, M. ePro-ClearSee: A simple immunohistochemical method that does not require sectioning of plant samples. Scientific Reports. 7, 42203 (2017).
- Sato, M., Akashi, H., Sakamoto, Y., Matsunaga, S., Tsuji, H. Whole-tissue three-dimensional imaging of rice at single-cell resolution. International Journal of Molecular Sciences. 23 (1), 40 (2022).
- Matsuo, T., Hoshikawa, K. Science of the Rice Plant: Morphology. Food and Agriculture Policy Research Center. , (1993).
- Kobayashi, K., et al. Inflorescence meristem identity in rice is specified by overlapping functions of three AP1/FUL-Like MADS box genes and PAP2, a SEPALLATA MADS box gene. Plant Cell. 24 (5), 1848-1859 (2012).
- Tamaki, S., et al. FT-like proteins induce transposon silencing in the shoot apex during floral induction in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 901-910 (2015).
- Kodama, Y. Time gating of chloroplast autofluorescence allows clearer fluorescence imaging In Planta. PLoS One. 11 (3), 0152484 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Communications Biology. 5 (1), 12 (2022).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: Advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
