תצפית פלואורסצנטית עמוקה בצילומי אורז באמצעות טכנולוגיית סליקה
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת ניקוי של יורה אורז, שקשה להכין לתצפיות מבניות פנימיות בגלל האופי הקשה, העבה או השכבתי של הרקמות. שיטה זו מאפשרת תצפיות פלואורסצנטיות מתמשכות ועמוקות, אפילו בצמחי אורז בוגרים.
Abstract
טכנולוגיית הסליקה שפותחה לאחרונה, המונעת אי-התאמות במקדם השבירה ומפחיתה את החומר הפלואורסצנטי האוטומטי, אפשרה לצפות ברקמות צמחים בתלת-ממד (3D) תוך שמירה על המבנים הפנימיים שלהן. באורז (Oryza sativa L.), צמח מודל מונוקוט וגידול בעל חשיבות עולמית, דווח על טכנולוגיית ניקוי באיברים שקל יחסית לצפות בהם, כמו השורשים והעלים. כמו כן דווח על יישומים של טכנולוגיית סליקה ב-shoot apical meristem (SAM) ובגבעולים, אך רק במידה מוגבלת בגלל החדירה הלקויה של תמיסת הסליקה (CS) לרקמות אלה. היעילות המוגבלת של תמיסות הניקוי ברקמות אלה מיוחסת לפלואורסצנטיות אוטומטית, עיבוי והתקשות של הרקמות בגבעול כאשר צרורות כלי הדם והאפידרמיס מתפתחים ושכבות של ה-SAM עם עלים דוחי מים. הפרוטוקול הנוכחי מדווח על אופטימיזציה של גישת ניקוי לתצפית רציפה ותלת-ממדית של ביטוי גנים מה-SAM/הפאניקה הצעירה לבסיס היורים במהלך הפיתוח. דגימות רקמה קבועות המבטאות כתב חלבון פלואורסצנטי נחתכו למקטעים באמצעות מיקרו-פרוסה רוטטת. כאשר הושג עובי מתאים, הוחל ה- CS. על ידי התמקדות ספציפית ברקמה המרכזית, קצב החדירה והאחידות של CS גדלו, והזמן הנדרש כדי להפוך את הרקמה לשקופה ירד. בנוסף, ניקוי המקטעים החתוכים איפשר תצפית על המבנה הפנימי של הצילום כולו מנקודת מבט מאקרו. לשיטה זו יש יישומים פוטנציאליים בהדמיה עמוקה של רקמות של מיני צמחים אחרים שקשה לנקות.
Introduction
טכנולוגיית הסליקה שפותחה לאחרונה אפשרה לצפות ברקמות העמוקות של הצמחים תוך שמירה על המבנה הפנימי שלהם 1,2,3. בצמח מודל הדיקוט Arabidopsis, מחקרים רבים על הדמיית חלבונים פלואורסצנטיים נערכו באמצעות טכנולוגיית ניקוי כדי למנוע אי התאמות במקדם השבירה ולהסיר חומרים פלואורסצנטיים אוטומטיים 4,5,6. אף על פי שהשימוש בטכנולוגיית ניקוי7,8 והדמיה תלת-ממדית ברזולוציה תאית9 דווחו באורז (Oryza sativa L.), צמח מודל מונוקוט וגידול בעל חשיבות עולמית, אלה מוגבלים לאיברים דקים ורכים יחסית, כגון שורשים, עלים ומרים אפיקליים (SAM), שקל לצפות בהם.
היורה הוא האיבר העיקרי המהווה את החלקים שמעל פני הקרקע של צמחים וסקולריים. באורז, יורה מורכבת מסדרה של “פיטומרים” בערימה אנכית, הכוללת ניצנים בבית השחי, עלים וגבעול10. בקצה היורה, ה-SAM מורכב מתאי גזע לא מובחנים במרכז. פיטומרים נוצרים על ידי התמיינות של תאים שמקורם ב- SAM. לאחר שהצמחים עוברים משלב הווגטטיבי לשלב הרבייה, גבעולי האורז מתארכים וה-SAM מתפרק לפאניקה צעירה10. שינוי התפתחותי זה מלווה בתנודות בביטוי של גנים שונים בגבעולים וב-SAM/Young panicles. כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס התמיינות התאים לרקמות שונות, חשוב לבחון באופן מבני את המורפולוגיה של התא ואת ביטוי הגנים ברקמות היורה הפנימיות. עם זאת, ההדמיה העמוקה של גבעולים (צמתים ואינטרנודות) בצילום מהווה אתגר בגלל חוסר היעילות של ניקוי פתרונות לחדירה לרקמה. הגבעולים עוברים באופן מיידי גידול מהיר בנפח מצמיחה לרוחב לאחר התמיינות מה-SAM. התקשות רקמות צומת האורז עקב עיבוי צרורות כלי הדם והקישור המורכב האופקי של אנסטומוזיס כלי הדם הנודלי, בנוסף לדחייה הגבוהה של יורה אורז, כולם תורמים להגבלת החדירה של CS בגבעולים10.
מחקר זה נועד לבחון שינויים בביטוי גנים ברקמות יורה אורז באמצעות טכניקת פלואורסצנציה עמוקה מבנית. עבודה זו מייעלת פרוטוקול ניקוי עבור אורז כדי לצפות באופן רציף בביטוי גנים מה-SAM/young panicle לבסיס במבנה תלת-ממדי, ולא על משטח שטוח, באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים של הפרוטוקול
השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם קיבוע וזמירה. ליורה אורז יש רקמות קשות, עבות או שכבות המגבילות את החדירה של הפתרון המתקן. כדי לשפר את החדירות של התמיסה המתקבעת, צד אחד של הרקמה היה מגולח דק בעת הדגימה, כפי שניתן לראות באיור 1E-F. בנוסף, טיפולי הוואקום חזרו על עצמם פעמיים בלחץ גבוה יותר. יתר על כן, הדגימות תוקנו בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס במקום הקיבוע הרגיל של שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
נקודת המפתח בשלב החיתוך היא לקבוע את עובי הרקמות כדי להיות מוכנות לצפות בחלבונים הפלואורסצנטיים תוך שמירה על המבנה הפנימי שלהם לאחר תקופה קצרה של טיפול במדעי המחשב. כפי שניתן לראות באיור 2C, דגימות בעובי 1 מ”מ, שנחתכו ביד דק ככל האפשר, הפכו לשקופות במספר מוגבל של רקמות גם לאחר 3 חודשים של טיפול במדעי המחשב. לכן, שלב הזמירה חיוני לתצפית פלואורסצנטית עמוקה על יורה אורז בוגרת. במחקר זה, הדגימות קוצצו לעובי של 130 מיקרומטר, כפי שמוצג באיור 2D. עובי 130 מיקרומטר איפשר לנקות את העלים לאחר שבוע של טיפול ב- CS ואת כל הדגימה לאחר שבועיים. במחקר זה נעשה שימוש ביורה אורז למבוגרים ב-9-10 LS. רקמות עבות אך רכות יותר מנבטי אורז צעירים יותר עשויות להתפנות מהר יותר עם הטיפול ב-CS. יש להתאים את עובי הדגימות ומשך הטיפול במדעי המחשב בהתאם לסוג הרקמה, מצבה ועובייה של המבנה התלת-ממדי שיש לראות.
שינויים ושיטות לפתרון בעיות
ה- CS זירז בקלות בטמפרטורות נמוכות. ה-CS המזורז אינו יכול לשמר את החלבונים הפלואורסצנטיים; לפיכך, יש להקפיד בעת אחסון הדגימות בטמפרטורה הנכונה. בנוסף, הן ל- CS והן לפתרון המקבע אין אפקט חיטוי; לכן, חלבונים פלואורסצנטיים יתפרקו אם יזדהמו. אורז שגדל באדמה נוטה לצמיחה פטרייתית; לפיכך, הדגימה והטיפול בדגימות חייבים להתבצע בזהירות כדי למנוע זיהום.
עודף צבעים פלואורסצנטיים במאגר עלול לגרום לפלואורסצנטיות הרקע ולהפריע לתצפיות מיקרוסקופיות. לדוגמה, בעבר נעשה שימוש בתמיסה לבנה מסוג calcofluor המכילה צבע כחול של אוונס. לאחר צביעה במשך שעה אחת ושטיפה במשך שעה אחת, החלבונים הפלואורסצנטיים של OsMADS15-mOrange נצפו באמצעות לייזר של 555 ננומטר. עם זאת, לא ניתן היה לצפות בחלבונים פלואורסצנטיים בגלל פלואורסצנטיות הרקע הנגזרת מהצבע הכחול של אוונס. פלואורסצנטיות הרקע הזו כמעט בוטלה על ידי שטיפת הדגימות במשך שעתיים. יתר על כן, החלבונים הפלואורסצנטיים היו ברורים יותר אם הדגימות הושארו למשך הלילה. לכן, תמיסה לבנה טהורה calcofluor שימש במחקר זה. יש לבדוק פלואורסצנטיות רקע הנגזרת מהצבע הפלואורסצנטי באמצעות אורכי גל לייזר שונים לפני התצפיות.
מגבלות השיטה
כפי שניתן לראות באיור 3, חלבונים פלואורסצנטיים עמוקים נצפו בדגימות בעובי של 130 מיקרומטר לאחר שבועיים של טיפול ב-CS. זה עולה בקנה אחד עם התוצאות המוצגות באיור 2D, שבו הדגימה בעובי 130 מיקרומטר הפכה לשקופה לאחר שבועיים של טיפול במדעי המחשב. עם זאת, כפי שניתן לראות באיור 3A, פלואורסצנציה אוטומטית של הציטופלסמה עדיין הורגשה בצמתים לאחר שבועיים והוסרה לחלוטין רק לאחר 4 שבועות של טיפול ב-CS. צמתים יש צפיפות תאים גבוהה, ולכן, דורשים זמן רב יותר כדי להסיר חומרים פלואורסצנטיים אוטומטיים.
כפי שניתן לראות באיור 3C, חלבונים פלואורסצנטיים עמוקים נצפו בעלים ללא טיפול CS, אך הבהירות הייתה חלשה יותר מזו שבצמתים ובאינטרנודות באותו עומק של 20 מיקרומטר. לאחר שבוע של טיפול במדעי המחשב, החלבונים הפלואורסצנטיים היו בהירים יותר. כלורופיל מצוי בשפע בעלים וסופג 488 ננומטר של אור עירור. יש להם גם פלואורסצנציה אוטומטית כתומה/אדומה, שיכולה להפריע לתצפית של חלבונים פלואורסצנטיים באמצעות לייזר של 555 ננומטר. לאחר שבוע של טיפול במדעי המחשב, הוסרו כלורופיל וחומרים פלואורסצנטיים אוטומטיים אחרים, וכתוצאה מכך נוצרו תמונות ביחס אות לרעש גבוה.
העומקים שניתן היה לראות ברקמות לאחר שבועיים ו-4 שבועות של טיפול ב-CS לא היו שונים באופן משמעותי, אם כי החלבונים הפלואורסצנטיים נראו חלשים יותר לאחר 4 שבועות (איור 3). בדרך כלל, הבהירות של חלבונים פלואורסצנטיים ופלואורסצנטיות אוטומטית נחלשת עם הזמן, וכתוצאה מכך יחס אות לרעש גבוה יותר. לכן, ניתן לצפות בחלבונים פלואורסצנטיים בצורה ברורה יותר על ידי התאמת התנאים המיקרוסקופיים ועיבוד התמונה. בהתבסס על תוצאות אלה, הגיע למסקנה כי שבועיים של טיפול ב- CS יכולים להקל על תצפית של חלבונים פלואורסצנטיים עמוקים, בהתחשב בתנאי הדגימה שלנו. עם זאת, נדרשים 4 שבועות כדי לצפות בתמונות ברורות יותר שאינן כוללות לחלוטין את החומרים הפלואורסצנטיים האוטומטיים.
מבנים עם אוטופלואורסצנציה חזקה, כגון צרורות כלי דם ותאים מרובי זרועות, אינם ניתנים לניקוי ב- CS. כדי לצפות במבנים אלה ללא אוטופלואורסצנציה, יש צורך להשתמש בשיטת זמן12 או לקבל תמונות על ידי ספקטרוסקופיה של ספקטרום הפלואורסצנציה. מיקרוסקופ דו-פוטוני עשוי להתאים יותר להתבוננות ברקמות עמוקות יותר אם נצפות רקמות עבות יותר.
משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות ואלטרנטיביות
באופן כללי, המבנים הפנימיים של צמחי אורז נצפו באמצעות חתך קריוסטאט או ויברטום. Cryostat מתאים להכנת קטעים דקים, המאפשרים תצפית קלה יותר, אבל הכנת הדגימות ואת הפעולה של הציוד הם זמן רב. שחזור המבנה התלת-ממדי המקורי מקטעים דקים הוא גם קשה. הוויברטום קל יחסית לתפעול ומתאים לייצור חתכים עבים. עם זאת, מקטעים עבים של רקמות מטרה מאפשרים רק תצפיות על פני השטח החתוכים ולא על רקמות עמוקות שהאור אינו יכול להגיע אליהן. מסיבות אלה, אף אחת מהשיטות אינה מתאימה לתצפיות פלואורסצנטיות עמוקות.
מחקר זה התמודד עם אתגרים בתצפית פלואורסצנטית עמוקה ביורה אורז, כגון החדירה המוגבלת לרקמות של CS ורזולוציית האובייקט הירודה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, על ידי שילוב שיטות קיימות. כפי שניתן לראות באיור 4, צפינו בחלבונים פלואורסצנטיים (OsMADS15-mOrange) המתבטאים ברקמות העמוקות של יורה אורז בוגר מהבהלה הצעירה לבסיס. איור 4D מתמקד בפלורט ומראה חלבונים פלואורסצנטיים עמוקים במרווחים של 3 מיקרומטר. רקמות מעל עומק של 130 מיקרומטר נצפו לאחר שבועיים של טיפול ב- CS, אך רק הרקמות בעומק של −27 מיקרומטר נצפו (נתונים לא מוצגים) בפלורט באותו גודל ובאותו שלב צמיחה ללא טיפול ב- CS. הפרוטוקול המשופר הנוכחי איפשר תצפית לא רק על ביטוי יתר של גנים אלא גם על ביטוי גנים טבעי ברקמות העמוקות של יורה אורז בוגר.
חשיבותה ויישומיה הפוטנציאליים של השיטה בתחומי מחקר ספציפיים
פרוטוקול זה, המייעל את התצפית הפלואורסצנטית העמוקה של יורה אורז בוגר, מאפשר ניקוי יעיל של רקמות קשות, עבות או שכבות על ידי חיתוך רקמות מיותרות והגברת החדירות של CS. בנוסף, עובי הדגימות לניתוח הותאם כדי לאפשר תצפית פלואורסצנטית עמוקה רציפה ומבנית באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי, שבדרך כלל אינו יכול לפתור רקמות עבות או אטומות.
קשה להשוות דגימות אורז בשלבי גדילה שונים מכיוון שהחלבונים הפלואורסצנטיים מתפרקים עם הזמן בתמיסות הקיבוע וה-PBS. עם זאת, חלבונים פלואורסצנטיים ב- CS ניתן לאחסן במשך יותר מ 5 חודשים1. חיי המדף הארוכים של מדעי המחשב הם יתרון משמעותי לתצפית פלואורסצנטית עמוקה באורז.
לאחרונה פותחו טכנולוגיות ניקוי רבות, המאפשרות לצפות ברקמות עמוקות בתלת מימד תוך שמירה על המבנים הפנימיים שלהן. טכנולוגיות אלה המשיכו להתפתח, ופותחו פתרונות סליקה חדשים. דוגמה טובה לכך היא iTOMEI14, המאפשרת סילוק יעיל של כלורופיל וזיהוי פלואורסצנטי בהיר יותר. דוגמה נוספת היא ClearSeeAlpha15, אשר מונע השחמה של רקמות במהלך ניקוי הטיפול וגורם להם להיראות שקופים. שילוב פתרונות סליקה אלו עם השיטה הנוכחית עשוי לאפשר סליקה יעילה ואפקטיבית יותר.
צפוי כי השיטה הנוכחית תסייע להשיג תובנות חדשות באמצעות הדמיה עמוקה של לא רק אורז אלא גם צמחים אחרים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר ר. טרדה, ד”ר ז. שימטאני וד”ר ה. טסוג’י על שסיפקו לנו את זרעי OsMADS15-mOrange; ד”ר ד. קוריהארה על שסיפק לנו את בניית NGCN; וד”ר ר. שים על עריכת כתב היד שלנו. עבודה זו מומנה על ידי JSPS KAKENHI (מספרי מענקים JP20H05912, 20H05778, 20H05779) ועל ידי תוכנית SATREPS (לא. JPMJSA1706) של JST ו- JICA.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11 (8), 0161107 (2016).
- Pandey, K. B., et al. Plant roots sense soil compaction through restricted ethylene diffusion. Science. 371 (6526), 276-280 (2021).
- Ejaza, M., Bencivenga, S., Tavaresa, R., Busha, M., Sablowski, R. ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX GENE 1 controls plant architecture by locally restricting environmental responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (17), (2021).
- Smetana, O., et al. High levels of auxin signalling define the stem-cell organizer of the vascular cambium. Nature. 565 (7740), 485-489 (2019).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11 (1), 23 (2018).
- Nagaki, K., Yamaji, N., Murata, M. ePro-ClearSee: A simple immunohistochemical method that does not require sectioning of plant samples. Scientific Reports. 7, 42203 (2017).
- Sato, M., Akashi, H., Sakamoto, Y., Matsunaga, S., Tsuji, H. Whole-tissue three-dimensional imaging of rice at single-cell resolution. International Journal of Molecular Sciences. 23 (1), 40 (2022).
- Matsuo, T., Hoshikawa, K. Science of the Rice Plant: Morphology. Food and Agriculture Policy Research Center. , (1993).
- Kobayashi, K., et al. Inflorescence meristem identity in rice is specified by overlapping functions of three AP1/FUL-Like MADS box genes and PAP2, a SEPALLATA MADS box gene. Plant Cell. 24 (5), 1848-1859 (2012).
- Tamaki, S., et al. FT-like proteins induce transposon silencing in the shoot apex during floral induction in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 901-910 (2015).
- Kodama, Y. Time gating of chloroplast autofluorescence allows clearer fluorescence imaging In Planta. PLoS One. 11 (3), 0152484 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Communications Biology. 5 (1), 12 (2022).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: Advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
