Observação de Fluorescência Profunda em Brotos de Arroz via Tecnologia de Compensação
Summary
O presente protocolo descreve uma técnica de compensação para brotos de arroz, que são difíceis de preparar para observações estruturais internas devido à natureza dura, grossa ou em camadas dos tecidos. Este método facilita observações contínuas e profundas de fluorescência, mesmo em plantas de arroz adultas.
Abstract
A tecnologia de compensação recentemente desenvolvida que elimina incompatibilidades de índices refrativos e diminui o material auto-fluorescente possibilitou observar tecidos vegetais em três dimensões (3D) preservando suas estruturas internas. No arroz (Oryza sativa L.), uma planta modelo monocot e uma cultura globalmente importante, a tecnologia de compensação tem sido relatada em órgãos relativamente fáceis de observar, como as raízes e as folhas. Também foram relatadas aplicações da tecnologia de compensação em meristem apical apical (SAM) e hastes, mas apenas em um grau limitado devido à má penetração da solução de compensação (CS) nesses tecidos. A eficiência limitada das soluções de compensação nesses tecidos tem sido atribuída à auto-fluorescência, espessamento e endurecimento dos tecidos na haste à medida que os feixes vasculares e a epiderme se desenvolvem e camadas do SAM com folhas repelentes à água. O presente protocolo relata a otimização de uma abordagem de compensação para observação contínua e 3D da expressão genética do sam/jovem em pânico até a base das filmagens durante o desenvolvimento. Amostras de tecido fixo expressando um repórter de proteína fluorescente foram aparadas em seções usando um micro-fatiador vibrante. Quando uma espessura apropriada foi alcançada, o CS foi aplicado. Ao direcionar especificamente o tecido central, a taxa de penetração e uniformidade do CS aumentou, e o tempo necessário para tornar o tecido transparente diminuiu. Além disso, a limpeza das seções aparadas possibilitou a observação da estrutura interna de toda a filmagem a partir de uma perspectiva macro. Este método tem aplicações potenciais em imagens profundas de tecidos de outras espécies vegetais que são difíceis de limpar.
Introduction
A tecnologia de limpeza recém-desenvolvida possibilitou observar os tecidos profundos das plantas, preservando sua estrutura interna 1,2,3. Na planta modelo dicot Arabidopsis, muitos estudos sobre imagem de proteína fluorescente têm sido realizados usando tecnologia de compensação para eliminar incompatibilidades de índice refrativo e remover materiais auto-fluorescentes 4,5,6. Embora o uso da tecnologia de compensação 7,8 e 3D de imagem na resoluçãocelular 9 tenha sido relatado no arroz (Oryza sativa L.), uma planta modelo monocot e uma cultura globalmente importante, estes são limitados a órgãos relativamente finos e macios, como raízes, folhas e meristem apical (SAM), que são fáceis de observar.
A filmagem é o principal órgão que constitui as partes acima do solo das plantas vasculares. No arroz, as brotos são compostas por uma série de “fitomers” empilhados verticalmente, compreendendo botões axilares, folhas e a haste10. Na ponta da filmagem, o SAM é composto de células-tronco indiferenciadas no centro. Os fitomeros são formados pela diferenciação de células derivadas do SAM. Após a mudança das plantas da fase vegetativa para a reprodução, o arroz se alonga e o SAM se diferencia em jovenspânicos 10. Esta mudança de desenvolvimento é acompanhada por flutuações na expressão de vários genes nas hastes e sam/jovens pânicos. Para entender os mecanismos de diferenciação celular subjacente em vários tecidos, é importante observar estruturalmente a morfologia celular e a expressão genética nos tecidos internos de tiro. No entanto, a imagem profunda de caules (nódulos e internos) na filmagem apresenta um desafio devido à ineficiência de soluções de compensação para penetrar no tecido. As hastes passam imediatamente por um rápido aumento de volume do crescimento lateral após a diferenciação do SAM. O endurecimento dos tecidos do nó de arroz devido ao espessamento dos feixes vasculares e a ligação complexa horizontal da anastomose vascular nodadal, além da alta repellency dos brotos de arroz, contribuem para limitar a penetração do CS em hastes10.
Este estudo teve como objetivo observar mudanças na expressão genética nos tecidos de tiro de arroz usando uma técnica estrutural de fluorescência profunda. Este trabalho otimiza um protocolo de compensação para que o arroz observe continuamente a expressão genética do SAM/young panicle até a base em uma estrutura 3D, em vez de em uma superfície plana, usando um microscópio a laser confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passos críticos do protocolo
Os passos críticos neste protocolo são fixação e corte. Os brotos de arroz têm tecidos duros, grossos ou em camadas que limitam a penetração da solução fixativa. Para melhorar a permeabilidade da solução fixativa, um lado do tecido foi finamente raspado na amostragem, como mostrado na Figura 1E-F. Além disso, os tratamentos a vácuo foram repetidos duas vezes usando maior pressão. Além disso, as amostras foram fixadas durante a noite a 4 °C em vez da fixação usual de 2 h a 4 °C.
O ponto chave na etapa de corte é determinar a espessura dos tecidos a serem preparados para observar as proteínas fluorescentes, preservando sua estrutura interna após um curto período de tratamento de CS. Como mostrado na Figura 2C, as amostras de 1 mm de espessura, aparadas à mão o mais finas possível, tornaram-se transparentes em apenas um número limitado de tecidos mesmo após 3 meses de tratamento de CS. Portanto, o passo de corte é essencial para a observação de fluorescência profunda de brotos de arroz adulto. Neste estudo, as amostras foram aparadas a uma espessura de 130 μm, como mostra a Figura 2D. A espessura de 130 μm permitiu limpar as folhas após 1 semana de tratamento de CS e toda a amostra após 2 semanas. Os brotos de arroz adulto no 9-10 LS foram usados neste estudo. Tecidos grossos, mas mais macios de brotos de arroz mais jovens podem ser limpos mais rapidamente com o tratamento CS. A espessura das amostras e a duração do tratamento de SC devem ser ajustadas de acordo com o tipo de tecido, condição e espessura da estrutura 3D a ser observada.
Modificações e métodos de solução de problemas
O CS precipitado facilmente a baixas temperaturas. A CS precipitada não pode preservar as proteínas fluorescentes; portanto, deve-se tomar cuidado ao armazenar as amostras na temperatura adequada. Além disso, tanto a solução CS quanto a fixação não têm efeito antisséptico; portanto, as proteínas fluorescentes serão degradadas se contaminadas. O arroz cultivado no solo é propenso ao crescimento fúngico; por isso, a amostragem e o manuseio das amostras devem ser realizados com cuidado para evitar contaminação.
O excesso de corantes fluorescentes no buffer pode empacoar fluorescência de fundo e interferir com observações microscópicas. Por exemplo, uma solução branca de calcofluor contendo corante azul Evans foi usada anteriormente. Após a coloração por 1 h e lavagem por 1 h, as proteínas fluorescentes de OsMADS15-mOrange foram observadas utilizando um laser de 555 nm. No entanto, as proteínas fluorescentes não puderam ser observadas devido à fluorescência de fundo derivada do corante azul evans. Esta fluorescência de fundo foi quase eliminada lavando as amostras por 2h. Além disso, as proteínas fluorescentes eram mais claras se as amostras fossem deixadas durante a noite. Por isso, foi utilizada uma solução branca de calcofluor pura neste estudo. A fluorescência de fundo derivada do corante fluorescente deve ser verificada usando diferentes comprimentos de onda laser antes das observações.
Limitações do método
Como mostrado na Figura 3, foram observadas proteínas fluorescentes profundas nas amostras que tinham 130 μm de espessura após 2 semanas de tratamento de CS. Isso é consistente com os resultados mostrados na Figura 2D, onde a amostra de 130 μm de espessura tornou-se transparente após 2 semanas de tratamento de CS. No entanto, como mostrado na Figura 3A, a auto-fluorescência do citoplasma ainda era perceptível nos nódulos após 2 semanas e só foi completamente removida após 4 semanas de tratamento de CS. Os nódulos têm uma alta densidade celular e, portanto, requerem um tempo maior para remover materiais auto-fluorescentes.
Como mostrado na Figura 3C, proteínas fluorescentes profundas foram observadas nas folhas sem tratamento de CS, mas o brilho foi mais fraco do que nos nós e internos na mesma profundidade de 20 μm. Após 1 semana de tratamento de CS, as proteínas fluorescentes foram mais brilhantes. A clorofila é abundante em folhas e absorve 488 nm de luz de excitação. Eles também têm auto-fluorescência laranja/vermelha, que pode interferir com a observação de proteínas fluorescentes usando um laser de 555 nm. Após 1 semana de tratamento de CS, clorofila e outros materiais auto-fluorescentes foram removidos, resultando em imagens de alta relação sinal-ruído.
As profundidades que poderiam ser observadas nos tecidos após 2 semanas e 4 semanas de tratamento de CS não foram significativamente diferentes, embora as proteínas fluorescentes pareceram mais fracas após 4 semanas (Figura 3). Normalmente, o brilho das proteínas fluorescentes e da auto-fluorescência enfraquece com o tempo, resultando em uma maior relação sinal-ruído. Portanto, as proteínas fluorescentes podem ser observadas com mais clareza, ajustando as condições microscópicas e o processamento de imagens. Com base nesses resultados, concluiu-se que 2 semanas de tratamento de CS poderiam facilitar a observação de proteínas fluorescentes profundas, dadas as nossas condições amostrais. No entanto, 4 semanas são necessárias para observar imagens mais claras que excluem completamente os materiais auto-fluorescentes.
Estruturas com forte autofluorescência, como feixes vasculares e células multi-braço, não podem ser limpas no CS. Para observar essas estruturas sem autofluorescência, é necessário utilizar um método de gating de tempo12 ou obter imagens por espectroscopia do espectro da fluorescência. Um microscópio de dois fótons pode ser mais adequado para observar tecidos mais profundos se forem observados tecidos mais espessos.
Significância do método em relação aos métodos existentes e alternativos
Geralmente, as estruturas internas das plantas de arroz têm sido observadas usando criostat ou seção de vibratome. Um criostat é adequado para a preparação de seções finas, que permitem uma observação mais fácil, mas a preparação das amostras e o funcionamento do equipamento são demorados. Reconstruir a estrutura 3D original a partir de seções finas também é difícil. O vibratome é relativamente fácil de operar e adequado para produzir seções grossas. No entanto, seções grossas de tecidos alvo só permitem observações da superfície cortada e não de tecidos profundos que a luz não pode alcançar. Por essas razões, nenhum dos métodos é adequado para observações de fluorescência profunda.
Este estudo abordou desafios na observação de fluorescência profunda em brotos de arroz, como a penetração limitada de tecido do CS e a resolução de objetos pobres sob um microscópio confocal, combinando métodos existentes. Como mostrado na Figura 4, observamos proteínas fluorescentes (OsMADS15-mOrange) expressas nos tecidos profundos de brotos de arroz adulto do jovem panicle até a base. A Figura 4D concentra-se no florete e mostra proteínas fluorescentes profundas em intervalos de 3 μm. Tecidos com mais de −130 μm de profundidade foram observados após 2 semanas de tratamento de CS, mas apenas os tecidos dentro de −27 μm de profundidade foram observados (dados não mostrados) no florete no mesmo tamanho e estágio de crescimento sem tratamento de CS. O protocolo aprimorado atual permitiu a observação não apenas da superexpressão dos genes, mas também da expressão genética natural nos tecidos profundos dos brotos de arroz adultos.
Importância e aplicações potenciais do método em áreas específicas de pesquisa
Este protocolo, que otimiza a observação profunda da fluorescência de brotos de arroz adulto, permite a limpeza eficiente de tecidos duros, grossos ou em camadas, aparando tecidos desnecessários e aumentando a permeabilidade do CS. Além disso, a espessura das amostras para análise foi otimizada para permitir a observação contínua e estrutural de fluorescência profunda utilizando um microscópio a laser confocal, que normalmente não consegue resolver tecidos grossos ou opacos.
É difícil comparar amostras de arroz em diferentes estágios de crescimento porque as proteínas fluorescentes se degradam ao longo do tempo nas soluções fixativas e pbs. No entanto, as proteínas fluorescentes no CS podem ser armazenadas por mais de 5 meses1. A longa vida útil do CS é uma grande vantagem para a observação da fluorescência profunda no arroz.
Recentemente, muitas tecnologias de compensação foram desenvolvidas, possibilitando observar tecidos profundos em 3D, preservando suas estruturas internas. Essas tecnologias continuaram a evoluir, e novas soluções de compensação foram desenvolvidas. Um bom exemplo é o iTOMEI14, que permite uma remoção eficiente de clorofila e detecção de fluorescência mais brilhante. Outro exemplo é o ClearSeeAlpha15, que previne o browning de tecidos durante o tratamento de limpeza e os faz parecer transparentes. A combinação dessas soluções de compensação com o presente método pode permitir uma compensação mais eficiente e eficaz.
Espera-se que o método atual ajude a obter novas percepções através de imagens profundas não apenas de arroz, mas também de outras plantas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. R. Terada, Dr. Z. Shimatani e Dr. H. Tsuji por nos fornecerem as sementes OsMADS15-mOrange; Dr. D. Kurihara por nos fornecer a construção do NGCN; e dr. R. Shim para edição de nosso manuscrito. Este trabalho foi financiado pela JSPS KAKENHI (números de subvenção JP20H05912, 20H05778, 20H05779) e pelo programa SATREPS (nº. JPMJSA1706) do JST e JICA.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
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