Diepe fluorescentiewaarneming in rijstscheuten via clearingtechnologie
Summary
Het huidige protocol beschrijft een opruimtechniek voor rijstscheuten, die moeilijk voor te bereiden zijn voor interne structurele waarnemingen vanwege de harde, dikke of gelaagde aard van de weefsels. Deze methode vergemakkelijkt continue en diepe fluorescentiewaarnemingen, zelfs in volwassen rijstplanten.
Abstract
De recent ontwikkelde clearingtechnologie die refractieve indexmismatches elimineert en auto-fluorescerend materiaal vermindert, heeft het mogelijk gemaakt om plantenweefsels in drie dimensies (3D) te observeren met behoud van hun interne structuren. In rijst (Oryza sativa L.), een eenzaadlobbige modelplant en een wereldwijd belangrijk gewas, is clearingtechnologie gemeld in organen die relatief gemakkelijk waarneembaar zijn, zoals de wortels en bladeren. Toepassingen van clearingtechnologie in shoot apicale meristeem (SAM) en stengels zijn ook gemeld, maar slechts in beperkte mate vanwege de slechte penetratie van de clearingoplossing (CS) in deze weefsels. De beperkte efficiëntie van de clearingoplossingen in deze weefsels is toegeschreven aan autofluorescentie, verdikking en verharding van de weefsels in de stengel naarmate de vasculaire bundels en epidermis zich ontwikkelen en gelaagdheid van de SAM met waterafstotende bladeren. Het huidige protocol rapporteert de optimalisatie van een clearingbenadering voor continue en 3D-observatie van genexpressie van de SAM / jonge pluim naar de basis van de scheuten tijdens de ontwikkeling. Vaste weefselmonsters die een fluorescerende eiwitverslaggever tot expressie brachten, werden in secties gesneden met behulp van een trillende microsnijmachine. Wanneer een geschikte dikte werd bereikt, werd de CS aangebracht. Door zich specifiek op het centrale weefsel te richten, nam de penetratiegraad en uniformiteit van het CS toe en nam de tijd die nodig was om het weefsel transparant te maken af. Bovendien maakte het opruimen van de bijgesneden secties de observatie van de interne structuur van de hele opname vanuit een macroperspectief mogelijk. Deze methode heeft potentiële toepassingen in diepe beeldvorming van weefsels van andere plantensoorten die moeilijk te verwijderen zijn.
Introduction
Recent ontwikkelde clearingtechnologie heeft het mogelijk gemaakt om de diepe weefsels van planten te observeren met behoud van hun interne structuur 1,2,3. In de dicot modelfabriek Arabidopsis zijn veel studies naar fluorescerende eiwitbeeldvorming uitgevoerd met behulp van clearingtechnologie om refractieve indexmismatches te elimineren en auto-fluorescerende materialen te verwijderen 4,5,6. Hoewel het gebruik van clearingtechnologie 7,8 en 3D-beeldvorming bij cellulaire resolutie9 is gemeld in rijst (Oryza sativa L.), een eenzaadlobbige modelplant en een wereldwijd belangrijk gewas, zijn deze beperkt tot relatief dunne en zachte organen, zoals wortels, bladeren en schiet apicale meristeem (SAM), die gemakkelijk waarneembaar zijn.
De scheut is het hoofdorgaan dat de bovengrondse delen van vaatplanten vormt. In rijst zijn scheuten samengesteld uit een reeks verticaal gestapelde “fytomeren”, bestaande uit okselknoppen, bladeren en de stengel10. Op het puntje van de shoot bestaat de SAM uit ongedifferentieerde stamcellen in het midden. Fytomeren worden gevormd door de differentiatie van cellen afgeleid van de SAM. Nadat de planten van de vegetatieve naar de voortplantingsfase zijn overgegaan, verlengen rijststengels en differentieert de SAM in jongepluimen 10. Deze ontwikkelingsverandering gaat gepaard met fluctuaties in de expressie van verschillende genen in de stengels en SAM/jonge pluimen. Om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan celdifferentiatie in verschillende weefsels, is het belangrijk om structureel de celmorfologie en genexpressie in interne scheutweefsels te observeren. De diepe beeldvorming van stengels (knopen en internodes) in de scheut vormt echter een uitdaging vanwege de inefficiëntie van clearingoplossingen om het weefsel te penetreren. Stengels ondergaan onmiddellijk een snelle volumetoename van laterale groei na differentiatie van de SAM. De verharding van de rijstknoopweefsels als gevolg van de verdikking van de vasculaire bundels en de horizontale complexe schakel van de nodale vasculaire anastomose, naast de hoge afstotendheid van rijstscheuten, dragen allemaal bij aan het beperken van de penetratie van de CS in stengels10.
Deze studie was gericht op het observeren van veranderingen in genexpressie in rijstscheutweefsels met behulp van een structurele diepe fluorescentietechniek. Dit werk optimaliseert een clearingprotocol voor rijst om continu genexpressie van de SAM / jonge pluim naar de basis te observeren in een 3D-structuur, in plaats van op een plat oppervlak, met behulp van een confocale lasermicroscoop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen van het protocol
De kritieke stappen in dit protocol zijn fixatie en trimmen. Rijstscheuten hebben harde, dikke of gelaagde weefsels die de penetratie van de fixatieve oplossing beperken. Om de permeabiliteit van de fixatieve oplossing te verbeteren, werd één kant van het weefsel bij de bemonstering dun geschoren, zoals weergegeven in figuur 1E-F. Daarnaast werden de vacuümbehandelingen tweemaal herhaald met een hogere druk. Bovendien werden de monsters ‘s nachts gefixeerd op 4 °C in plaats van de gebruikelijke 2 uur fixatie bij 4 °C.
Het belangrijkste punt in de trimstap is het bepalen van de dikte van de weefsels die moeten worden voorbereid om de fluorescerende eiwitten te observeren met behoud van hun interne structuur na een korte periode van CS-behandeling. Zoals te zien is in figuur 2C, werden de 1 mm dikke monsters, met de hand zo dun mogelijk bijgesneden, transparant in slechts een beperkt aantal weefsels, zelfs na 3 maanden CS-behandeling. Daarom is de trimstap essentieel voor diepe fluorescentiewaarneming van volwassen rijstscheuten. In deze studie werden de monsters bijgesneden tot een dikte van 130 μm, zoals weergegeven in figuur 2D. De dikte van 130 μm maakte het mogelijk om de bladeren na 1 week CS-behandeling en het hele monster na 2 weken te verwijderen. Volwassen rijstscheuten bij de 9-10 LS werden in deze studie gebruikt. Dikke maar zachtere weefsels van jongere rijstscheuten kunnen sneller worden verwijderd met de CS-behandeling. De dikte van de monsters en de duur van de CS-behandeling moeten worden aangepast aan het weefseltype, de conditie en de dikte van de te observeren 3D-structuur.
Methoden voor wijzigingen en probleemoplossing
De CS sloeg gemakkelijk neer bij lage temperaturen. Het neergeslagen CS kan de fluorescerende eiwitten niet behouden; daarom moet voorzichtig worden omgesprongen bij het bewaren van de monsters bij de juiste temperatuur. Bovendien hebben zowel de CS als de fixatieve oplossing geen antiseptisch effect; daarom zullen fluorescerende eiwitten worden afgebroken als ze besmet zijn. In de grond gekweekte rijst is gevoelig voor schimmelgroei; daarom moeten de bemonstering en hantering van monsters met zorg worden uitgevoerd om besmetting te voorkomen.
Overtollige fluorescerende kleurstoffen in de buffer kunnen achtergrondfluorescentie afgeven en microscopische waarnemingen verstoren. Zo werd eerder een calcofluorwitte oplossing met Evans blauwe kleurstof gebruikt. Na 1 uur kleuring en wassen gedurende 1 uur werden de fluorescerende eiwitten van OsMADS15-mOrange waargenomen met behulp van een 555 nm-laser. Fluorescerende eiwitten konden echter niet worden waargenomen vanwege de achtergrondfluorescentie afgeleid van Evans blauwe kleurstof. Deze achtergrondfluorescentie werd bijna geëlimineerd door de monsters gedurende 2 uur te wassen. Bovendien waren de fluorescerende eiwitten duidelijker als de monsters ‘s nachts werden achtergelaten. Daarom werd in deze studie een zuivere calcofluorwitte oplossing gebruikt. Achtergrondfluorescentie afgeleid van de fluorescerende kleurstof moet vóór waarnemingen worden gecontroleerd met behulp van verschillende lasergolflengten.
Beperkingen van de methode
Zoals te zien is in figuur 3, werden diepe fluorescerende eiwitten waargenomen in de monsters die 130 μm dik waren na 2 weken CS-behandeling. Dit komt overeen met de resultaten in figuur 2D, waar het 130 μm dikke monster transparant werd na 2 weken CS-behandeling. Zoals te zien is in figuur 3A, was autofluorescentie van het cytoplasma echter na 2 weken nog steeds merkbaar in de knopen en werd het pas volledig verwijderd na 4 weken CS-behandeling. Knooppunten hebben een hoge celdichtheid en hebben daarom een langere tijd nodig om automatisch fluorescerende materialen te verwijderen.
Zoals te zien is in figuur 3C, werden diepe fluorescerende eiwitten waargenomen in de bladeren zonder CS-behandeling, maar de helderheid was zwakker dan die in de knopen en internodes op dezelfde diepte van 20 μm. Na 1 week CS-behandeling waren de fluorescerende eiwitten helderder. Chlorofyl is overvloedig aanwezig in bladeren en absorbeert 488 nm excitatielicht. Ze hebben ook oranje / rode autofluorescentie, die de observatie van fluorescerende eiwitten met behulp van een 555 nm-laser kan verstoren. Na 1 week CS-behandeling werden chlorofyl en andere auto-fluorescerende materialen verwijderd, wat resulteerde in beelden met een hoge signaal-ruisverhouding.
De diepten die na 2 weken en 4 weken CS-behandeling in weefsels konden worden waargenomen, waren niet significant verschillend, hoewel de fluorescerende eiwitten na 4 weken zwakker leken (figuur 3). Normaal gesproken verzwakt de helderheid van fluorescerende eiwitten en autofluorescentie met de tijd, wat resulteert in een hogere signaal-ruisverhouding. Daarom kunnen fluorescerende eiwitten duidelijker worden waargenomen door de microscopische omstandigheden en beeldverwerking aan te passen. Op basis van deze resultaten werd geconcludeerd dat 2 weken CS-behandeling de observatie van diepe fluorescerende eiwitten zou kunnen vergemakkelijken, gezien onze monsteromstandigheden. Er zijn echter 4 weken nodig om duidelijkere beelden te observeren die de auto-fluorescerende materialen volledig uitsluiten.
Structuren met sterke autofluorescentie, zoals vaatbundels en meerarmcellen, kunnen niet worden opgeruimd in de CS. Om deze structuren zonder autofluorescentie te observeren, is het noodzakelijk om een time-gating-methode12 te gebruiken of om beelden te verkrijgen door spectroscopie van het fluorescentiespectrum. Een microscoop met twee fotonen kan geschikter zijn voor het observeren van diepere weefsels als dikkere weefsels worden waargenomen.
Betekenis van de methode ten opzichte van bestaande en alternatieve methoden
Over het algemeen zijn de interne structuren van rijstplanten waargenomen met behulp van cryostaat- of vibratomesecties. Een cryostaat is geschikt voor het voorbereiden van dunne secties, die gemakkelijker observatie mogelijk maken, maar de voorbereiding van de monsters en de werking van de apparatuur zijn tijdrovend. Het reconstrueren van de originele 3D-structuur uit dunne secties is ook moeilijk. Het vibratoom is relatief eenvoudig te bedienen en geschikt voor het produceren van dikke delen. Dikke delen van doelweefsels laten echter alleen waarnemingen van het snijoppervlak toe en geen diepe weefsels die licht niet kan bereiken. Om deze redenen is geen van beide methoden geschikt voor diepe fluorescentiewaarnemingen.
Deze studie richtte zich op uitdagingen bij diepe fluorescentiewaarneming in rijstscheuten, zoals de beperkte weefselpenetratie van de CS en de slechte objectresolutie onder een confocale microscoop, door bestaande methoden te combineren. Zoals te zien is in figuur 4, hebben we fluorescerende eiwitten (OsMADS15-mOrange) waargenomen die tot expressie komen in de diepe weefsels van volwassen rijstscheuten van de jonge pluim naar de basis. Figuur 4D richt zich op de roos en toont diepe fluorescerende eiwitten met intervallen van 3 μm. Weefsels met een diepte van meer dan -130 μm werden waargenomen na 2 weken CS-behandeling, maar alleen de weefsels binnen -27 μm diepte werden waargenomen (gegevens niet getoond) in de roos bij dezelfde grootte en groeifase zonder CS-behandeling. Het huidige verbeterde protocol maakte observatie mogelijk, niet alleen van overexpressie van genen, maar ook natuurlijke genexpressie in de diepe weefsels van volwassen rijstscheuten.
Belang en mogelijke toepassingen van de methode in specifieke onderzoeksgebieden
Dit protocol, dat de diepe fluorescentiewaarneming van volwassen rijstscheuten optimaliseert, maakt het efficiënt opruimen van harde, dikke of gelaagde weefsels mogelijk door onnodige weefsels af te snijden en de permeabiliteit van de CS te vergroten. Bovendien werd de dikte van de monsters voor analyse geoptimaliseerd om continue en structurele diepe fluorescentiewaarneming mogelijk te maken met behulp van een confocale lasermicroscoop, die normaal gesproken geen dikke of ondoorzichtige weefsels kan oplossen.
Het is moeilijk om rijstmonsters in verschillende groeistadia te vergelijken, omdat de fluorescerende eiwitten na verloop van tijd afbreken in de fixatieve en PBS-oplossingen. De fluorescerende eiwitten in de CS kunnen echter langer dan 5 maanden worden bewaard1. De lange houdbaarheid van de CS is een groot voordeel voor diepe fluorescentiewaarneming in rijst.
Onlangs zijn er veel clearingtechnologieën ontwikkeld, waardoor het mogelijk is om diepe weefsels in 3D te observeren met behoud van hun interne structuren. Deze technologieën zijn blijven evolueren en er zijn nieuwe clearingoplossingen ontwikkeld. Een goed voorbeeld is iTOMEI14, dat efficiënte chlorofylverwijdering en helderdere fluorescentiedetectie mogelijk maakt. Een ander voorbeeld is ClearSeeAlpha15, dat het bruin worden van weefsels tijdens de clearingbehandeling voorkomt en ze transparant laat lijken. Het combineren van deze clearingoplossingen met de huidige methode kan een efficiëntere en effectievere clearing mogelijk maken.
Verwacht wordt dat de huidige methode zal helpen nieuwe inzichten te verkrijgen door middel van diepe beeldvorming van niet alleen rijst, maar ook andere planten.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. R. Terada, Dr. Z. Shimatani en Dr. H. Tsuji voor het verstrekken van de OsMADS15-mOrange zaden; Dr. D. Kurihara voor het leveren van de NGCN-constructie; en Dr. R. Shim voor het redigeren van ons manuscript. Dit werk werd gefinancierd door JSPS KAKENHI (subsidienummers JP20H05912, 20H05778, 20H05779) en door het SATREPS-programma (nr. JPMJSA1706) van de JST en JICA.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11 (8), 0161107 (2016).
- Pandey, K. B., et al. Plant roots sense soil compaction through restricted ethylene diffusion. Science. 371 (6526), 276-280 (2021).
- Ejaza, M., Bencivenga, S., Tavaresa, R., Busha, M., Sablowski, R. ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX GENE 1 controls plant architecture by locally restricting environmental responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (17), (2021).
- Smetana, O., et al. High levels of auxin signalling define the stem-cell organizer of the vascular cambium. Nature. 565 (7740), 485-489 (2019).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11 (1), 23 (2018).
- Nagaki, K., Yamaji, N., Murata, M. ePro-ClearSee: A simple immunohistochemical method that does not require sectioning of plant samples. Scientific Reports. 7, 42203 (2017).
- Sato, M., Akashi, H., Sakamoto, Y., Matsunaga, S., Tsuji, H. Whole-tissue three-dimensional imaging of rice at single-cell resolution. International Journal of Molecular Sciences. 23 (1), 40 (2022).
- Matsuo, T., Hoshikawa, K. Science of the Rice Plant: Morphology. Food and Agriculture Policy Research Center. , (1993).
- Kobayashi, K., et al. Inflorescence meristem identity in rice is specified by overlapping functions of three AP1/FUL-Like MADS box genes and PAP2, a SEPALLATA MADS box gene. Plant Cell. 24 (5), 1848-1859 (2012).
- Tamaki, S., et al. FT-like proteins induce transposon silencing in the shoot apex during floral induction in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 901-910 (2015).
- Kodama, Y. Time gating of chloroplast autofluorescence allows clearer fluorescence imaging In Planta. PLoS One. 11 (3), 0152484 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Communications Biology. 5 (1), 12 (2022).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: Advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
