伐採技術 による 稲作の深部蛍光観察

プロトコルの重要なステップ
このプロトコルの重要なステップは、固定とトリミングです。イネの芽は、固定液の浸透を制限する硬く、厚い、または層状の組織を有する。固定液の透過性を改善するために、 図1E−Fに示すように、組織の片側をサンプリング時に薄く剃毛した。なお、真空処理は、より高い圧力を用いて2回繰り返した。さらに、サンプルを通常の4°Cで2時間固定に代えて4°Cで一晩固定した。

トリミング工程の重要なポイントは、短期間のCS処理後に蛍光タンパク質の内部構造を維持しながら蛍光タンパク質を観察するために調製される組織の厚さを決定することである。 図2Cに示すように、厚さ1mmのサンプルは、できるだけ薄く手でトリミングされ、CS処理の3ヶ月後でさえも限られた数の組織でのみ透明になった。したがって、トリミング工程は、成体イネの芽の深い蛍光観察に不可欠である。この研究では、 図2Dに示すように、サンプルを130μmの厚さにトリミングしました。130μmの厚さにより、CS処理の1週間後および2週間後にサンプル全体を透明化することができた。9〜10LSでの成米芽をこの研究に使用した。若い稲作からの厚いが柔らかい組織は、CS処理でより速くクリアすることができます。サンプルの厚さとCS処理の期間は、観察する3D構造の組織タイプ、状態、および厚さに応じて調整する必要があります。

変更とトラブルシューティングの方法
このCSは低温で容易に析出する。沈殿したCSは蛍光タンパク質を保存することができません。したがって、サンプルを適切な温度で保存する場合は注意が必要です。さらに、CSおよび固定液はいずれも防腐効果を有さない。したがって、蛍光タンパク質は汚染されると分解されます。土壌で栽培された米は真菌の増殖を起こしやすい。したがって、サンプルのサンプリングと取り扱いは、汚染を避けるために注意して実行する必要があります。

バッファー中の過剰な蛍光色素は、バックグラウンド蛍光を発し、顕微鏡観察を妨げる可能性があります。例えば、エバンスブルー染料を含むカルコフルア白色溶液が以前に使用されていた。1時間染色し、1時間洗浄した後、OsMADS15-mOrangeの蛍光タンパク質を555nmレーザーを用いて観察した。しかし、蛍光タンパク質はエバンスブルー色素に由来するバックグラウンド蛍光のため観察できなかった。このバックグラウンド蛍光は、サンプルを2時間洗浄することによってほぼ排除された。さらに、蛍光タンパク質は、サンプルを一晩放置した場合、より透明であった。したがって、純粋なカルコフルア白色溶液をこの研究に使用した。蛍光色素に由来するバックグラウンド蛍光は、観察前に異なるレーザー波長を使用してチェックする必要があります。

メソッドの制限
図3に示すように、CS処理の2週間後に厚さ130μmであったサンプルにおいて、深い蛍光タンパク質が観察された。これは、130μm厚のサンプルがCS処理の2週間後に透明になった図2Dに示された結果と一致する。しかしながら、図3Aに示すように、細胞質の自己蛍光は、2週間後の節において依然として顕著であり、CS処置の4週間後にのみ完全に除去された。ノードは細胞密度が高いため、自動蛍光物質を除去するのに長い時間が必要です。

図3Cに示すように、CS処理を行わない葉では深い蛍光タンパク質が観察されたが、同じ深さ20μmのノードおよびノード間よりも輝度が弱かった。CS処理の1週間後、蛍光タンパク質はより明るくなった。クロロフィルは葉に豊富に存在し、488nmの励起光を吸収します。また、オレンジ/赤色の自己蛍光があり、555nmレーザーを使用した蛍光タンパク質の観察を妨げる可能性があります。CS処理の1週間後、クロロフィルおよび他の自己蛍光物質を除去し、高いシグナル対ノイズ比画像を得た。

CS処理の2週間後および4週間後の組織で観察できた深さは有意に異ならなかったが、蛍光タンパク質は4週間後に弱く見えた(図3)。通常、蛍光タンパク質および自己蛍光の輝度は時間とともに弱まり、その結果、より高いシグナル対ノイズ比が生じる。そのため、蛍光タンパク質は、顕微鏡条件や画像処理を調整することで、より鮮明に観察することができる。これらの結果から、2週間のCS処理により、我々の試料条件を考えると、深部蛍光タンパク質の観察が容易になる可能性があると結論付けられた。しかし、自動蛍光物質を完全に排除したより鮮明な画像を観察するには4週間が必要です。

維管束やマルチアーム細胞などの強い自己蛍光を有する構造は、CSにおいて除去することができない。これらの構造を自家蛍光なしで観察するためには、時間ゲーティング法¹² を用いるか、または蛍光スペクトルの分光法によって画像を得る必要がある。2光子顕微鏡は、より厚い組織が観察される場合、より深い組織を観察するのにより適しているかもしれない。

既存および代替方法に対する本方法の意義
一般に、イネの内部構造は、クライオスタットまたはビブラトーム切片化のいずれかを用いて観察されてきた。クライオスタットは、観察を容易にする薄切片の準備に適していますが、サンプルの準備と装置の操作には時間がかかります。薄肉断面から元の3D構造を再構築することも困難です。ビブラトームは比較的操作が簡単で、厚いセクションの製造に適しています。しかし、標的組織の厚い切片は切断面の観察のみを可能にし、光が到達できない深い組織には許可しない。これらの理由から、いずれの方法も深部蛍光観察には適していない。

本研究では、既存の手法を組み合わせることで、CSの組織浸透が限られていることや共焦点顕微鏡下での物体分解能の悪さなど、イネの芽における深部蛍光観察における課題に取り組んだ。 図4に示すように、若穂から基部までの成体イネ苗条の深部組織に発現する蛍光タンパク質(OsMADS15-mOrange)を観察した。 図4D は、小花に着目し、3μm間隔で深い蛍光タンパク質を示す。CS処理の2週間後に−130μm深さを超える組織が観察されたが、CS処置なしで同じサイズおよび成長段階の花序において−27μm深さ内の組織のみが観察された(データは示さず)。現在の改良されたプロトコールは、遺伝子の過剰発現だけでなく、成体のイネの芽の深部組織における自然な遺伝子発現の観察も可能にした。

特定の研究分野における本方法の重要性と潜在的な応用
成体のイネの芽の深い蛍光観察を最適化するこのプロトコルは、不要な組織を切り取り、CSの透過性を高めることによって、硬い、厚い、または層状の組織の効率的な除去を可能にします。また、分析用試料の厚さを最適化し、通常は厚組織や不透明な組織を解くことができない共焦点レーザー顕微鏡を用いて、連続的かつ構造的な深部蛍光観察を可能にしました。

蛍光タンパク質は固定液およびPBS溶液中で経時的に分解するため、異なる成長段階のイネサンプルを比較することは困難です。しかしながら、CS中の蛍光タンパク質は、5ヶ月以上保存することができる¹。CSの貯蔵寿命が長いことは、イネの深い蛍光観察にとって大きな利点である。

近年、多くのクリアリング技術が開発され、内部構造を維持しながら深部組織を3Dで観察することが可能になりました。これらの技術は進化を続けており、新しい清算ソリューションが開発されています。その一例がiTOMEI¹⁴で、効率的なクロロフィル除去とより明るい蛍光検出を可能にします。もう1つの例は、クリアリング処理中の組織の褐変を防ぎ、透明に見えるようにするClearSeeAlpha¹⁵である。これらの清澄化溶液を本方法と組み合わせることは、より効率的かつ効果的な清算を可能にし得る。

今回の手法は、米だけでなく他の植物も深くイメージングすることで、新たな知見を得ることが期待されます。