Tiefenfluoreszenzbeobachtung in Reistrieben mittels Clearing-Technologie
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Clearing-Technik für Reissprossen, die aufgrund der harten, dicken oder geschichteten Natur der Gewebe schwer auf interne Strukturbeobachtungen vorzubereiten sind. Diese Methode ermöglicht kontinuierliche und tiefe Fluoreszenzbeobachtungen, auch in erwachsenen Reispflanzen.
Abstract
Die kürzlich entwickelte Clearing-Technologie, die Brechungsindex-Fehlanpassungen eliminiert und autofluoreszierendes Material verringert, hat es ermöglicht, Pflanzengewebe in drei Dimensionen (3D) zu beobachten und gleichzeitig ihre inneren Strukturen zu erhalten. Bei Reis (Oryza sativa L.), einer einfarbigen Modellpflanze und einer weltweit wichtigen Kulturpflanze, wurde über Reinigungstechnologie in relativ leicht zu beobachtenden Organen wie Wurzeln und Blättern berichtet. Anwendungen der Clearing-Technologie in Sprossapikalmeristem (SAM) und Stängeln wurden ebenfalls berichtet, jedoch nur in begrenztem Maße wegen der schlechten Penetration der Clearing-Lösung (CS) in diesen Geweben. Die begrenzte Effizienz der Clearing-Lösungen in diesen Geweben wurde der Autofluoreszenz, Verdickung und Verhärtung der Gewebe im Stamm zugeschrieben, wenn sich die Gefäßbündel und die Epidermis entwickeln, und der Schichtung des SAM mit wasserabweisenden Blättern. Das vorliegende Protokoll berichtet über die Optimierung eines Clearing-Ansatzes zur kontinuierlichen und 3D-Beobachtung der Genexpression von der SAM/jungen Rispe bis zur Basis der Triebe während der Entwicklung. Fixierte Gewebeproben, die einen fluoreszierenden Proteinreporter exprimierten, wurden mit einem vibrierenden Mikroschneider in Schnitte geschnitten. Wenn eine geeignete Dicke erreicht war, wurde der CS aufgetragen. Durch die gezielte Ausrichtung auf das zentrale Gewebe erhöhte sich die Penetrationsrate und Gleichmäßigkeit des CS und die Zeit, die benötigt wurde, um das Gewebe transparent zu machen, nahm ab. Darüber hinaus ermöglichte die Räumung der beschnittenen Abschnitte die Beobachtung der inneren Struktur des gesamten Triebs aus einer Makroperspektive. Diese Methode hat potenzielle Anwendungen in der tiefen Bildgebung von Geweben anderer Pflanzenarten, die schwer zu klären sind.
Introduction
Die kürzlich entwickelte Clearing-Technologie hat es ermöglicht, das tiefe Gewebe von Pflanzen zu beobachten und gleichzeitig ihre innere Struktur zu erhalten 1,2,3. In der Dikotosen-Modellpflanze Arabidopsis wurden viele Studien zur fluoreszierenden Proteinbildgebung mit Clearing-Technologie durchgeführt, um Brechungsindex-Fehlanpassungen zu eliminieren und autofluoreszierende Materialien zu entfernen 4,5,6. Obwohl der Einsatz der Clearing-Technologie7,8 und der 3D-Bildgebung bei zellulärer Auflösung9 in Reis (Oryza sativa L.), einer monokotylen Modellpflanze und einer weltweit wichtigen Kulturpflanze, berichtet wurde, sind diese auf relativ dünne und weiche Organe wie Wurzeln, Blätter und Sprossapikalmeristem (SAM) beschränkt, die leicht zu beobachten sind.
Der Spross ist das Hauptorgan, das die oberirdischen Teile von Gefäßpflanzen bildet. In Reis bestehen Triebe aus einer Reihe vertikal gestapelter “Phytomere”, bestehend aus axillären Knospen, Blättern und dem Stamm10. An der Spitze des Sprosses besteht das SAM aus undifferenzierten Stammzellen in der Mitte. Phytomere werden durch die Differenzierung von Zellen gebildet, die aus dem SAM stammen. Nachdem die Pflanzen von der vegetativen in die Fortpflanzungsphase übergegangen sind, verlängern sich die Reisstiele und der SAM differenziert sich in jungeRispen 10. Diese Entwicklungsveränderung geht einher mit Schwankungen in der Expression verschiedener Gene in den Stängeln und SAM/jungen Rispen. Um die Mechanismen zu verstehen, die der Zelldifferenzierung in verschiedene Gewebe zugrunde liegen, ist es wichtig, die Zellmorphologie und Genexpression in internen Sprossgeweben strukturell zu beobachten. Die tiefe Bildgebung von Stängeln (Knoten und Internodien) im Spross stellt jedoch eine Herausforderung dar, da die Clearing-Lösungen ineffizient sind, um in das Gewebe einzudringen. Stängel erfahren nach der Differenzierung vom SAM sofort eine schnelle Volumenzunahme durch seitliches Wachstum. Die Verhärtung der Reisknotengewebe aufgrund der Verdickung der Gefäßbündel und die horizontale komplexe Verbindung der nodalen vaskulären Anastomose sowie die hohe Abstoßung der Reissprossen tragen dazu bei, das Eindringen des CS in Stängel10 zu begrenzen.
Diese Studie zielte darauf ab, Veränderungen in der Genexpression in Reistriebgeweben mit einer strukturellen Tiefenfluoreszenztechnik zu beobachten. Diese Arbeit optimiert ein Clearing-Protokoll für Reis, um die Genexpression von der SAM / jungen Rispe bis zur Basis kontinuierlich in einer 3D-Struktur und nicht auf einer flachen Oberfläche mit einem konfokalen Lasermikroskop zu beobachten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte des Protokolls
Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind Fixieren und Trimmen. Reissprossen haben harte, dicke oder geschichtete Gewebe, die das Eindringen der Fixierlösung begrenzen. Um die Durchlässigkeit der Fixierlösung zu verbessern, wurde eine Seite des Gewebes bei der Probenahme dünn rasiert, wie in Abbildung 1E-F gezeigt. Darüber hinaus wurden die Vakuumbehandlungen zweimal mit höherem Druck wiederholt. Darüber hinaus wurden die Proben über Nacht bei 4 °C anstelle der üblichen 2 h Fixierung bei 4 °C fixiert.
Der Schlüsselpunkt im Trimmschritt besteht darin, die Dicke der zu erstellenden Gewebe zu bestimmen, um die fluoreszierenden Proteine zu beobachten und gleichzeitig ihre innere Struktur nach einer kurzen CS-Behandlung zu erhalten. Wie in Abbildung 2C gezeigt, wurden die 1 mm dicken Proben, die so dünn wie möglich von Hand geschnitten wurden, auch nach 3 Monaten CS-Behandlung nur in einer begrenzten Anzahl von Geweben transparent. Daher ist der Schnittschritt essentiell für die Tiefenfluoreszenzbeobachtung von erwachsenen Reissprossen. In dieser Studie wurden die Proben auf eine Dicke von 130 μm zugeschnitten, wie in Abbildung 2D gezeigt. Die Dicke von 130 μm ermöglichte es, die Blätter nach 1 Woche CS-Behandlung und die gesamte Probe nach 2 Wochen zu reinigen. Erwachsene Reistriebe bei 9-10 LS wurden in dieser Studie verwendet. Dickes, aber weicheres Gewebe von jüngeren Reistrieben kann mit der CS-Behandlung schneller beseitigt werden. Die Dicke der Proben und die Dauer der CS-Behandlung sollten entsprechend dem Gewebetyp, dem Zustand und der Dicke der zu beobachtenden 3D-Struktur angepasst werden.
Änderungen und Methoden zur Fehlerbehebung
Der CS fiel bei niedrigen Temperaturen leicht aus. Das ausgefällte CS kann die fluoreszierenden Proteine nicht konservieren; Daher ist bei der Lagerung der Proben bei der richtigen Temperatur Vorsicht geboten. Darüber hinaus haben sowohl das CS als auch die fixierende Lösung keine antiseptische Wirkung; Daher werden fluoreszierende Proteine abgebaut, wenn sie kontaminiert werden. Bodenreis ist anfällig für Pilzwachstum; Daher müssen die Probenahme und Handhabung der Proben sorgfältig durchgeführt werden, um eine Kontamination zu vermeiden.
Überschüssige Fluoreszenzfarbstoffe im Puffer können Hintergrundfluoreszenz abgeben und mikroskopische Beobachtungen stören. Zum Beispiel wurde zuvor eine Calcofluor-Weißlösung verwendet, die Evansblau-Farbstoff enthält. Nach Färbung für 1 h und Waschen für 1 h wurden die fluoreszierenden Proteine von OsMADS15-mOrange mit einem 555 nm Laser beobachtet. Fluoreszierende Proteine konnten jedoch aufgrund der Hintergrundfluoreszenz, die von Evans-Blaufarbstoff abgeleitet wurde, nicht beobachtet werden. Diese Hintergrundfluoreszenz wurde durch Waschen der Proben für 2 h fast eliminiert. Darüber hinaus waren die fluoreszierenden Proteine klarer, wenn die Proben über Nacht belassen wurden. Daher wurde in dieser Studie eine reine Calcofluor-Weißlösung verwendet. Die vom Fluoreszenzfarbstoff abgeleitete Hintergrundfluoreszenz sollte vor Beobachtungen mit verschiedenen Laserwellenlängen überprüft werden.
Einschränkungen der Methode
Wie in Abbildung 3 gezeigt, wurden tiefe fluoreszierende Proteine in den Proben beobachtet, die nach 2 Wochen CS-Behandlung 130 μm dick waren. Dies stimmt mit den Ergebnissen in Abbildung 2D überein, wo die 130 μm dicke Probe nach 2 Wochen CS-Behandlung transparent wurde. Wie in Abbildung 3A gezeigt, war die Autofluoreszenz des Zytoplasmas in den Knoten jedoch nach 2 Wochen noch spürbar und wurde erst nach 4 Wochen CS-Behandlung vollständig entfernt. Knoten haben eine hohe Zelldichte und benötigen daher eine längere Zeit, um autofluoreszierende Materialien zu entfernen.
Wie in Abbildung 3C gezeigt, wurden tief fluoreszierende Proteine in den Blättern ohne CS-Behandlung beobachtet, aber die Helligkeit war schwächer als in den Knoten und Internodien in der gleichen Tiefe von 20 μm. Nach 1 Woche CS-Behandlung waren die fluoreszierenden Proteine heller. Chlorophyll ist in Blättern reichlich vorhanden und absorbiert 488 nm Anregungslicht. Sie haben auch eine orange/rote Autofluoreszenz, die die Beobachtung fluoreszierender Proteine mit einem 555-nm-Laser stören kann. Nach 1 Woche CS-Behandlung wurden Chlorophyll und andere autofluoreszierende Materialien entfernt, was zu Bildern mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis führte.
Die Tiefen, die nach 2 Wochen und 4 Wochen CS-Behandlung in Geweben beobachtet werden konnten, unterschieden sich nicht signifikant, obwohl die fluoreszierenden Proteine nach 4 Wochen schwächer erschienen (Abbildung 3). Normalerweise schwächt sich die Helligkeit fluoreszierender Proteine und die Autofluoreszenz mit der Zeit ab, was zu einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis führt. Daher können fluoreszierende Proteine durch Anpassung der mikroskopischen Bedingungen und Bildverarbeitung deutlicher beobachtet werden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der Schluss gezogen, dass eine 2-wöchige CS-Behandlung die Beobachtung von tief fluoreszierenden Proteinen unter unseren Probenbedingungen erleichtern könnte. Es werden jedoch 4 Wochen benötigt, um klarere Bilder zu beobachten, die die autofluoreszierenden Materialien vollständig ausschließen.
Strukturen mit starker Autofluoreszenz, wie Gefäßbündel und mehrarmige Zellen, können im CS nicht beseitigt werden. Um diese Strukturen ohne Autofluoreszenz zu beobachten, ist es notwendig, ein Time-Gating-Verfahren12 zu verwenden oder Bilder des Fluoreszenzspektrums durch Spektroskopie zu erhalten. Ein Zwei-Photonen-Mikroskop kann besser für die Beobachtung tieferer Gewebe geeignet sein, wenn dickere Gewebe beobachtet werden.
Bedeutung der Methode in Bezug auf bestehende und alternative Methoden
Im Allgemeinen wurden die inneren Strukturen von Reispflanzen entweder durch Kryostat- oder Vibratomschnitte beobachtet. Ein Kryostat eignet sich zur Vorbereitung von Dünnschliffen, die eine einfachere Beobachtung ermöglichen, aber die Vorbereitung der Proben und der Betrieb der Ausrüstung sind zeitaufwendig. Die ursprüngliche 3D-Struktur aus dünnen Abschnitten zu rekonstruieren, ist ebenfalls schwierig. Das Vibratom ist relativ einfach zu bedienen und für die Herstellung dicker Profile geeignet. Dicke Abschnitte des Zielgewebes erlauben jedoch nur Beobachtungen der Schnittoberfläche und nicht tiefes Gewebe, das Licht nicht erreichen kann. Aus diesen Gründen eignet sich keine der beiden Methoden für Tiefenfluoreszenzbeobachtungen.
Diese Studie befasste sich mit Herausforderungen bei der Tiefenfluoreszenzbeobachtung bei Reistrieben, wie der begrenzten Gewebepenetration des CS und der schlechten Objektauflösung unter einem konfokalen Mikroskop, indem bestehende Methoden kombiniert wurden. Wie in Abbildung 4 gezeigt, beobachteten wir fluoreszierende Proteine (OsMADS15-mOrange), die in den tiefen Geweben erwachsener Reistriebe von der jungen Rispe bis zur Basis exprimiert wurden. Abbildung 4D konzentriert sich auf das Blümchen und zeigt tief fluoreszierende Proteine in Abständen von 3 μm. Gewebe über −130 μm Tiefe wurden nach 2 Wochen CS-Behandlung beobachtet, aber nur die Gewebe innerhalb von −27 μm Tiefe wurden im Blüten in der gleichen Größe und Wachstumsphase ohne CS-Behandlung beobachtet (Daten nicht gezeigt). Das derzeit verbesserte Protokoll ermöglichte nicht nur die Beobachtung der Überexpression von Genen, sondern auch der natürlichen Genexpression in den tiefen Geweben erwachsener Reistriebe.
Bedeutung und Einsatzmöglichkeiten der Methode in spezifischen Forschungsbereichen
Dieses Protokoll, das die Tiefenfluoreszenzbeobachtung von erwachsenen Reissprossen optimiert, ermöglicht die effiziente Reinigung von hartem, dickem oder geschichtetem Gewebe, indem unnötiges Gewebe abgeschnitten und die Durchlässigkeit des CS erhöht wird. Darüber hinaus wurde die Dicke der Proben für die Analyse optimiert, um eine kontinuierliche und strukturelle Tiefenfluoreszenzbeobachtung mit einem konfokalen Lasermikroskop zu ermöglichen, das normalerweise dicke oder undurchsichtige Gewebe nicht auflösen kann.
Es ist schwierig, Reisproben in verschiedenen Wachstumsstadien zu vergleichen, da die fluoreszierenden Proteine im Laufe der Zeit in den Fixier- und PBS-Lösungen abgebaut werden. Die fluoreszierenden Proteine im CS können jedoch länger als 5 Monate gelagert werden1. Die lange Haltbarkeit des CS ist ein großer Vorteil für die Tiefenfluoreszenzbeobachtung in Reis.
In jüngster Zeit wurden viele Clearing-Technologien entwickelt, die es ermöglichen, tiefe Gewebe in 3D zu beobachten und gleichzeitig ihre inneren Strukturen zu erhalten. Diese Technologien haben sich weiterentwickelt und neue Clearing-Lösungen wurden entwickelt. Ein gutes Beispiel ist iTOMEI14, das eine effiziente Entfernung von Chlorophyll und eine hellere Fluoreszenzdetektion ermöglicht. Ein weiteres Beispiel ist ClearSeeAlpha15, das die Bräunung von Geweben während der Clearing-Behandlung verhindert und transparent erscheinen lässt. Die Kombination dieser Clearinglösungen mit der vorliegenden Methode kann ein effizienteres und effektiveres Clearing ermöglichen.
Es wird erwartet, dass die aktuelle Methode dazu beitragen wird, neue Erkenntnisse durch tiefe Bildgebung nicht nur von Reis, sondern auch von anderen Pflanzen zu gewinnen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. R. Terada, Dr. Z. Shimatani und Dr. H. Tsuji für die Bereitstellung der OsMADS15-mOrange-Samen; Dr. D. Kurihara für die Bereitstellung der NGCN-Konstruktion; und Dr. R. Shim für die Bearbeitung unseres Manuskripts. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI (Förderkennzeichen JP20H05912, 20H05778, 20H05779) und durch das SATREPS-Programm (Nr. JPMJSA1706) der JST und JICA.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
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