مراقبة التألق العميق في براعم الأرز عبر تقنية المقاصة
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية تطهير لبراعم الأرز ، والتي يصعب إعدادها للملاحظات الهيكلية الداخلية بسبب الطبيعة الصلبة أو السميكة أو الطبقات للأنسجة. تسهل هذه الطريقة ملاحظات التألق المستمرة والعميقة ، حتى في نباتات الأرز البالغة.
Abstract
جعلت تقنية المقاصة التي تم تطويرها مؤخرا والتي تقضي على عدم تطابق معامل الانكسار وتقلل من المواد الفلورية التلقائية من الممكن مراقبة الأنسجة النباتية في ثلاثة أبعاد (3D) مع الحفاظ على هياكلها الداخلية. في الأرز (Oryza sativa L.) ، وهو نبات نموذجي أحادي ومحصول مهم عالميا ، تم الإبلاغ عن تكنولوجيا التطهير في الأعضاء التي يسهل ملاحظتها نسبيا ، مثل الجذور والأوراق. كما تم الإبلاغ عن تطبيقات تكنولوجيا المقاصة في الميرستيم القمي (SAM) والسيقان ، ولكن بدرجة محدودة فقط بسبب ضعف تغلغل محلول المقاصة (CS) في هذه الأنسجة. تعزى الكفاءة المحدودة لحلول التطهير في هذه الأنسجة إلى التألق التلقائي ، وسماكة ، وتصلب الأنسجة في الجذع مع تطور حزم الأوعية الدموية والبشرة وطبقات SAM بأوراق طاردة للماء. يقدم هذا البروتوكول تقارير عن تحسين نهج المقاصة للمراقبة المستمرة و 3D للتعبير الجيني من SAM / الذعر الشاب إلى قاعدة البراعم أثناء التطوير. تم تقليم عينات الأنسجة الثابتة التي تعبر عن مراسل البروتين الفلوري إلى أقسام باستخدام قطاعة دقيقة تهتز. عندما تم تحقيق سمك مناسب ، تم تطبيق CS. من خلال استهداف الأنسجة المركزية على وجه التحديد ، زاد معدل اختراق وتوحيد CS ، وانخفض الوقت اللازم لجعل الأنسجة شفافة. بالإضافة إلى ذلك ، مكن مسح الأقسام المشذبة من مراقبة البنية الداخلية للتصوير بأكمله من منظور ماكرو. هذه الطريقة لها تطبيقات محتملة في التصوير العميق لأنسجة الأنواع النباتية الأخرى التي يصعب إزالتها.
Introduction
جعلت تقنية المقاصة التي تم تطويرها مؤخرا من الممكن مراقبة الأنسجة العميقة للنباتات مع الحفاظ على هيكلها الداخلي1،2،3. في مصنع نموذج الديكوت Arabidopsis ، أجريت العديد من الدراسات حول تصوير البروتين الفلوري باستخدام تقنية المقاصة للقضاء على عدم تطابق مؤشر الانكسار وإزالة المواد الفلورية التلقائية4،5،6. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن استخدام تقنية المقاصة7،8 والتصوير ثلاثي الأبعاد بدقة خلوية9 في الأرز (Oryza sativa L.) ، وهو نبات نموذجي أحادي ومحصول مهم عالميا ، إلا أنها تقتصر على الأعضاء الرقيقة والناعمة نسبيا ، مثل الجذور والأوراق و meristem القمي (SAM) ، والتي يسهل ملاحظتها.
تبادل لاطلاق النار هو العضو الرئيسي الذي يشكل الأجزاء فوق سطح الأرض من النباتات الوعائية. في الأرز ، تتكون البراعم من سلسلة من “phytomers” المكدسة عموديا ، والتي تضم براعم الإبط والأوراق والجذع10. عند طرف اللقطة ، يتكون SAM من خلايا جذعية غير متمايزة في المركز. تتشكل Phytomers من خلال تمايز الخلايا المشتقة من SAM. بعد أن تتحول النباتات من المرحلة الخضرية إلى المرحلة التناسلية ، تستطيل سيقان الأرز وتتمايز SAM إلى عناقيد شابة10. ويرافق هذا التغيير التنموي تقلبات في التعبير عن جينات مختلفة في السيقان و SAM / العناقيد الصغيرة. لفهم الآليات الكامنة وراء تمايز الخلايا إلى أنسجة مختلفة ، من المهم مراقبة مورفولوجيا الخلية والتعبير الجيني هيكليا في أنسجة البراعم الداخلية. ومع ذلك ، فإن التصوير العميق للسيقان (العقد والعقد الداخلية) في التصوير يمثل تحديا بسبب عدم كفاءة حلول التطهير لاختراق الأنسجة. تخضع السيقان على الفور لزيادة سريعة في الحجم من النمو الجانبي بعد التمايز عن SAM. إن تصلب أنسجة عقدة الأرز بسبب سماكة حزم الأوعية الدموية والرابط الأفقي المعقد لمفاغرة الأوعية الدموية العقدية ، بالإضافة إلى الصد العالي لبراعم الأرز ، كلها تساهم في الحد من تغلغل CS في السيقان10.
هدفت هذه الدراسة إلى ملاحظة التغيرات في التعبير الجيني في أنسجة براعم الأرز باستخدام تقنية التألق العميق الهيكلي. يعمل هذا العمل على تحسين بروتوكول تطهير للأرز لمراقبة التعبير الجيني باستمرار من SAM / الذعر الصغير إلى القاعدة في بنية 3D ، بدلا من السطح المستوي ، باستخدام مجهر ليزر متحد البؤرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة للبروتوكول
الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي التثبيت والتشذيب. تحتوي براعم الأرز على أنسجة صلبة أو سميكة أو طبقات تحد من تغلغل المحلول المثبت. لتحسين نفاذية المحلول المثبت ، تم حلق جانب واحد من الأنسجة بشكل رقيق عند أخذ العينات ، كما هو موضح في الشكل 1E-F. بالإضافة إلى ذلك ، تم تكرار علاجات الفراغ مرتين باستخدام ضغط أعلى. علاوة على ذلك ، تم تثبيت العينات بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية بدلا من التثبيت المعتاد لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
النقطة الرئيسية في خطوة التشذيب هي تحديد سمك الأنسجة التي يجب إعدادها لمراقبة البروتينات الفلورية مع الحفاظ على بنيتها الداخلية بعد فترة قصيرة من علاج CS. كما هو موضح في الشكل 2C ، أصبحت العينات التي يبلغ سمكها 1 مم ، والتي تم تقليمها يدويا بأكبر قدر ممكن من النحافة ، شفافة في عدد محدود فقط من الأنسجة حتى بعد 3 أشهر من علاج CS. لذلك ، فإن خطوة التشذيب ضرورية لمراقبة التألق العميق لبراعم الأرز البالغة. في هذه الدراسة ، تم تقليم العينات إلى سمك 130 ميكرومتر ، كما هو موضح في الشكل 2D. سمح سمك 130 ميكرومتر بإزالة الأوراق بعد أسبوع واحد من علاج CS والعينة بأكملها بعد أسبوعين . تم استخدام براعم الأرز البالغة في 9-10 LS في هذه الدراسة. يمكن إزالة الأنسجة السميكة ولكن الأكثر ليونة من براعم الأرز الأصغر سنا بشكل أسرع باستخدام علاج CS. يجب ضبط سمك العينات ومدة علاج CS وفقا لنوع الأنسجة وحالتها وسمك بنية 3D التي يجب ملاحظتها.
طرق التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
ترسب CS بسهولة في درجات حرارة منخفضة. لا يمكن ل CS المترسب الحفاظ على البروتينات الفلورية. وبالتالي ، يجب توخي الحذر عند تخزين العينات في درجة الحرارة المناسبة. بالإضافة إلى ذلك ، ليس لكل من CS والمحلول المثبت أي تأثير مطهر ؛ لذلك ، سوف تتحلل البروتينات الفلورية إذا كانت ملوثة. الأرز المزروع في التربة عرضة للنمو الفطري. وبالتالي، يجب أخذ العينات ومناولتها بعناية لتجنب التلوث.
قد تعطي الأصباغ الفلورية الزائدة في المخزن المؤقت تألقا في الخلفية وتتداخل مع الملاحظات المجهرية. على سبيل المثال ، تم استخدام محلول أبيض كالكوفلور يحتوي على صبغة إيفانز الزرقاء سابقا. بعد تلطيخ لمدة 1 ساعة والغسيل لمدة 1 ساعة ، لوحظت البروتينات الفلورية من OsMADS15-mOrange باستخدام ليزر 555 نانومتر. ومع ذلك ، لا يمكن ملاحظة البروتينات الفلورية بسبب التألق الخلفي المستمد من صبغة إيفانز الزرقاء. تم القضاء على هذا التألق الخلفية تقريبا عن طريق غسل العينات لمدة 2 ساعة. علاوة على ذلك ، كانت البروتينات الفلورية أكثر وضوحا إذا تركت العينات بين عشية وضحاها. لذلك ، تم استخدام محلول أبيض نقي كالكوفلور في هذه الدراسة. يجب التحقق من التألق الخلفي المشتق من صبغة الفلورسنت باستخدام أطوال موجية ليزر مختلفة قبل الملاحظات.
قيود الطريقة
كما هو موضح في الشكل 3 ، لوحظت بروتينات الفلورسنت العميقة في العينات التي كان سمكها 130 ميكرومتر بعد أسبوعين من علاج CS. وهذا يتفق مع النتائج الموضحة في الشكل 2D ، حيث أصبحت العينة التي يبلغ سمكها 130 ميكرومتر شفافة بعد أسبوعين من معالجة CS. ومع ذلك ، كما هو موضح في الشكل 3A ، كان التألق التلقائي للسيتوبلازم لا يزال ملحوظا في العقد بعد 2 أسابيع ولم تتم إزالته بالكامل إلا بعد 4 أسابيع من علاج CS. تحتوي العقد على كثافة خلايا عالية ، وبالتالي ، تتطلب وقتا أطول لإزالة مواد الفلورسنت التلقائي.
كما هو موضح في الشكل 3C ، لوحظت بروتينات الفلورسنت العميقة في الأوراق دون معالجة CS ، لكن السطوع كان أضعف من ذلك الموجود في العقد والعقد الداخلية على نفس عمق 20 ميكرومتر. بعد 1 أسبوع من علاج CS ، كانت البروتينات الفلورية أكثر إشراقا. الكلوروفيل وفير في الأوراق ويمتص 488 نانومتر من ضوء الإثارة. لديهم أيضا التألق التلقائي البرتقالي / الأحمر ، والذي يمكن أن يتداخل مع مراقبة البروتينات الفلورية باستخدام ليزر 555 نانومتر. بعد أسبوع 1 من معالجة CS ، تمت إزالة الكلوروفيل والمواد الفلورية التلقائية الأخرى ، مما أدى إلى صور عالية نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
لم تكن الأعماق التي يمكن ملاحظتها في الأنسجة بعد أسبوعين و 4 أسابيع من علاج CS مختلفة بشكل كبير ، على الرغم من أن البروتينات الفلورية بدت أضعف بعد 4 أسابيع (الشكل 3). عادة ، يضعف سطوع البروتينات الفلورية والتألق التلقائي مع مرور الوقت ، مما يؤدي إلى ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. لذلك ، يمكن ملاحظة البروتينات الفلورية بشكل أكثر وضوحا عن طريق ضبط الظروف المجهرية ومعالجة الصور. بناء على هذه النتائج ، تم التوصل إلى أن 2 أسابيع من علاج CS يمكن أن تسهل مراقبة البروتينات الفلورية العميقة ، بالنظر إلى ظروف عينتنا. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى 4 أسابيع لمراقبة صور أكثر وضوحا تستبعد تماما مواد الفلورسنت التلقائي.
لا يمكن مسح الهياكل ذات التألق الذاتي القوي ، مثل حزم الأوعية الدموية والخلايا متعددة الأذرع ، في CS. لمراقبة هذه الهياكل دون التألق الذاتي ، من الضروري استخدام طريقة بوابة الوقت12 أو الحصول على صور عن طريق التحليل الطيفي لطيف الفلوري. قد يكون المجهر ثنائي الفوتون أكثر ملاءمة لمراقبة الأنسجة العميقة إذا لوحظت أنسجة أكثر سمكا.
أهمية الطريقة فيما يتعلق بالطرق الحالية والبديلة
بشكل عام ، لوحظت الهياكل الداخلية لنباتات الأرز باستخدام إما cryostat أو التقسيم الاهتزازي. يعد cryostat مناسبا لإعداد أقسام رقيقة ، مما يسمح بمراقبة أسهل ، ولكن إعداد العينات وتشغيل المعدات يستغرق وقتا طويلا. إعادة بناء هيكل 3D الأصلي من أقسام رقيقة أمر صعب أيضا. الاهتزاز سهل التشغيل نسبيا ومناسب لإنتاج أقسام سميكة. ومع ذلك ، فإن الأجزاء السميكة من الأنسجة المستهدفة تسمح فقط بمراقبة السطح المقطوع وليس الأنسجة العميقة التي لا يمكن للضوء الوصول إليها. لهذه الأسباب ، لا تعد أي من الطريقتين مناسبتين لملاحظات التألق العميق.
تناولت هذه الدراسة التحديات في مراقبة التألق العميق في براعم الأرز ، مثل اختراق الأنسجة المحدود ل CS وضعف دقة الجسم تحت المجهر البؤري ، من خلال الجمع بين الطرق الحالية. كما هو موضح في الشكل 4 ، لاحظنا البروتينات الفلورية (OsMADS15-mOrange) المعبر عنها في الأنسجة العميقة لبراعم الأرز البالغة من الذعر الصغير إلى القاعدة. يركز الشكل 4D على الفلوريت ويظهر البروتينات الفلورية العميقة على فترات 3 ميكرومتر. لوحظت الأنسجة التي يزيد عمقها عن -130 ميكرومتر بعد أسبوعين من علاج CS ، ولكن تم ملاحظة الأنسجة فقط داخل عمق -27 ميكرومتر (البيانات غير معروضة) في الفلوريت بنفس الحجم ومرحلة النمو دون علاج CS. سمح البروتوكول المحسن الحالي بملاحظة ليس فقط الإفراط في التعبير عن الجينات ولكن أيضا التعبير الجيني الطبيعي في الأنسجة العميقة لبراعم الأرز البالغة.
أهمية والتطبيقات المحتملة للطريقة في مجالات بحثية محددة
يتيح هذا البروتوكول ، الذي يحسن مراقبة التألق العميق لبراعم الأرز البالغة ، التطهير الفعال للأنسجة الصلبة أو السميكة أو الطبقات عن طريق تقليم الأنسجة غير الضرورية وزيادة نفاذية CS. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين سمك العينات للتحليل للسماح بالمراقبة الفلورية العميقة المستمرة والهيكلية باستخدام مجهر ليزر متحد البؤرة ، والذي لا يمكنه عادة حل الأنسجة السميكة أو غير الشفافة.
من الصعب مقارنة عينات الأرز في مراحل نمو مختلفة لأن البروتينات الفلورية تتحلل بمرور الوقت في المحاليل المثبتة و PBS. ومع ذلك ، يمكن تخزين البروتينات الفلورية في CS لأكثر من 5 أشهر1. العمر الافتراضي الطويل ل CS هو ميزة رئيسية لمراقبة التألق العميق في الأرز.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير العديد من تقنيات المقاصة ، مما يجعل من الممكن مراقبة الأنسجة العميقة في 3D مع الحفاظ على هياكلها الداخلية. واستمرت هذه التكنولوجيات في التطور، وتم تطوير حلول جديدة للمقاصة. ومن الأمثلة الجيدة على ذلك iTOMEI14 ، الذي يتيح إزالة الكلوروفيل بكفاءة واكتشاف التألق الأكثر إشراقا. مثال آخر هو ClearSeeAlpha15 ، الذي يمنع تحمير الأنسجة أثناء العلاج الشفاف ويجعلها تبدو شفافة. وقد يتيح الجمع بين حلول المقاصة هذه والطريقة الحالية إجراء مقاصة أكثر كفاءة وفعالية.
ومن المتوقع أن تساعد الطريقة الحالية في اكتساب رؤى جديدة من خلال التصوير العميق ليس فقط للأرز ولكن أيضا للنباتات الأخرى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ر. تيرادا، والدكتور ز. شيماتاني، والدكتور ه. تسوجي على تزويدنا ببذور OsMADS15-mOrange؛ الدكتور د. كوريهارا لتزويدنا ببناء NGCN ؛ والدكتور ر. شيم لتحرير مخطوطتنا. تم تمويل هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI (أرقام المنح JP20H05912 و 20H05778 و 20H05779) وبرنامج SATREPS (لا. JPMJSA1706) من JST و JICA.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11 (8), 0161107 (2016).
- Pandey, K. B., et al. Plant roots sense soil compaction through restricted ethylene diffusion. Science. 371 (6526), 276-280 (2021).
- Ejaza, M., Bencivenga, S., Tavaresa, R., Busha, M., Sablowski, R. ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX GENE 1 controls plant architecture by locally restricting environmental responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (17), (2021).
- Smetana, O., et al. High levels of auxin signalling define the stem-cell organizer of the vascular cambium. Nature. 565 (7740), 485-489 (2019).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11 (1), 23 (2018).
- Nagaki, K., Yamaji, N., Murata, M. ePro-ClearSee: A simple immunohistochemical method that does not require sectioning of plant samples. Scientific Reports. 7, 42203 (2017).
- Sato, M., Akashi, H., Sakamoto, Y., Matsunaga, S., Tsuji, H. Whole-tissue three-dimensional imaging of rice at single-cell resolution. International Journal of Molecular Sciences. 23 (1), 40 (2022).
- Matsuo, T., Hoshikawa, K. Science of the Rice Plant: Morphology. Food and Agriculture Policy Research Center. , (1993).
- Kobayashi, K., et al. Inflorescence meristem identity in rice is specified by overlapping functions of three AP1/FUL-Like MADS box genes and PAP2, a SEPALLATA MADS box gene. Plant Cell. 24 (5), 1848-1859 (2012).
- Tamaki, S., et al. FT-like proteins induce transposon silencing in the shoot apex during floral induction in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 901-910 (2015).
- Kodama, Y. Time gating of chloroplast autofluorescence allows clearer fluorescence imaging In Planta. PLoS One. 11 (3), 0152484 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Communications Biology. 5 (1), 12 (2022).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: Advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
